Bu protokolün amacı, Saccharomyces cerevisiae Nar1'in farklı kofaktörlerini tanımlamak için elektron paramanyetik rezonans (EPR) ile izlenen redoks titrasyonlarını kullanmaktır. Redoks titrasyonları, enzimler ve proteinlerdeki farklı redoks aktif kofaktörlerinin orta nokta potansiyellerini elde etmek için çok sağlam bir yol sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
EPR kofaktörleridir Redox Titrasyonu İzlenen
Bu makalede
Özet
Özet
Elektron Paramagnetik Rezonans (EPR) redoks titrasyonları güçlü bir yöntem proteinlerde kofaktörlerinin orta noktası potansiyelini belirlemek ve onların saptanabilir redoks devlet kofaktör tespit ve ölçmek için vardır izledi.
teknik, elektron transfer oranları hakkında bilgi sunmuyor gibi, yaklaşımlar, ancak çalışılan protein kofaktör kimliği ve redoks devlet kurmak yok, doğrudan elektrokimya (voltametri) tamamlayıcı. tekniği bir elektron paramanyetik rezonans (EPR) tespit kofaktör içeren herhangi bir proteine yaygın olarak uygulanmaktadır.
Tipik bir titrasyon 1-100 uM aralığındaki bir kofaktör konsantrasyonu ile 2 ml protein gerektirir. proteinin belirli bir potansiyelde örnek poise için bir kimyasal indirgeyici (sodyum ditionit) veya oksidanın (potasyum ferrisiyanür) ile titre edilmiştir. Bir platin tel ve bir Ag / AgCl referans elektrot volt bağlımetre protein çözeltisi potansiyelini ölçmek için. 13 birçok farklı redoks mediatörü bir dizi protein redoks kofaktörler ve elektrotlar arasındaki denge için kullanılır. Numuneler protein farklı redoks kofaktörler için karakteristik farklı potansiyelleri ve Elektron paramanyetik rezonans spektrumları, çizilir ölçülür. Örnek potansiyeli karşı sinyal yoğunluğu arsa kofaktör orta noktası potansiyelini belirlemek amacıyla Nernst denklemi kullanılarak analiz edilir.
Giriş
Bu gezegen, fotosentez, azot fiksasyonu ve solunum hayat sürdürme en temel kimyasal işlemler, organik ve inorganik redoks cofactors geniş bir yelpazede içeren büyük protein kompleksleri tarafından katalize edilir dikkat çekicidir. Tüm proteinlerin yaklaşık% 30 bir veya daha fazla metal kofaktörlerine içerdiğini tahmin edilmiştir. 1,2 belirlenmesi ve redoks kofaktör doğrudan elektrokimya (örneğin, protein filmi voltametri) veya redoks titrasyonlarını kullanılarak oluşturulabilir karakterize. İki teknikleri doğaları ve uygulanabilirliği tamamlayıcısıdır. Voltammetri bir elektrot yüzeyi ile reaksiyona girebilen orta potansiyelleri ve kofaktör elektron transferi kinetik hızlı belirlenmesi sunmaktadır. 3,4 Genellikle bu tür sitokrom-c veya ferrodoksin olarak elektron transfer proteinlerinin için iyi çalışır. Ve bazen bir elektrod yüzeyinde immobilize edilmiştir, daha karmaşık proteinler için de kullanılabilir. Detaylı bilgiprotein kofaktör doğası voltogramda kofaktör kimliğine ilişkin herhangi bir doğrudan bilgi vermez gibi, mevcut olmak zorundadır. Redoks titrasyonları yürütmek için daha zahmetli ve protein mg miktarlarda gerektirir. Ancak, orta potansiyeli ve kofaktör kimliği hakkında bilgi sunuyoruz. 5 Ayrıca, bir proteinin birden kofaktör izlenebilir bir tek Titrasyonda.
Bir redoks titrasyonu prensibi redoks aktif protein veya enzim kimyasal azaltılmış ya da oksitlenmiş olmasıdır. Amacıyla kofaktör kullanılan indirgeyici veya oksidan redoks arabulucular ile reaksiyona emin olmak için. Bu redoks mediatörleri, çözeltiye potansiyel ölçülebilir şekilde bir elektrot ile reaksiyona girer. Arabulucular bir redoks tampon olarak hareket ve protein ve elektrot cofactors arasında dengeye. Kimyasal olarak, istenen değere potansiyel poising sonra, bir numune aw için sıvı azot içinde dondurulmuş hızlı bir şekilde çekilir vespektroskopik teknikleri ile daha fazla analiz AIT. EPR spektroskopisi bu miktar para-manyetik metal merkezi ya da organik radikalleri ölçmek için kullanılabilir bu açıdan özellikle yararlıdır.
