Yenidoğan farelerin ekstrahepatik safra kanallarından cholangiocytes izole etmek için bir teknik tarif edilir. Kanallar titizlikle kesilir, ve daha sonra hücreler, kalın kolojen jeller büyümesinin ile izole edilir. Bu yöntem, ekstrahepatik safra kanalı geliştirme ve patolojiyi eğitim için yararlı bir araç sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yenidoğan Ekstrahepatik Cholangiocytes İzolasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Karaciğer içi ve ekstrahepatik safra kanalları gelişimsel farklıdır ve farklı şekilde bazı hastalıklar etkilenebilir. Ancak, intra ve ekstrahepatik cholangiocytes ve yenidoğan ve yetişkin hücreleri arasındaki arasındaki farklar, iyi anlaşılmış değildir.
Intrahepatik safra kanallarının ikinci cholangiocytes izolasyonu için yöntemler de 1-4 kurulmuştur. Bu ayrı cholangiocyte popülasyonları arasındaki farklılıkları anlamak ve ekstrahepatik kanalları hedef gibi görünür, safra atrezi gibi hastalıklara okuyan büyük fayda olacağını, ancak özellikle Yenidoğandan ekstrahepatik duktal hücrelerin izolasyonu, henüz tarif edilmemiştir. Neonatal ve yetişkin fare hem de ekstra-hepatik safra kanalı hücreleri izole etmek için optimize edilmiş bir teknik aşağıda tarif edilmiştir. Bu teknik, fibroblastlar gibi mezenkimal hücrelerden en az kirlenme ile saf bir hücre popülasyonu elde edilir.
Bu metod titiz diseksiyon ve yağ ve fibroblast tabakaları kaldırmak için kazıma tarafından takip ekstrahepatik kanalları ve safra kesesi, çıkarılması dayanmaktadır. Yapılar deneysel kullanım için daha sonra tripsinize edilebilir ve kaplama yeniden tek katmanlarda cholangiocytes arasında gelişimini sağlamak için yaklaşık 3 hafta boyunca kollajen ve kültüre kalın tabakalar gömülür.
Giriş
Intra ve ekstrahepatik cholangiocytes kökeni ve gelişim belirgin farklıdır. Karaciğer ventral foregut endoderm 5 bir divertikül gelişir. Kranial bölge intrahepatik safra yolları 5 üretirken divertikül kaudal bölge, ekstrahepatik safra yolları oluşturur. Intrahepatik kanal cholangiocytes peri portal bölgelerde 6'da duktal plaka çevresinde projenitör hücrelerinden türetilmiştir. Bu hücreler hepatositler veya cholangiocytes 6 ya da içine ayırt etmek yeteneğine sahip. Bu cholangiopathies özellikle cholangiocytes bir kategori hedef olabileceğini verilen önemli klinik etkileri vardır. Alagille Sendromu intrahepatik kanalları ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aksi belirtilmediği sürece, tüm işlem, oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Tüm hayvan çalışmaları yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan bir protokol çerçevesinde insani şartlarda yapılmalıdır.
1.. Ekipmanları hazırlanması ve Çözümler
- Doku kültürü kaputu ve inkübatör (Şekil 1A) yakın fare cerrahi tablo oluşturdu. Not: Gerekli donanımları bir diseksiyon mikroskobu, bir ışık kaynağı, 12.5 cm uzunluğunda düz iris makası, ince ipuçları ile 6 inç olmayan tırtıklı kavisli bir forseps ve 4 inç kavisli uçları (Şekil 1B) ile tırtıklı forseps içerir.
- Cerrah....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Neonatal fare ekstrahepatik mükemmel saflıkta cholangiocytes, K19 immünofloresan boyama ile gösterildiği gibi (Şekil 2A ve 2B) bir nüfus izolasyonunda bu protokol sonuçlarının kullanılması; erişkin farelerin hücrelerini izole benzer sonuçlar elde. Bu kalın kolojen jeller üstünde tek tabakaları oluşturacak şekilde taze olarak izole edilen safra kanalları hücrelerin boyunca 3 hafta sürer olduğunu gözlemledik. Cholangiocytes kanallarından izole edilmiş hücre tabakaların oluşturulması, kalın kollajen boyunc.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan yenidoğan dahil her yaştan farelerin farelerin ekstrahepatik safra kanallarında saf cholangiocytes izole etmek için bir tekniktir. Teknik ekstrahepatik cholangiocytes intrahepatik cholangiocytes ayrı ele alınabilir ki avantaj sunuyor, ve hücrelerin bu toplumlar arasında önemli farklılıklar tespit çalışmaları kolaylaştırabilir. Biz son zamanlarda bir çalışma demonstrating bu yöntemle izole ve al yanaklı rotavirüs 8 ile enfekte ekstrahepatik cholangiocytes içinde kirpikler azalmıştır yayınlandı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.
