Method Article

Doğrusal Amplifikasyon Dolayımlı PCR - Bilinmeyen Yollardan DNA Genetik Elemanları ve Karakterizasyonu lokalizasyonu

DOI:

10.3791/51543

⸱

June 25th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Oncology, National Center for Tumor Diseases (NCT) and German Cancer Research Center (DKFZ)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğrusal amplifikasyon aracılı (LAM)-PCR genomu içinde entegre viral vektörlerin tam konumlarını belirlemek için geliştirilen bir yöntemdir. Teknik gen tedavisi hastaların, vb roman vektör teknolojileri, T-hücresi çeşitlilik, kanser kök hücre modelleri, biyogüvenlik klonal dinamiklerini incelemek için üstün bir yöntem olarak gelişmiştir

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lineer amplifikasyon aracılı PCR (LAM-PCR), entegre vektör sistemleri ile gen terapisi ile tedavi edilen hastaların gen düzeltilmiş hücrelerinde hematopoezi incelemek için geliştirilmiştir. Retroviral vektörlerin kararlı entegrasyonu nedeniyle, entegrasyon bölgeleri, tek tek hücrelerin ve soylarının klonal kaderini incelemek için kullanılabilir. LAM-PCR ilk kez gen terapisi ile tedavi edilen hastalarda löseminin, komşu bir proto-onkogenin provirüs kaynaklı aşırı ekspresyonundan kaynaklandığına dair kanıt sağladı. Ters PCR ve ligasyon aracılı (LM)-PCR gibi mevcut yöntemlere kıyasla LAM-PCR'nin yüksek duyarlılığı ve özgüllüğü, sonraki reaksiyon adımlarının katı faz (manyetik boncuklar) üzerinde gerçekleştirilmesine izin veren biyotinile vektöre özgü primerler kullanılarak bir ilk ön amplifikasyon adımı (100 döngülük doğrusal PCR) ile elde edilir. LAM-PCR şu anda bilinen DNA'nın yakınında bulunan bilinmeyen DNA'yı tanımlamak için mevcut en hassas yöntemdir. Son zamanlarda, kısıtlama sindirimini atlatarak entegrasyon bölgelerinin geri alma yanlılığını ortadan kaldıran ve konakçı genomlarındaki provirüs konumlarının kapsamlı bir analizini sağlayan bir LAM-PCR varyantı geliştirilmiştir. Aşağıdaki protokol, entegre lentiviral vektöre bitişik hem 3' hem de 5'- dizilerin amplifikasyonunu adım adım açıklamaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğrusal amplifikasyon, PCR (LAM-PCR) aracılık ettiği herhangi bir kökenli bilinen DNA komşu bilinmeyen DNA yan belirlenmesi ve karakterize sağlar. Daha özel olarak, LAM-PCR, konakçı genomu içinde 1,2 (IS) viral vektör entegrasyon alanlarının yerini belirlemek üzere geliştirilmiştir. Retrovirüslere veya transpozonlar gibi Genetik elemanlar, bir (yarı-) rastgele bir şekilde 3-6 konakçı genom içine entegre genom. Pek çok durumda, bu gibi vektörler entegre tam konumunu bilmek belirleyicidir. LAM-PCR ligasyon aracılığında PCR 7 ve onun varyantları ya da ters PCR 8 gibi alternatif teknikler üstün olduğu kanıtlanmıştır. Bu yöntemin duyarlılığı ve sağlamlığı vektör genom birleşme ve amplifiye PCR ürünleri manyetik seçim başlangıç ​​amplifikasyon doğar. Bahsedilen alternatif yöntemler gibi, LAM-PCR IS 9-11 alma kapasiteli bir önyargı sokulması, kısıtlama enzimlerinin kullanımına dayanır. Bu durumda,IS repertuar (integrome) yalnızca bir alt kümesi, bir reaksiyonda tespit edilebilir. Bu eğilim kısıtlama enzimleri 9 en uygun kombinasyonları kullanılarak belirli bir örnek paralel analizi ile en aza indirilmiştir. Son zamanlarda, teknoloji bir varyant kısıtlama enzimlerinin kullanımı önlediği ve tek bir reaksiyonda 9,12 içinde bir numunenin ilgili genom analizleri sağlayan LAM-PCR (nrLAM-PCR) geliştirilmiştir sınırlayıcı olmayan adlandırılır.