titrasyon iki yönde gerçekleştirilebilir: düşük yüksek ya da düşük yüksek orta olasılığı vardır. seçim çalışmanın altında kofaktörlerinin istikrar bağlıdır. Genellikle düşük potansiyelde başlayacak ve potansiyelini artırmak aşamalı oksidan eklemek akıllıca olacaktır. Bu oksidatif titrasyon denir ve burada tarif edilir. Burada Saccharomyces cerevisiae protein Nar1 içeren demir-sülfür küme redoks titrasyonu göstermektedir. Bu protein sitozolik demir-sülfür küme biyosentetik makineleri (CIA yolu) olarak, bir iskele protein olarak, büyük olasılıkla yer almaktadır. 6,7
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Kur ve Çözümleri 1. Hazırlık
- 100 mM Tris, pH 8.5, 250 mM NaCI ve% 10 gliserol içeren tampon çözeltisi hazırlayın. Argon püskürtülerek tampon havasını. Oksijensiz bir bölme içine tampon tanıtılması.
- Iki kısım halinde tampon bölün. Bir kısım (tampon A), 1 mM DL-ditiyotreitol eklemek ve 1 mM L-sistein (DTT, E 154,25 g / mol r). Diğer kısım (tampon B) indirgeyici maddeler içermez.
- Oksidan ve indirgeyici çözümleri hazırlayın. 1 ml 2 çözeltileridir 20 ve 200 mM potasyum ferrisiyanür Yap (FIC, E 329,26 g / mol r) ve anaerobik tampon B içinde sodyum ditiyonit (SD, E 174,11 g / mol r) olarak
- Aşağıdaki gibi arabulucu karışımı hazırlayın:
- B tampon aşağıdaki redoks mediatörleri ve 50 mM NaCI, her biri 160 uM ekleyin: N, N, N ', N' -tetrametil-p-phenylendediamine (TMPD, E 237,17 g / mol r, E '0 0,276 V) , 2,6-diklorofenol İndofenol(DCIP, E 290,08 g / mol, E r, Metilen mavisi (E, r '(0 0,055 V fenazin etosülfat 0 0,217 V) PES, E 334,4 g / mol, E r') 319,85 g / mol, bir E ', 0 0,011 V) resorufin (M r 235,17 g / mol, bir E ', 0 -0,051 V) Indigodisulphonate (M r 466,35 g / mol, bir E', 0 -0,125 V) 2-hidroksi-1,4-naphtaquinone ( M r 174,15 g / mol, bir E ', 0 -0,145 V) antrakinon-2-sülfonat (M r 328,28 g / mol, E' 0 -0,225 V) Phenosafranin (M r 322,8 g / mol, bir E ', 0 -0,252 V), Safranin O (M r 350,84 g / mol, bir E ', 0 -0,280 V) nötr kırmızı (M r 288,8 g / mol, E' 0 -0,340 V) Benzil violojen (M r 409,4 g / mol, e '0 -0,350 V) ve metil violojen (M 257,16 g / mol, E r' 0 -0,440 V).
- Arabulucu korumak için alüminyum folyo ile sarın şişeışıktan s.
- Hazırlama 10 mg / ml, S. cerevisiae strep etiketli Nar1 proteini tampon A Hızlı S. (181 uM, E 55.2 kDa r) E. S. cerevisiae Nar1 E. coli, bir strep etiketli protein olarak bir pET24A ifade vektörü kullanılmıştır. Strep-taktin kromatografi ortamı (IBA) ile bir anaerobik odasında proteini saflaştırmak ve Akta saflaştırıcısı (GE Healthcare) gibi bir protein saflaştırma sistemi kullanılarak saflaştırılması.
- Aşağıdaki gibi bir anaerobik odasında redoks titrasyonu kurulumunu hazırlayın:
- Ag / AgCl referans elektrot ve titrasyon kabına bir platin tel elektrot bağlayın. V. kadar mV ölçebilen bir voltmetre hem elektrotlar bağlayın
- Küçük bir karıştırma çubuğu yerleştirin.
- Bir manyetik karıştırıcı üzerinde titrasyon kabı yerleştirin.
- Tampon B, örneğin, 72 uM proteininin son konsantrasyonlara kadar 2 ml, ve her bir 38 uM aracı karışık çözeltisi ve protein çözeltisi ile titrasyon kabına doldurunArabulucu. Not: protein konsantrasyonu bağlı ve gerekli arabulucu ayarlanmalıdır üç çözümler miktarda konsantrasyonlar.
- 30 dakika karıştırın ve voltmetre açın.
- 10 Temiz kuvars cam tüpler EPR hazırlayın. Havasız odadan tüpler tanıtılması.
- Sıvı nitrojen ile bir küçük (200 ml yaklaşık) sıvı azot Dewar doldurun.