Teşekkürler
Yazarlar Sindirim Moleküler Araştırmalar UPenn NIDDK Merkezi Moleküler Patoloji ve Görüntüleme Çekirdek ve görüntüleme yardım için Karaciğer Hastalıkları (P30 DK50306) müteşekkiriz. Bu çalışma (RGW için) Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 DK-092111) gelen ve Fred ve Suzanne Biesecker Pediatrik Karaciğer Merkezi'nden hibe ile ve (SK) Çocukluk Karaciğer Hastalıkları Araştırma ve Eğitim Ağı bir burs ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Yaşam teknolojileri | 11320-033 | 500 ml, BEC ortamında kullanılır |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, BEC ortamında kullanılır |
| Esansiyel olmayan amino asitlerle MEM | Gibco/ Yaşam teknolojileri | 11140-019 | 5 ml, BEC ortamında kullanılır |
| İnsülin-transferrin-selenyum | Gibco/ Yaşam teknolojileri | 51300-044 | 5 ml, BEC ortamında kullanılır |
| Na Piruvat | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml, BEC ortamında kullanılır |
| Kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantresi | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml, BEC ortamında kullanılır |
| Penisilin-Streptomisin | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml, BEC ortamında kullanılır ve 500 μ l izolasyonda |
| Gentamicin | Gibco / Yaşam teknolojileri | 15750-060 | 0.2 ml, BEC ortamında ve 500 &# 956'da kullanılır; l izolasyonda |
| Etanolamin | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml, BEC ortamında kullanılan |
| MEM vitamin çözeltisi | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml, BEC ortamında kullanılan |
| Soya fasulyesi tripsin inhibitörü | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml, BEC ortamında kullanılır. Çözücü PBS'dir, 5 mg / ml stok konsantrasyonuna karıştırın |
| L-glutamin | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml, BEC ortamında kullanılır |
| Sığır hipofiz özü | Gemini | 500-102 | 1.1 ml, BEC ortamında kullanılır |
| Deksametazon | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml, BEC ortamında kullanılır, Stok conc 393 &# 956; g / ml etanol |
| 3 3 ', 5-triiyodo-L-tironin | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml ile seyreltin, BEC ortamında kullanılır, Stok konsantrasyonu 3.4 mg / ml etanol ile seyreltin |
| Epidermal büyüme faktörü | Millipore | 01-101 | 0.5 ml, BEC ortamında kullanılır, 25 &# 956; g / ml, BEC ortamında kullanılan DMEM F12 +% 1 BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml ile seyreltin, 0.411 mg / ml stok konsantrasyonunda kullanın ve DMSO |
| Fungizone | Gibco / Life technologies | 15290-018 | , BEC ortamında kullanılır ve 500 & # 956; l izolasyonda |
| Sıçan kuyruğu kollajen | BD Biosciences | 354236 | kollajen konsantrasyonuna bağlı olarak değişken |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | 10x'te kullanın, steril, kollajen yapmak için kullanılır, kullanılan miktar kollajen konsantrasyonuna bağlıdır |
| dH < sub > 2 < / sub > O | N / A | N / A | steril, kollajen yapmak için kullanılır, kullanılan miktar kollajen konsantrasyonu |
| NaOH'ye bağlıdır 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | 1 N'ye seyreltin, steril, kollajen yapmak için kullanılır, kullanılan miktar kollajen konsantrasyonuna bağlıdır |
| Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657'den | önce DMEM ve steril filtrede seyreltin |
| tripsin-EDTA (1x) %0,25 | Gibco/ Yaşam teknolojileri | 25200-056 | 3 ml, maksimum 10 dakika inkübe edin |
| tripsin-EDTA (10x) % | 0,5Gibco/ Yaşam teknolojileri | 15400-054 | 3 ml, maksimum 10 dakika inkübe edin |
| Diseksiyon mikroskobu | Nikon | SMZ645 | Diğer modeller kabul edilebilir |
| Işık kaynağı (fiberoptik aydınlatıcı) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Diğer modeller kabul edilebilir |
| 12,5 cm düz iris makası | Kent Scientific | Diğer modeller kabul edilebilir | |
| 6" tırtıksız kavisli forseps ince uçlu | Elektron Mikroskobu Bilimleri | Diğer modeller kabul edilebilir | |
| İnce uçlu 4" tırtıklı paslanmaz forseps | Elektron Mikroskobu Bilimleri | Diğer modeller kabul edilebilir |
Kaynaklar
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