Geçmişte, LAM-PCR neden olan retroviral gen terapisi klinik çalışmalarda 13-15 birkaç hastada lösemi sebebiyet veren IS tanımlamak için kullanılmıştır. O zamandan beri, LAM-PCR belirlemek için adapte edilmiş diğer entegre vektörleri (lentiviral vektörler, transpozonlar) ve pasif adeno-ilişkili vektörler (AAV) veya integraz-kusurlu lentiviral vektörleri (IDLV) gibi vektörleri entegre entegrasyonu biçimlerini belirlemek için her 16 -21. LAM-PCR Uygulamaları geniş yayılır: Gelenekselly, teknik yaygın gen tedavisi geçirmiş olan hastalarda gen modifiye edilmiş hücrelerin klonal çalışma bileşimi için ya da entegre davranışlarını 15,16,22-24 çözülmesine göre yeni vektör sistemleri Biogüvenlik değerlendirmek için kullanılır. Son zamanlarda, LAM-PCR bir IDLV yakalama deneyi 25 özgüllük ve tasarımcı nükleazların hedef dışı aktivitesinin belirlenmesinde etkin.

Ayrıca, LAM-PCR kolay bir organizmada zamanla transduse edilmiş hücrenin kaderini takip sağlar. Bu proto-onkogenlerin yanı sıra tümör baskılayıcı genleri tespit etmek ve aynı zamanda hematopoiezis veya kanser kök hücre biyolojisi 26-28 çalışma sağlar. Son fakat en az değil, LAM-PCR insanlarda 29 (ve yayınlanmamış veriler) T-hücre reseptör çeşitliliğini incelemek için adapte edilmiştir.

Teknolojinin iç güç tek nükleotid r ile komşu bilinmeyen DNA milyonlarca karakterize izin derin sıralama teknolojileri için yöntem bağlayarak güçlendirilirTüm genomların esolution. Aşağıdaki protokolde, biz adım adım amplifikasyon ve lentiviral vektör IS tanımlamak için örnekli bilinmeyen kuşatıcı DNA tanımlanması için. Protokolünde kullanılan oligonükleotidler,. Olan kaynak Ekstre edilen DNA, cDNA veya LAM-PCR ve nrLAM-PCR için DNA şablonu olarak kullanılabilir Tablo 1 'de listelenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağlayıcı Kaset 1. Hazırlama (LC)

  1. LC1 oligonükleotid (Tablo 1), (uygun kısıtlayıcı enzim çıkıntı ile Tablo 1) LC2 oligonükleotid, 110 ul Tris-HCl (100 mM, pH 7.5) ve 10 ul 250 mM MgCl2, 40 ul, 40 ul karıştırın.
  2. 5 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edildi ve reaksiyon yavaş yavaş oda sıcaklığına soğumaya bırakın. 300 ul H2O ilave edin ve bir santrifüj filtre üzerinde dsLinker-DNA konsantre edilir. 0.2 PCR tüplerine hazırlanan bağlayıcı kaset eluat ve kısım 10 ul 80 ul H2O ekleyin.

Vektör Genom EklemlerininTünelleme 2. Preamplification

  1. Analiz edilecek her bir örnek, 50 | il PCR reaksiyonu hazırlamak için.
    1. DNA örneklerinin konsantrasyonunu belirleyin. Pipet x ul (1-1000 ng LAM/100-1 nrLAM için, 000 ng), bir 0.2 ml PCR tüpüne DNA. DNA hacmi her bir örnek olarak ve RAN eşit olmalıdır0,5-25 | il ge.
    2. Tablo 2 'de tarif edildiği gibi PCR Master Mix karışım hazırlayın (- 50 x). 0.2 ml PCR tüplerine her bir DNA numunesi ile ana karışımı ul.
  2. PCR tamamlandıktan sonra., Tablo 2'de örneklendiği PCR koşulları kullanılarak Preamplify vektör genom bağlantıları her PCR tüpü ile tekrar işleme PCR programı için Taq Polimeraz ul 0.5 ekleyin. PCR ürünleri, -20 ° C'de 4 güne kadar ya da uzun bir süre için 4 ° C'de saklanabilir

