Bu protokol, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü biyopsi dokusunda sitomegalovirüsün qPCR tespitini tanımlar, bu da hızlı, hassas, spesifik ve belirsiz hematoksilen ve eozin veya immünohistokimyasal boyama paternlerini yorumlamak için yararlıdır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi
Bu makalede
Özet
Özet
Bu şiddetli enfeksiyon geliştirmek için onların daha fazla risk göz önüne alındığında, gastrointestinal (Gİ) bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda yolu sitomegalovirüs (CMV) enfeksiyonu tespit etmek çok önemlidir. CMV enfeksiyonu tespiti için çok laboratuvar yöntemleri seroloji, viral kültürü ve moleküler yöntemler de dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. Genellikle, bu yöntemler CMV ile sistemik ilişkisini yansıtır ve özellikle lokal doku tutulumu tespit yok. Bu nedenle, GI bölgesindeki CMV enfeksiyonu tespiti sıklıkla biyopsi dokusu, geleneksel histoloji ile yapılır. Immünohistokimyasal (İHK) ile birlikte hematoksilen ve eozin (H & E) boyama Bu biyopsilerin incelenmesi dayanaklarını kalmıştır. H & E ve İHK bazen yorumlama zorlaştırır, atipik (şüpheli) boyanma sonuçlanabilir. Bu CMV kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) başarılı bir şekilde çok için formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) biyopsi dokusu üzerinde gerçekleştirilebilir gösterilmiştiryüksek duyarlılık ve özgüllük. Bu protokolün amacı, bir klinik laboratuvar ortamında FFPE biyopsi dokusunda CMV tespiti için qPCR testleri gerçekleştirmek için nasıl göstermektir. Bu yöntem, GI biyopsilerinde CMV için belirsiz boyanma durumlarda hastalar için büyük bir fayda olması muhtemeldir.
Giriş
Klinik örneklerde sitomegalovirüs (CMV) enfeksiyonu yorumlanması önem taşımaktadır. CMV herpesvirüslerinin betaherpesvirinae alt familyasının bir üyesidir. Diğer herpes virüsleri benzer şekilde, CMV, aktif viral replikasyon 1 eksikliği ile karakterize edilen bir biçimde ya da latent enfeksiyon kurma yeteneğine sahiptir. Virüsün reaktivasyonu hastalık belirtileri 2-4 eşlik edilebilir virionu salınımıyla karakterize aktif viral replikasyon, yol, stres veya diğer immünosupresyonun dönemlerinde oluşabilir. Gastrointestinal (GI) CMV hastalığı belirtileri sık sık karın ağrısı ve / veya kanlı dışkı 1 içerir.
Hist....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayı ile, elektronik laboratuvar veritabanı arama gastrointestinal (CMV) enfeksiyonu vakalarının histopatolojik tanı (GI) biyopsiler (hematoksilen temsil eden (FFPE) bloklar ve gömülü formalin fikse, parafin belirlemek için yapıldı eozin (H & E) ve / veya immünohistokimya (IHC)).
FFPE GI Biyopsi Doku 1. Doku İşleme
- Sitomegalovirüs (CMV) için FFPE GI biyopsi doku blokları toplayın kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR). Bu bloklar, oda sıcaklığında saklanır.
- Bloğun benzersiz kimlik numarası ile Pre-etiket 1.7 ml mikrofuj tüpler.
- Mikrotom çarkını kilitleyin.
- Kase....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
228 doku blok toplam şüpheli CMV İHK ile histoloji ve pozitif immünohistokimyasal (İHK), 18 dayanan 91 sitomegalovirüs (CMV) pozitif olgu oluşuyordu kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), ve 79 negatif kontroller ile test edildi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, CMV pozitif vaka tipik viral CMV kusurları (A) ve / veya pozitif boyanma IHC (B) göstermiştir olacaktır. Negatif kontroller hiçbir şüpheli histoloji veya İHK lekeleme 5 göstermiştir olurdu oy.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Pek çok laboratuvar yöntemleri seroloji, viral kültürü, moleküler viremi deneyleri, biyopsi histolojisi ve, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) biyopsi son gösterildiği gibi, moleküler deneyleri de dahil olmak üzere sitomegalovirüs tanısında (CMV) enfeksiyonu için kullanılabilir doku 5,6. Seroloji, tanı bir dayanak kez, sadece güvenilir bir pozlama belirler ve akut CMV enfeksiyonu 7 ile iyi bir korelasyon yoktur. Geleneksel ve erken antijene kabuk şişe hem de Viral kültür, ikinci .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz rakamlar hazırlanmasında emekleri için bu yazının hazırlanması ile ona yardım için Amy Thomasson ve Fredrik Skarstedt ve Ryan Christy kabul.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.7 ml Mikrofüj tüpleri | Costar | 3620 | |
| Tırtıklı forseps | Elektron Mikroskobu Hizmetleri | 62086-1S | Mikro Forseps MF-1 |
| Masaüstü santrifüjler (mikrofüj) | Eppendorf | 5424 | |
| Ksilen | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 galon |
| Etanol Fisher | Fisher | Scientific: ET108 | %96-100 |
| Mikrotom | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Doku Kiti | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Takviye Kiti | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler santrifüj | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Soğutma Bloğu | Roche | ||
| LightCycler Kapatma Aleti | Roche | 3357317 | |
| Renk Dengeleme Kiti | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μ l Kılcal | damarlar Roche | 1 909 339 | |
| Bıçaklar | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge düşük profilli |
Kaynaklar
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
