Yenidoğan farelerin ekstrahepatik safra kanallarından cholangiocytes izole etmek için bir teknik tarif edilir. Kanallar titizlikle kesilir, ve daha sonra hücreler, kalın kolojen jeller büyümesinin ile izole edilir. Bu yöntem, ekstrahepatik safra kanalı geliştirme ve patolojiyi eğitim için yararlı bir araç sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yenidoğan Ekstrahepatik Cholangiocytes İzolasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Karaciğer içi ve ekstrahepatik safra kanalları gelişimsel farklıdır ve farklı şekilde bazı hastalıklar etkilenebilir. Ancak, intra ve ekstrahepatik cholangiocytes ve yenidoğan ve yetişkin hücreleri arasındaki arasındaki farklar, iyi anlaşılmış değildir.
Intrahepatik safra kanallarının ikinci cholangiocytes izolasyonu için yöntemler de 1-4 kurulmuştur. Bu ayrı cholangiocyte popülasyonları arasındaki farklılıkları anlamak ve ekstrahepatik kanalları hedef gibi görünür, safra atrezi gibi hastalıklara okuyan büyük fayda olacağını, ancak özellikle Yenidoğandan ekstrahepatik duktal hücrelerin izolasyonu, henüz tarif edilmemiştir. Neonatal ve yetişkin fare hem de ekstra-hepatik safra kanalı hücreleri izole etmek için optimize edilmiş bir teknik aşağıda tarif edilmiştir. Bu teknik, fibroblastlar gibi mezenkimal hücrelerden en az kirlenme ile saf bir hücre popülasyonu elde edilir.
Bu metod titiz diseksiyon ve yağ ve fibroblast tabakaları kaldırmak için kazıma tarafından takip ekstrahepatik kanalları ve safra kesesi, çıkarılması dayanmaktadır. Yapılar deneysel kullanım için daha sonra tripsinize edilebilir ve kaplama yeniden tek katmanlarda cholangiocytes arasında gelişimini sağlamak için yaklaşık 3 hafta boyunca kollajen ve kültüre kalın tabakalar gömülür.
Giriş
Intra ve ekstrahepatik cholangiocytes kökeni ve gelişim belirgin farklıdır. Karaciğer ventral foregut endoderm 5 bir divertikül gelişir. Kranial bölge intrahepatik safra yolları 5 üretirken divertikül kaudal bölge, ekstrahepatik safra yolları oluşturur. Intrahepatik kanal cholangiocytes peri portal bölgelerde 6'da duktal plaka çevresinde projenitör hücrelerinden türetilmiştir. Bu hücreler hepatositler veya cholangiocytes 6 ya da içine ayırt etmek yeteneğine sahip. Bu cholangiopathies özellikle cholangiocytes bir kategori hedef olabileceğini verilen önemli klinik etkileri vardır. Alagille Sendromu intrahepatik kanalları etkiler Örneğin, biliyer atrezi başlangıçta, yenidoğanın ekstrahepatik kanalları etkiler.
Fare ve sıçan cholangiocytes intrahepatik safra kanalı ve birimlerin tecrit çok açıklamaları vardır. Içindevestigators kanal izolasyon ve sonraki akıbet tarafından tek hücreleri izole veya karaciğer sindirim ve antikor spesifik hücre yüzey belirteçleri 1-4 ifade cholangiocytes aşağı çekme var. Fonksiyonel ve polarize safra kanalı birimleri karaciğer sindirim ve boyut filtrasyon 7 tarafından izole edilmiştir. Safra kanalı tane izole cholangiocytes vitro 1,2 kanalsal yapıların geliştirilmesi için gösterilmiştir ve, uyarı salgılama ve sıvı salgı 7 göstermek için yanıt yeteneğine sahiptir. Bu yöntemlerden Sınırlamalar sindirim enzimleri ile karaciğer perfüzyon için uzman teknik uzmanlık ve özel ekipman ihtiyacı bulunmaktadır. Buna ek olarak, mezenkimal hücreler 3 ile kirlenme riski vardır.