PCR Ürünü 3. Manyetik Ayırma

  1. Manyetik Boncuk hazırlanması
    1. Pipet 20, bir 1.5 ml tüp içine streptavidin kaplı manyetik boncuklar ul (200 ug) ile, oda sıcaklığında, manyetik parçacık ayırıcı (MPS) 1 dakika boyunca maruz kalmaktadır. Süpernatant atın.
    2. MPS dan tüpünü çıkarın ve 40 ul PSB /% 0.1 BSA (pH 7.5) manyetik boncuklar tekrar süspansiyon. 1 dakika boyunca MPS maruz ve supernatant atın. Kez bu adımı yineleyin.
    3. Yıkama wi boncuk3 M LiCl çözeltisi 20 ul th (3 M LiCİ, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA) 1 dakika süre ile maruz MPS ve supernatant atın. 6 M LiCl çözeltisi (6 M LiCİ, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA), 50 ul içinde süspanse boncuk.
  2. Hazırlanmış manyetik boncuk tanelerin 50 ul aşama 2.2 'den tüm PCR reaksiyonu karıştırın. En az bir oda sıcaklığında 2 saat boyunca yatay bir çalkalayıcı (300 rpm) üzerinde inkübe edin. Bu adım, kaplı boncuklar (DNA-boncuk kompleksi) streptavidin biyotinile edilmiş PCR ürününün bağlanması sağlar. DNA boncuk kompleksi, gece boyunca çalkalayıcıda inkübe veya en fazla 4 gün süreyle 4 ° C'de saklanabilir.
  3. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksi Açığa, süpernatant kaldırmak ve 100 ul H2O içinde DNA-boncuk kompleksi tekrar süspansiyon Hemen LAM veya nrLAM için adım 5 için adım 4 ile devam edin.

4. LAM-Prosedürü

  1. Çift sicimli DNA (dsDNA) Synthesis (LAM için)
    1. 1 dakika ve dis için MPS adım 3.3 den DNA-Boncuk kompleksini Açığakart yüzer. 8.25 H2O ul, 1 ul 10x hexanucleotide tampon, 0.25 ul dNTP (10 mM) ve 0.5 ul (2 U) Klenow polimerazı ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
    2. H 2 O 90 ul ilave edilir ve 1 dakika süre ile maruz MPS. 100 ul H 2 O. süpernatant ve tekrar süspansiyon DNA-Boncuk kompleksini atın
  2. Kısıtlama Digest
    1. 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksini Açığa ve süpernatant atın. 8.5 ul 2 H, O, 1 ul 10x kısıtlayıcı enzim tamponu ve sınırlama enzimi, 0.5 ul ilave edin ve 1 saat boyunca bir reaksiyon inkübe edin. 4.1.2 adımı tekrarlayın.
      Not: kısıtlama enzimi üretici tarafından tavsiye edilen sıcaklıkta reaksiyonu inkübe edin. Herhangi bir kısıtlama alanı içinde mevcut ya da ilgi duyulan DNA amplifikasyon için kullanılan primer bağlanma yerinin alt olduğundan emin olun. Uygun kısıtlama enzimleri / sınırlama enzim kombinasyonlarının seçimi için 9'a bakın.
  3. Ligasyon ds Linker (LK)
    1. 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksini Açığa ve süpernatant atın. 5 ul 2 H, O, 1 ul 10x FastLink tamponu, 1 ul ATP (10 mM), aşama 1.2 'den 2 ul Bağlayıcı kaset ve 1 ul Fast-Link DNA Ligaz (2 U / ml) eklenir. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 4.1.2 adımı tekrarlayın.
  4. Sentezlenen dsDNA denatürasyonu
    1. 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksini Açığa ve süpernatant atın. 5 ul 0.1 N NaOH içinde süspanse DNA-Boncuk kompleksi. Yatay çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    2. 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksini ortaya çıkarmak ve yeni bir 1.5 ml tüp içeren yüzer preamplified vektör genom kavşak toplamak. Hemen -20 ° C'de adım 6 veya mağaza süpernatant ile devam