2. Redoks Titrasyonu gerçekleştirin
- Çözümün potansiyel stabil olana kadar bekleyin. Not: Pratikte bu potansiyel dakikada en az 1 mV sürüklenir anlamına gelir.
- Voltmetre tarafından verilen potansiyeli not edin.
- 200 ul ilk örnek çizin ve bir EPR tüpe enjekte.
- Bir lastik tıpa ile tüp kap ve havasız odadan tüpü çıkarın.
- Aşağıdaki gibi sıvı azot içinde tüp dondurma: Dikkat! Bu malzeme aksi durumda boru kıracak yavaşça yapılması gerekmektedir.
- İlk t eklemekSıvı azot içinde borunun ip.
- Bir tıslama sesi duyulabilir kadar bekleyin. Not: Bu 10 saniye kadar sürebilir.
- Örnek kısmı tamamen sular altında böylece yavaş yavaş tüp kalanını yerleştirin.
- -0.6 V çözeltinin potansiyelini düşürmek için titrasyon kabında çözeltiye, 2 mM SD bir çözelti küçük bir kısım 2/1 ul ekle
Not: fazla 10 ul ilave edilmesi gerekir ise, 20 mM çözeltisine geçer. Belirli bir potansiyel değere terazide tartılır çok zor olduğundan, voltmetre kaydedilen gerçek değerler yazılı ve titrasyon eğrisini oluşturmak için kullanılır. - Aşama 2,3-2,5 tarif edildiği gibi bir numune alın.
- Voltmetre tarafından verilen gerçek potansiyelini not edin.
- Potansiyel circa 50 mV arttı kadar oksidan ekleyin. 2 mM FIC çözüm küçük bir kısım 1-2 ul ekleyerek başlayın. Birden fazla 10 ul ilave edilmesi gerekir ise, 20 mM çözeltisine geçer.
- Ho aşağı Notw çözümleri çok eklenmiştir. Not: Bu titrasyon sırasında numune seyreltme için düzeltmek için gereklidir.
- Adım 2,3-2,5 tarif edildiği gibi bir numune alın.
- Voltmetre tarafından verilen gerçek potansiyelini not edin.
- Tekrar kaplı olan -0.6 V 0,2 kadar V potansiyel aralığında kadar 2.9 ve 2.12 adımları ve 10 EPR tüpler 200 ul her doldurulur.
Not: her çekilmesi ile hacmi azalır zamanda elektrot yerleştirme ayarlanması gerekir karıştırma müdahalesi olmadan çözelti ile iyi bir temas olabilir. Bu son örnek çekilmesi ve bu nedenle bu numunenin potansiyeli daha az doğru olabilir sonra potansiyel ölçmek zor olabilir. - EPR ölçümlerin gerçekleştirildiği kadar isteğe bağlı olarak, sıvı azot içinde dondurulmuş EPR örnekleri saklayın.
EPR Spektroskopisi ve Veri Analizi Kullanılarak 3. Ölçü Titrasyon Örnekleri
- Farklı Rekor EPR spektrumlarıtitrasyon örnekleri şöyle:
- <10 -5 çubuğuna kuvars kriyostat tahliye etmek için yüksek vakum pompası kullanma.
- EPR mıknatısın su soğutma açın. EPR boşluğu yoluyla bir kuru hava akışını açın.
- Mıknatıs güç kaynağı ve EPR bilgisayarda açın.
- Bir frekans kalibrasyon programını çalıştırın. EPR ölçüm parametrelerini ayarlayın. Sıvı helyum termosa Kriyostat bağlayın. 9-16 K. boşluğu soğutun
- Boşluğunda EPR örnek tanıtılması. EPR spektrumu kaydedin.
- Farklı EPR türlerin belirlenmesi ve sinyalleri ölçmek için en iyi spektrumları kullanın. Harici bakır standart çözüm spektrumu ile spektrumları ve karşılaştırma çift entegrasyonu ile EPR kantifikasyonunu Başarmak 10 mM CuSO / 2 M NaClO 4 4/10 mM HCl. 8
- Aşağıdaki gibi titrasyon eğrisini yapın:
- Para için karakteristik olan bir g-değeri ile EPR sinyali genliği çizilirpotansiyeline karşı ilgi manyetik türleri.
- Bir spin için EPR sinyal genlik ölçeği değiştirme / molekül ölçeği adım 3.2 EPR kantifikasyonunu kullanarak.
- Oksitleyici ya da indirgeyici ajan ilave nedeniyle meydana seyreltme için, her numunenin bir sinyal genliğini düzeltin.
- Ag / AgCl referans elektrot orta noktası potansiyeli potansiyelini düzeltin.