Özel olarak neonatal ekstrahepatik safra kanallarının ikinci, ekstrahepatik safra kanalı cholangiocytes izole edilmesi için bir yöntem olup, daha önce tarif edilmemiştir. Bu yazıda yenidoğan a izole etmek için basitleştirilmiş bir teknik özetliyoriyi saflık yüksek seviyelerde yetişkin ekstrahepatik safra kanalı hücreleri olarak var. Bu teknik, intra ve ekstrahepatik cholangiocytes ve ekstrahepatik kanalları dahil safra atrezi gibi hastalıkların mekanizmaları araştırma arasındaki farkların çalışma kolaylaştıracaktır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aksi belirtilmediği sürece, tüm işlem, oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Tüm hayvan çalışmaları yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan bir protokol çerçevesinde insani şartlarda yapılmalıdır.
1.. Ekipmanları hazırlanması ve Çözümler
- Doku kültürü kaputu ve inkübatör (Şekil 1A) yakın fare cerrahi tablo oluşturdu. Not: Gerekli donanımları bir diseksiyon mikroskobu, bir ışık kaynağı, 12.5 cm uzunluğunda düz iris makası, ince ipuçları ile 6 inç olmayan tırtıklı kavisli bir forseps ve 4 inç kavisli uçları (Şekil 1B) ile tırtıklı forseps içerir.
- Cerrahi masaya% 70 alkol, bir cam beher içinde sterilize aletleri yerleştirin.
- Steril izolasyon medya (Tablo 1) ile üç steril 60 mm Petri kapları doldurun; cerrahi masada iki ve kaput biri, buz üzerinde tüm yerleştirin.
- Sıçan kuyruğu kollajen yerleştirin,10x steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), steril su, steril 1 N NaOH ve doku kültürü kaputu safra epitel hücre (BEC) ortamı (Tablo 1). Not: kollajen buz üzerinde olmalıdır.
2.. Safra Kanalı İzolasyon ve Kültür
- Bilinçsiz IACUC kılavuzlar (Şekil 1C) başına servikal dislokasyon ile takip kadar karbon dioksite maruz bırakılarak, yaşam 0-3 gün arasında yeni doğan farelerin Euthanize.
Not: eski fareler spesifik deneysel gereksinimlerine bağlı olarak kullanılabilir. - Sırtüstü pozisyonda hayvan yerleştirin ve pelvis bölgesinde, orta hattı geçen bir küçük yatay bir kesi yapmak. U şekilli flep oluşturulması, yanal ve yukarı karın her iki tarafını bu kesi uzatın. Karın organları maruz kapağını açın. Karın açıldığında, dikkatle karaciğer ve safra kanalının daha iyi görselleştirme için hayvanın sağ tarafına doğru karın boşluğundan dışarı bağırsak hareket. Not: Karaciğer iyi kimlik elde etmek için göğüs kafesi içine yanal kesiler uzatmak için gerekli olabilir.
- Diseksiyon mikroskobu kullanılarak, ortak safra kanalı, karaciğer, bağırsak ve tanımlamak. Yapıları çok hassas olduğu gibi, dikkatli kullanarak, ilk ortak safra kanalı (Şekil 1D) tanımlayın. Tırtıklı olmayan dişli forseps ile, titizlikle temiz ve safra çevreleyen yağ dahil olmak üzere bağ dokusu koparmak. Kanal ve temizlemek için diğer tutmak için bir forseps kullanın.
- Safra kesesini temizlemek için benzer bir tekniği kullanın.
- Buz üzerinde izolasyon medyanın ilk yemeğin içine temizlenmiş kanallarını ve safra kesesini yerleştirin. Medyada daha fazla bağ dokusu kaldırmak ve safra kesesi safra çıkartırken hafifçe olmayan dişli forseps ile yapıları masaj.
- Izolasyon medyanın ikinci çanak kanallarını ve safra kesesini aktarın.