5. NrLAM-Prosedürü

  1. Tek şeritli bağlayıcının ligasyon (SSLC) (nrLAM için)
    1. MPS adım 3.3 den DNA-Boncuk kompleksini Açığa1 dakika ve atma süpernatant için. 6.5 ul H2O ekleme, 1 ul 10x reaksiyon tamponu, 0.5 ul CircLigase MnCI2 (50 mM), 0.5 ATP (1 mM) ul, 1 ul ssLinker oligonükleotid ve 0.5 ul CircLigase (100 U / ml). 1 saat boyunca 60 ° C'de inkübe edin.
    2. H 2 O 90 ul ilave edilir ve 1 dakika süre ile maruz MPS. Süpernatant atın ve 100 ul H 2 O DNA-Boncuk kompleksini yıkayın Yine 10 ul H 2 O 1 dakika, ıskarta süpernatant ve tekrar süspansiyon DNA-Boncuk kompleksi için MPS maruz

6.. Üstel Amplifikasyon I

  1. Analiz edilecek her bir örnek, 50 | il PCR reaksiyonu hazırlamak için.
    1. Pipet 2 ul şablonu (adım 4.4.2 (LAM) veya 5.1.2 (nrLAM)) DNA, bir 0.2 ml PCR tüp içine.
    2. Tablo 3 'de tarif edildiği gibi PCR master karışımı hazırlayın. Aşama 6.1.1 her örnek için ana karışımı 48 ul eklenir ve PCR tarafından vektör genom conditio kavşakları yükseltmekTablo 3'de örneklenen ns. PCR ürünleri, -20 ° C'de 4 güne kadar ya da uzun bir süre için 4 ° C'de saklanabilir

PCR Ürünü 7. Manyetik Ayırma

  1. 3.1.3 - 3.1.1 adımda de örneklendiği gibi, manyetik boncuklar hazırlayın. (LAM için), 20 ul ya da 6 M LiCl çözeltisi (6 M LiCİ, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA) içinde (nrLAM için), 50 ul içinde süspanse boncuk. 20 ul (LAM) veya hazırlanmış manyetik boncuklar ile adım 6.1.2 ikinci PCR reaksiyonunda (adım 7.1), 50 ul (nrLAM) karıştırınız ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca yatay bir çalkalayıcıda (300 rpm) üzerinde inkübe edilir. DNA boncuk kompleksi, gece boyunca çalkalayıcıda inkübe veya en fazla 4 gün süreyle 4 ° C'de saklanabilir.
  2. 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksini Açığa, süpernatant kaldırmak ve 100 ul H 2 O DNA-Boncuk kompleksini tekrar süspansiyon 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksini Açığa ve süpernatant atın.
  3. 20 ul (LAM) ya da 5 ul (nrLAM) 0.1 N NaOH içinde süspanse DNA-boncuk kompleksi. Incuyatay karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kesmek, 1 dakika boyunca MPS ortaya çıkarmak ve yeni bir 1.5 ml bir tüp içinde büyütülmüş DNA ihtiva eden süpernatan toplamak. Hemen -20 ° C'de adım 8.1 veya mağaza süpernatant ile devam

