Bu protokol, inhale zehirli kimyasal maddelere maruz kalma, hücre kültürlerinin bir yöntem göstermek için tasarlanmıştır. Farklı hava-sıvı arayüzü hava yolu epitel hücreleri (ALI) kültürler maruz kalmak, klor gibi zehirli gazlar hava yolu maruz eşsiz bir model sağlar. Bu yazıda; klor epitel hücrelerinin hava-sıvı arayüz kültürleri üzerinde maruz kalma ve kardiyomiyositlerde daldınlarak kültür etkisini tarif eder. In vitro maruz sistemleri önemli mekanik çalışmalar, daha sonra yeni terapötik maddelerin geliştirilmesi için yararlanılabilir yollarını belirlemek için izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zehirli İnhale Kimyasal Test in vitro Hücre Kültürü Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre kültürleri önce hayvan modellerinde kullanımı için terapötik maddeler, etkinliğini geliştirmek ve çalışma için vazgeçilmezdir. Biz de farklılaştırılmış insan solunum yolu epitel ve kalp kası hücrelerini modellemek için benzersiz bir yeteneğe sahiptir. Bu, normal olarak hücre yüzeyleri ile etkileşim ve su ile reaksiyona sokulması, ve daldırılmış kültürde etkilerini sınırlayarak üzerine çeşitli yan ürünler oluşturabilir, örneğin klor gibi toksik kimyasallar inhale, zararlı etkilerini incelemek için değerli bir araç olabilir. Hava-liqiuid arayüzü de farklılaştırılmış insan solunum yolu epitel hücre kültürleri kullanarak Bizim modelimiz bu sınırlama circumvents yanı sıra potansiyel zehirli solunan kimyasalların toksisite kritik mekanizmalarını değerlendirmek için bir fırsat sağlar. Biz membran bütünlüğünün kaybı gelişmiş, örneğin klor maruz kalma gibi toksik solunan kimyasal, kaspaz salınımı ve ölümü tarif. Bu yazıda, memeli kalp ve solunum yolu epitel c klor pozlama modellemek için yöntemler önermekkültür ve bu hücre tipleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için basit testler arşın.
Giriş
Toksik inhale kimyasal (TIC) maruz / klorin (Cl 2) gibi gazlar kazara maruz kalma, hem de kimyasal bir tehdit madde olarak potansiyel kullanımı devam eden bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Akciğerler birincil hedef olmasına rağmen, bu tür, kalp ve beyin gibi organlar da in vivo modeller genellikle tikler ikinci test toksisite için kullanılır. 1-3 etkilenmez, ancak toksisite değerlendirmesi için in vitro deneylerde maliyet etkin, daha basit, daha hızlı ve daha vardır. In in vitro modeller de in vivo değerlendirmek için zor olabilir aracı-hücre etkileşimlerinin kapsamlı araştırma için izin verir. Bu tür....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. Rat kardiyomiyosit Kültürler
- Tüm deneyler kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi, IACUC tarafından onaylanan protokoller altında yapıldı.
- Daha önce tarif edilen yöntemler kullanılarak 4 erkek sıçan kalplerinde (ventriküller) (240-260 g), sıçan kardiyomiyositlerde elde edilir. (100 mg / kg; ayak tutam yöntem ile anestezi teyit) Kısaca, pentobarbital intraperitonal enjeksiyonu ile hayvanlara anestezi ve daha sonra 10.0 ml, Krebs Ringer tamponu, pH 7.4 ihtiva eden 1 mM Ca2 + içine kalpleri çıkarın.
- Kan kaldırmak ve daha sonra% 0.02 proteaz ve% 0.06 kollajenaz A (5.0 ml / kalp) içeren bir Ca 2 + üc....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İlköğretim çubuk şekilli kardiyomiyositler laminin matrisler üzerine takmak ve (Şekil 1A ve inset) yaymak ve birleşen kültürlerin içine ayırt. Bu hücreler, bundan başka sarkomerik aktin ve SERCA2 ekspresyonu (Şekil 1B ve 1C) olarak karakterize edilmiştir. Sıçan kardiyomiyositler laminin kaplı membranların (Şekil 1D) üzerinde yetiştirilen hücreler üzerinde batık kültürler ve birleşen tabakalarının bozulmasına geniş hücre yuvarlama ve ölümüne neden 100 pp.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bir ciğerlerine zehirli bir kimyasal nefes zaman akut toksik risklerin en yaygın türü oluşur. Bu kimyasallar da hızlı bir şekilde kan alınmış olabilir ve bu, beyin ve kalp gibi diğer organları etkileyebilir. Hayvan modelleri kullanarak çeşitli maddelerin solunması toksisitesi okudu ve yaygın bildirilen, ancak mekanizmaları daha az anlaşılmıştır. Bu etkili tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir engeldir. In vitro maruziyet sistemlerinin bulunmaması mekanistik anlayış eksikliği arkasında bir birincil nedenidir........
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu araştırma karşı Programı, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), Müdürü Ofisi ve Çevre Sağlığı Bilimleri Ulusal Enstitüsü (NIEHS) Hibe sayısı U54 ES015678 (CWW) tarafından desteklenmektedir. SA da Çocuk hastanesinde Mines İşbirliği Pilot Ödülü # G0100394 ve Çocuk Hastanesi Colorado Araştırma Enstitüsü Pilot Ödülü # G0100471 Colorado / Colorado School tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Sıçanlar | Harlan Laboratuvarları | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Klor | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Kaspazı 3/7 kiti ve nbsp; | Promega | G8091 | |
| Epitelyal voltohmmetre ve çubuk elektrot | Dünya Hassas Aletler | EVOM ve STX2 | |
| Snapwell uçlar | Corning | 07-200-708 | |
| 70 mikron naylon hücre süzgeci | Corning | # 352360 | |
| Polisülfon biyomuhafaza odaları | BCU, Allentown Kafes Ekipmanları | BCU | |
| DMEM | Yaşam teknolojileri | 12491-015 | |
| Sarkomerik aktin antikoru | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antikoru | Afinite Biyoreaktifler, Altın, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antikoru | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa 488-konjuge ikincil antikor | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Karnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurin | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Kreatinin | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Tampon | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Proteaz | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Kollajenaz | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Laktasyonlu Zil çözeltisi | Abott Laboratuvarları | 7953 | |
| Eşek serumu | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, fosfat tamponlu salin | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| %4-15 SDS-PAGE jeller | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitroselüloz membran | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroksidaz tespit kiti | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Montaj ortamı, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodyum sitrat | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Kollajen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | FBS | ||
| Laminin | BD biyolojik bilimleri | ||
Kaynaklar
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