- 5 hayvanlardan elde edilen kanal ve safra kesesi izolasyonundan sonra, aktarmakaputu üçüncü Petri kabı parçaları. Not: hücreler, en fazla 5 hayvanlardan izole edilecekse, 5 hayvandan oluşan her grup için yeni çözeltiler kullanılarak, gruplar halinde var.
- Doku kültürü kaputu kalın kollajen jeller hazırlayın:
Not: herhangi bir boyut çanak kullanılabilir. 5 yeni doğan her bir grup için 3 ml kolajen bir son hacme sahip 60 mm kültür çanağı iyi çalışır. Bu taze izole edilmiş kanalları gömme anda taze hazırlanmalıdır.- Buz üzerinde fare kuyruk kolajeni, 10x steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS 10x), steril dH 2 O ve steril 1 N NaOH yerleştirin.
- Kollajen 0.023 katı hacmine eşittir 1 N NaOH hacmi kullanılarak, dH 2 0, 10x PBS, NaOH ve kollajen 1x PBS içinde 2 mg / ml kolajen nihai konsantrasyonuna sahip jeller için gerekli olan miktarlar hesaplayın ilave edildi. Not: kollajen alternatif kaynak kullanılırsa, nötralizasyon ve jel oluşumu için üreticinin yönergelerini izleyin.
- Birlikte dH 2 0, 1 mix0 x PBS, ve 1 N NaOH, daha sonra da karıştırma sağlamak için kolajen ve pipet kuyu ekleyin.
- Kolajen çözeltisi, oda sıcaklığında benzeri bir kıvam jel kalınlaştırılmış sonra, hemen kollajen kanalları gömmek.
- % 5 CO2 30 dakika boyunca katılaşması için kolajen sağlamak için, 37 ° C'de inkübatör yerleştirin.
- Jel (beyaz açık renk değişiklikleri), BEC medya (Tablo 1) 3.5 ml ile kaplamayı katılaşmış ve 37 ° C'de inkübe edildikten sonra,% 5 CO 2.
- BEC medya haftada 3 kez kaldırmak ve 3.5 ml taze ortam ile değiştirin.
Kalın Kollajen Jeller 3. Isolating İlköğretim Cholangiocytes
Not: 3 hafta içinde, cholangiocytes (büyük çekirdekler gömülü kanallarından doğrudan uzanan hücreler) yaprak kalın kollajen görünür olacaktır. Çanak fibroblastların çok sayıda vardır, bu atılmalıdır. Yemeğin bir kaç bölge varsafibroblast büyüme, bu bir bistüriyle kesilip ve önceki cholangiocytes bölme için çıkarılabilir.
- Ince kollajen jeller hazırlayın:
- Steril PBS ile 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyona kadar kollajen seyreltin. Not: 100 mm tabak için 1 ml kullanmak; Diğer boyut yemekler için buna göre ayarlayın.
- Bir hücre dağıtıcı (büyük yemekleri) veya pipet ucu (küçük yemekler) ile eşit şekilde yayılmış kolajen çözeltisi, daha sonra 10 dakika için oda sıcaklığında bırakın.
- DMEM/F12 plaka kapak ve 37 ° C, 10 dakika boyunca% 5 CO2 ile inkübe edilir.
- Inkübatör plakasını çıkarın ve 1x PBS ile yıkayın. Hemen 1x PBS aspire.
- Plakası döner veya bir çalkalayıcı levha üzerinde yayma kollajen yerleştirerek ikinci bir ince tabaka ile kaplayın. 37 ° C'de, 10 dakika boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin.
- Kollajen katılaşan sonra, kapak DMEM/F12 plakası ve 37 ° C, 30 dakika boyunca% 5 CO2 ile inkübe edilir.
- Th hücreleri bölmeTran kollajen jeller:
- Bu yüzer böylece hücre kültürünün bir spatula ya da hücre kazıyıcı ile, plaka kapalı yavaşça kollajen jel kazıyın.