8. Üstel Amplifikasyon II

  1. Analiz edilecek her bir örnek, 50 | il PCR reaksiyonu hazırlamak için.
    1. Bir 0.2 ml PCR tüpüne (adım 7.3) Pipet 2 ul DNA şablonu.
    2. Tablo 4 'de tarif edildiği gibi PCR master karışımı hazırlayın. Aşama 8.1.1 her örnek için ana karışımı 48 ul ekleyin ve Tablo 4'te örneklenen PCR koşullarına göre vektör genom kavşaklar amplifiye. PCR ürünleri kadar 4 için 4 ° C'de saklanabilir -20 ° C'de gün veya uzun vadeli
  2. Görselleştirmek için (nr) LAM-PCR ürünleri,% 2 agaroz jeli üzerinde adım 8.1.2 elde edilen PCR ürünü yükü 10 ul. Bantlar görünür durumdaysa, yüksek çözünürlüklü jel üzerinde LAM-PCR ürünü 10 ul analiz. DİKKAT: Ethidium bromür mutajenik değildir. Çok dikkatli çalışmak ve her zaman uygun eldivenler giyin.

Yüksek sekanslama için 9. Hazırlanması

  1. (Nr) LAM-PCR ürünlerinin saflaştırılması
    1. Oda sıcaklığı AMPure XP Manyetik Boncuk 44 ul ile adım 8.1.2 40 ul PCR-Ürün karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve 2 dakika boyunca ilave MPS maruz.
    2. Süpernatant atın ve MPS 200 ul% 70 EtOH ile iki kez yıkayın.
    3. 30 ul H 2 O. süpernatant ve tekrar süspansiyon DNA-Boncuk kompleksini atın Taze 0.2 ml tüp 1 dakika ve transfer süpernatant inkübe. Saflaştınldı DNA konsantrasyonu tayin edilir.
  2. Fusionprimer PCR özel adaptörleri sıralanmasıyla eklemek.
    1. Analiz edilecek her bir örnek, 50 | il PCR reaksiyonu hazırlamak için.
    2. Bir 0.2 ml PCR tüpüne DNA Pipet x ul (40 ng). DNA hacmi her bir örnek olarak ve 0,5-25 ul aralığında eşit olmalıdır.
    3. Tablo 5'te tarif edildiği gibi PCR ana karışımı hazırlayın ekle (50 - x). Aşama 9.2.2 her örnek için ana karışımı ul ve Tablo 5'te PCR ürünleri örneklenen PCR koşullarının (nr) LAM-PCR ürünlerine Sequencing adaptörleri tanıtmak. -20 ° C'de 4 güne kadar ya da uzun bir süre için 4 ° C'de saklanabilir
    4. Fusionprimer-PCR ürünleri yüklemek bir% 2 agaroz jeli üzerinde adım 9.2.3 ikinci PCR ürününün 10 ul görselleştirmek için. 9.1.3 - 9.1.1 adımda tarif edildiği gibi geriye kalan PCR ürünü arındırın. Doğru Fusionprimer-PCR ürünleri konsantrasyon ve parça boyutu ölçmek için otomatik bir yüksek çözünürlüklü elektroforez aygıtı, adım 9.4 1 ul saflaştırılmış PCR ürünü analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LAM-PCR her bir birleşme için tanımlı bir parça boyutu ile birleşme vektör genom amplifikasyonu ile sonuçlanır. Tek tek PCR parçalarının büyüklüğü genomunda bilinen DNA'nın konumu ve en yakın sınır enzimi tanıma sitesi arasındaki mesafeye bağlıdır. Bu jel elektroforezi ile analiz örneğin örneklerde amplifiye birleşme çeşitliliğini görselleştirme sağlar., Sadece tek bir (monoklonal), birkaç (oligoklonal) ya da birden fazla (poliklonal) bantlar jel üzerinde mevcut ise. LAM-PCR sonuçları iyi yüksek çözünürlüklü el...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LAM-PCR tekniği, bilinen bir DNA bölgesine eşlik bilinmeyen DNA sekanslarının belirlenmesi izin verir. Çünkü bilinen DNA dizisinde spesifik primerler hibridize olan birleşme kısımlarının amplifikasyon kaynaklanan yüksek duyarlılığın, bu tek hücre seviyesine kadar da nadir kavşaklar yükseltmek ve tespit etmek mümkündür. Aksine, bir poliklonal durumda LAM-PCR tek bir reaksiyonda farklı birleşme binlerce amplifiye edebilir.