Not: (doymuş KCI) ile Ag / AgCİ referans elektrot, 25 ° C'de standart bir hidrojen elektrotundan (SHE) karşı 0,194 V bir orta bir potansiyele sahiptir. Voltmetre potansiyel -0,6 V dolaylarında okur, bu nedenle, SHE referans potansiyel -0.4 V olduğunu
- Aşağıdaki gibi Nernst denklemi sinyali Fit:
Bir türleri için bu azaltılmış durumda paramanyetiktir:
Paramanyetik o olan bir tür içinxidized durumu:
Bir ara madde halinde paramanyetik bir türleri için:
Bu denklemler bir elektron transfer edilir ki içinde redoks reaksiyonları için de geçerlidir, yani, n = 1.
Volt E = potansiyeli
E m = Volt orta potansiyeli
F = Faraday sabiti = 96.480 ° C · mol -1
R = Gaz sabiti = 8,314 J · K -1 · mol -1
Kelvin T = Sıcaklık
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Nar1: Saccharomyces cerevisiae 'den bir protein Nar1 ihtiva eden bir demir-sülfür kümesinin titrasyon üç farklı kofaktörler tanımlanması sonucunu bir [3FE-4S] küme, bir [4Fe-4S] kümesi ve bir tek çekirdekli Fe merkezi (Şekil 1) . EPR sinyaller, G-değerleri ile karakterize edilir: için, [3FE-4S] + g Z 2.01 g çapraz 2.00 (Şekil 1B); için, [4Fe-4S] + g z 2.02 g y 1.93 x g 1,82 (Şekil C)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
13 redoks mediatör dizisi -0,45 gelen SHE karşı 0,3 V (Tablo 1 ve Şekil 3) aralığında çözelti içinde bir redoks denge sağlar. Peki yukarıda ve bu potansiyellerin altındaki tüm arabulucular ya tamamen azalır veya tamamen okside ve dolayısıyla protein redoks aktif merkezleri ile daha fazla dengeleme oluşabilir edilmektedir. Bazen redoks titrasyonları sadece dar bir aralık 11 ölçülecek izin, sadece iki ya da üç aracılarla gerçekleştirilen literatürde olduğu gibi bu, önemli bir k...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu eser mali Kimyasal Tasarım (NRSC-Kataliz) tarafından Kontrollü Hollanda Ulusal Araştırma Okulu Kombinasyon, Catalysis bir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Dr HY Steensma ve Leiden Üniversitesi'nden Dr. GPH van Heusden S. rekombinant ifadesi ile desteklerinden dolayı kabul edilir S. cerevisiae Nar1.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Referans elektrot (Ag/AgCl) | Radyometre | ||
| Kimyasalları | Sigma-Aldrich | ||
| EPR spektrometresi | Bruker | ||
| N,N,N',N' -tetrametil-p-fenilendiamin (TMPD) ve orta nokta; (HCl)2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-diklorofenol indofenol (DCIP), sodyum tuzu | 620-45-1 | ||
| Fenazin etosülfat (PES) | 10510-77-7 | ||
| Metilen mavisi | 122965-43-9 | ||
| Resorufin, sodyum tuzu | 34994-50-8 | ||
| İndigodisülfonat (indigo karmin) | 860-22-0 | ||
| 2-hidroksi-1,4-naftakinon | 83-72-7 | ||
| Antrakinon-2-sülfonat Na+ H2O | 153277-35-1 | ||
| Fenosafranin | 81-93-6 | ||
| Safranin O | 477-73-6 | ||
| Nötr kırmızı | 553-24-2 | ||
| Benzil viologen | 1102-19-8 | ||
| Metil viologen | 1910-42-5 |
Kaynaklar
- Lippard, S. J., Berg, J. M. Principles of Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. (1994).
- Bertini, I. Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. 611(1994).
- Leger, C., et al. Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms. Biochemistry. 42, 8653-8662 (2003).
- Hagen, W. R. Direct Electron Transfer of Redox Proteins at the Bare Glassy Carbon Electrode. Eur. J. Biochem. 182, 523-530 (1989).
- Pierik, A. J., et al. Redox Properties of the Iron-Sulfur Clusters in Activated Fe-Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). Eur. J. Biochem. 209, 63-72 (1992).
- Balk, J., Pierik, A. J., Netz, D. J., Muhlenhoff, U., Lill, R. The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins. EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).
- Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation. J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).
- Aasa, R., Vänngård, T. EPR Signal Intensity and Powder Shapes. A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).
- Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz,, J, D., Mühlenhoff, U., Lill, R. Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis. Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).
- Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. Ferene - a new spectrophotometric reagent for iron. Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).
- Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme. Biochemistry. 31, 10331-10337 (1992).
- Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch,, Landa, I., Hagen, W. R. Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation. FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).
- Tadesse, M. A., D'Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates. Organic & biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