- DMEM/F12 ile 10 mg / ml Tip XI kolajenaz (maddeler listesine bakınız) seyreltilerek kolajenaz çözeltisi hazırlayın. De ve steril filtre karıştırın.
- Kalın kollajen hücrelerin 60 mm tabak başına kolajenaz çözeltisi (yukarıdaki) 1 ml ilave edilir. (3 ml olmalıdır) BEC ortamı çıkarmayın. 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe çanak,% 5 CO2.
- Hücreleri içeren çözüm çıkarın ve 15 ml konik bir tüp içinde yer.
- 5 dakika boyunca 2.200 xg'de aşağı spin. Süpernatantı atın ve DMEM/F12 benzer hacminde pelet askıya yeniden.
- 5 dakika boyunca 2,200 x g hızında tekrar çözelti Spin. Süpernatantı.
- 3,% 0.5 tripsin ml ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca,% 5 CO2 inkübe içinde süspanse pelet. Inkübasyondan sonra, çözüm yukarı pipet ve aşağı cholangiocytes bir yaprak kırmak için. BEC medya a 5 ml ekleyin5 dakika boyunca 1500 xg nd sıkma çözüm.
- Daha sonra 5 dakika boyunca 1500 x g'de çözeltisi spin DMEM/F12 süpernatant ve pelet tekrar süspansiyon çıkarın.
- Süpernatantı ve BEC medya (Tablo 1) pelet askıya yeniden. Önceden yapılmış ince kollajen jeller üzerinde plaka hücreleri.
Hücreler 4. Passage ve Depolama
Not: Gerektiğinde ince kollajen jeller üzerinde hücreler bölünebilir.
- Önce 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 tripsin kuluçka için steril PBS ile plakaları yıkayın.
- BEC ortamının bir eşit hacmi ile nötralize ve 5 dakika boyunca 1500 x g'de topak. DMEM/F12 pelet durulayın, daha sonra 5 dakika boyunca 1500 x g'de topak.
- Kollajen kaplı hücre kültürü yemekleri dağıtımı için BEC medyada süspanse edin hücreleri.
Not: Alternatif olarak, hücreler, depolama ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve -80 ° C veya sıvı azot dondurucu (Tablo 1) saklanabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Neonatal fare ekstrahepatik mükemmel saflıkta cholangiocytes, K19 immünofloresan boyama ile gösterildiği gibi (Şekil 2A ve 2B) bir nüfus izolasyonunda bu protokol sonuçlarının kullanılması; erişkin farelerin hücrelerini izole benzer sonuçlar elde. Bu kalın kolojen jeller üstünde tek tabakaları oluşturacak şekilde taze olarak izole edilen safra kanalları hücrelerin boyunca 3 hafta sürer olduğunu gözlemledik. Cholangiocytes kanallarından izole edilmiş hücre tabakaların oluşturulması, kalın kollajen boyunc...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan yenidoğan dahil her yaştan farelerin farelerin ekstrahepatik safra kanallarında saf cholangiocytes izole etmek için bir tekniktir. Teknik ekstrahepatik cholangiocytes intrahepatik cholangiocytes ayrı ele alınabilir ki avantaj sunuyor, ve hücrelerin bu toplumlar arasında önemli farklılıklar tespit çalışmaları kolaylaştırabilir. Biz son zamanlarda bir çalışma demonstrating bu yöntemle izole ve al yanaklı rotavirüs 8 ile enfekte ekstrahepatik cholangiocytes içinde kirpikler azalmıştır yayınlandı...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.