Bununla birlikte, sınırlama kullanımı nedeniyle integrome sadece bir al...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansman, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, Heidelberg/Mannheim Tümör Merkezi'nin hibesi), Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), Avrupa Komisyonu'nun VI. + VII. Çerçeve Programları (CONSERT, CLINIGENE ve PERSIST) tarafından sağlanmıştır. Videoda protokol tekniğini gösterdiği için Ina Kutschera'ya teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Taq DNA PolimerazGenaxxon Bioscience GmbHM3001.5000Alternatif Taq Polimerazlar kullanılabilir
PCR TamponuQiagen201203Bu tamponun kullanılması önerilir
dNTP-MixGenaxxon Bioscience GmbHM3015.4020veya diğer dNTP'ler
Oligonükleotidler (Primerler)MWG BiotechHPLC saflaştırılmış
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen11206D
PBSGibco14190-086%0.1 ağırlıkça/hacim BSA
6 M LiClRoth3739.110 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7.5USB Corporation 22637veya başka bir tedarikçi
EDTAApplichemA1103,0250veya başka bir tedarikçi
Klenow PolimerazRoche Diagnostics10104523001
Kısıtlama endonükleazNEBveya başka herhangi bir tedarikçi
Fast-Link DNA ligasyon kitiEpicentre BiotechnologiesLK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit,Epicentre BiotechnologiesCL4111K
Sigma-Aldrich72068veya başka bir tedarikçi
Agarose LE,Roche Diagnostics11685660001veya başka bir tedarikçi
TBE tamponuAmresco0658veya başka herhangi bir tedarikçi
Etidyum bromürApplichemA2273,0005Etidyum bromür mutajenik
100 bp DNA MerdiveniInvitrogen15628-050veya başka bir DNA merdiveni
20 mM NaClSigma-Aldrich71393-1Lveya başka bir tedarikçi
Magna-Sep Manyetik Parçacık Ayırıcı ve nbsp;1.5 ml Tüpler ile kullanım içinLife TechnologiesK158501
Magna-Sep Manyetik Parçacık AyırıcıLife TechnologiesK15869696 oyuklu plakalarla kullanım için
Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membranMilliporeUFC503096
PerfectBlue Jelsystem, Midi SPeqLab40-1515veya diğer elektroforez sistemleri 
profesyonel 96Biometra050-551veya diğer Thermocycler
Orbital çalkalayıcı KS 260 basicIKA2980200veya diğer yatay çalkalayıcı
PCR yumuşak tüpler 0,2 mlBiozym Scientific GmbH711082veya diğer 0,2 ml PCR tüpleri
1,5 ml tüplerEppendorf12682veya diğer 1,5 ml tüpler
Jel dokümantasyon sistemiPeqLabveya başka bir jel dokümantasyon sistemi
Nanodrop ND-1000 spektrofotometreThermo ScientificND-1000
Spreadex EL1200 prekast jelElchrom Scientific3497
Batık jel elektroforez cihazı SEA 2000 Elchrom Scientific2001E
2100 Elektroforez BiyoanalizörüAgilent Technologies G2939AA
Heksannükleotid karışımı Roche Diagnostics 11277081001 NaOH, , , , , , , , 96 oyuklu plakalar için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
  2. Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
  3. Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  4. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
  5. Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
  6. Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
  7. Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
  8. Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
  9. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
  10. Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
  11. Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
  12. Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
  13. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
  14. Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
  15. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
  16. Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
  17. Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
  18. Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
  19. Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
  20. Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
  21. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
  22. Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
  23. Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
  24. Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
  25. Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
  26. Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
  27. Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
  28. Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
  29. Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
  30. Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Linear Amplification Mediated PCRVector Genome JunctionsBiotinylated PrimersMagnetic BeadsSolid Phase AmplificationExponential AmplificationRestriction EnzymeLigation ReactionGel ElectrophoresisDeep Sequencing

Related Articles