Teşekkürler
Yazarlar Sindirim Moleküler Araştırmalar UPenn NIDDK Merkezi Moleküler Patoloji ve Görüntüleme Çekirdek ve görüntüleme yardım için Karaciğer Hastalıkları (P30 DK50306) müteşekkiriz. Bu çalışma (RGW için) Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 DK-092111) gelen ve Fred ve Suzanne Biesecker Pediatrik Karaciğer Merkezi'nden hibe ile ve (SK) Çocukluk Karaciğer Hastalıkları Araştırma ve Eğitim Ağı bir burs ile desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Yaşam teknolojileri | 11320-033 | 500 ml, BEC ortamında kullanılır |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, BEC ortamında kullanılır |
| Esansiyel olmayan amino asitlerle MEM | Gibco/ Yaşam teknolojileri | 11140-019 | 5 ml, BEC ortamında kullanılır |
| İnsülin-transferrin-selenyum | Gibco/ Yaşam teknolojileri | 51300-044 | 5 ml, BEC ortamında kullanılır |
| Na Piruvat | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, BEC ortamında kullanılır |
| Kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantresi | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, BEC ortamında kullanılır |
| Penisilin-Streptomisin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, BEC ortamında kullanılır ve 500 μ l izolasyonda |
| Gentamicin | Gibco / Yaşam teknolojileri | 15750-060 | 0.2 ml, BEC ortamında ve 500 &# 956'da kullanılır; l izolasyonda |
| Etanolamin | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, BEC ortamında kullanılan |
| MEM vitamin çözeltisi | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, BEC ortamında kullanılan |
| Soya fasulyesi tripsin inhibitörü | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, BEC ortamında kullanılır. Çözücü PBS'dir, 5 mg / ml stok konsantrasyonuna karıştırın |
| L-glutamin | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, BEC ortamında kullanılır |
| Sığır hipofiz özü | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, BEC ortamında kullanılır |
| Deksametazon | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, BEC ortamında kullanılır, Stok conc 393 &# 956; g / ml etanol |
| 3 3 ', 5-triiyodo-L-tironin | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml ile seyreltin, BEC ortamında kullanılır, Stok konsantrasyonu 3.4 mg / ml etanol ile seyreltin |
| Epidermal büyüme faktörü | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, BEC ortamında kullanılır, 25 &# 956; g / ml, BEC ortamında kullanılan DMEM F12 +% 1 BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml ile seyreltin, 0.411 mg / ml stok konsantrasyonunda kullanın ve DMSO |
| Fungizone | Gibco / Life technologies | 15290-018 | , BEC ortamında kullanılır ve 500 & # 956; l izolasyonda |
| Sıçan kuyruğu kollajen | BD Biosciences | 354236 | kollajen konsantrasyonuna bağlı olarak değişken |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | 10x'te kullanın, steril, kollajen yapmak için kullanılır, kullanılan miktar kollajen konsantrasyonuna bağlıdır |
| dH < sub > 2 < / sub > O | N / A | N / A | steril, kollajen yapmak için kullanılır, kullanılan miktar kollajen konsantrasyonu |
| NaOH'ye bağlıdır 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | 1 N'ye seyreltin, steril, kollajen yapmak için kullanılır, kullanılan miktar kollajen konsantrasyonuna bağlıdır |
| Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657'den | önce DMEM ve steril filtrede seyreltin |
| tripsin-EDTA (1x) %0,25 | Gibco/ Yaşam teknolojileri | 25200-056 | 3 ml, maksimum 10 dakika inkübe edin |
| tripsin-EDTA (10x) % | 0,5Gibco/ Yaşam teknolojileri | 15400-054 | 3 ml, maksimum 10 dakika inkübe edin |
| Diseksiyon mikroskobu | Nikon | SMZ645 | Diğer modeller kabul edilebilir |
| Işık kaynağı (fiberoptik aydınlatıcı) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Diğer modeller kabul edilebilir |
| 12,5 cm düz iris makası | Kent Scientific | Diğer modeller kabul edilebilir | |
| 6" tırtıksız kavisli forseps ince uçlu | Elektron Mikroskobu Bilimleri | Diğer modeller kabul edilebilir | |
| İnce uçlu 4" tırtıklı paslanmaz forseps | Elektron Mikroskobu Bilimleri | Diğer modeller kabul edilebilir |
Kaynaklar
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
