Yöntem makalesi

Yöntem Spontan Karakterizasyonu Ürkütme kaynaklı hareket yeteneği bir Rotenon ile uyarılan Parkinson Hastalığı Modeli için Drosophila

DOI:

10.3791/51625

⸱

17 Ağustos 2014

 ,  , 
1Department of Biology, Colby College

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parkinson hastalığı hareket yeteneği etkilere neden, merkezi sinir sistemindeki dopaminerjik nöronların dejenerasyonu ile sonuçlanan bir nörodejeneratif hastalıktır. Rotenon modelleri Drosophila Parkinson hastalığı bulunmaktadır. Bu kağıt rotenone neden spontan ve irkilme-kaynaklı hem lokomosyon eksiklikleri niteleyen iki deneyleri özetliyor.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parkinson hastalığı esas olarak, substantia nigra merkezi sinir sistemindeki dopaminerjik nöronların dejenerasyonu ile sonuçlanan bir nörodejeneratif hastalıktır. Hastalık insanlarda katılık, titreme ve demans gibi sunmak motorlu eksiklikleri neden olur. Rotenon mitokondrideki elektron taşıma zincirinin işlevini inhibe ederek oksidatif hasara neden olan bir insektisit olan. Ayrıca, Drosophila Parkinson hastalığı modeli kullanılır. Sinekler onları şaşırtan geçtikten sonra yukarı tırmanmaya zorlayan içsel bir negatif geotactic yanıtı var. Bu rrotenon onlar aşağı dinlendiğini sonra tırmanmaya sineklerin yeteneğini bozabilir erken mortalite ve hareket kusurlarına neden olduğu tespit edilmiştir. Ancak, spontan hareketi rotenone etkisi iyi belgelenmiş değildir. Bu çalışma, rotenon kaynaklı eksiklikleri karakterize etmek için, iki, hassas, tekrarlanabilir ve kapsamlı incelemeler özetlenmektedirKısa vadeli Drosophila lokomosyon ve uzun vadeli spontane hareketlilik irkilme kaynaklı. Bu deneyler, uygun bir hareket yeteneği kusurları ve terapötik maddelerin etkinliğinin diğer Drosophila modelleri karakterize adapte edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lokomosyon eksiklikler Parkinson hastalığının büyük bir semptomudur ve büyük ölçüde, substantia nigra 1 dopaminerjik nöronların bozulmasına neden olur. Rotenon Drosophila 2-6 Parkinson motor açıkları modellemek için yoğun şekilde çalışılmış bir ketonik bir böcek öldürücüdür. Rotenon sonuçta hücre ölümüne 7 neden oksidatif fosforilasyon yolu bloke ederek oksidatif hasara neden olur. Dopaminerjik nöronlar, esas olarak, motor 2,7 göre kimyasal etkiler yaratmak, rotenon zehirlenmesine karşı daha eğilimlidir. Sinekler Parkinson hastalığı belirtileri uyararak, biz daha iyi hastalığı anlamak ve 6,8-11. Drosophila bakımı kolay, genetik uysal çünkü bu etkiyi incelemek için iyi bir model sağlamaktadır belirtilerini düzeltmek ve hızlı bir yaşam döngüsüne sahip olabilir.

Çeşitli çalışmalarda rotenon kısa süreli irkilme kaynaklı yol açtığını göstermiştirDrosophila'nın -zaman sinekler lokomosyon kusurlar rrotenon-takviye gıda muhafaza, bunlar irkilme 2-6 sonra daha yavaş bir olumsuz geotactic tepki gösterir. Kontrol denemelerinde olduğu kadar çabuk bir şişe aparatı yukarı tırmanmak için başarısızlık irkilme-kaynaklı lokomosyon kusurları göstergesidir.

Uzun vadede rotenone etkisi, kendiliğinden hareket de Drosophila etkinliği izler (DAMs) başarıyla Drosophila sirkadiyen ritim hareketini izlemek için kullanılır olmuştur. Tarif 12,13 inceler değildir. Sinekler DAM yüklenen bireysel tüpler içine yerleştirilir. Bu cihaz, bir sinek kızılötesi ışını kırar kez sayar bir kızılötesi sensörü ile donatılmıştır. Bu sayımlar rahatsız hareketlilik ve aktivite 12,13 bir ölçüsü olarak kullanılabilir. Bir DAM sinek koyarak, onların uzun vadeli lokomosyon rotenone etkisi karakterize edilebilir. Bu çalışma, ölçüm için yöntemler anlatılmaktadırure kısa vadeli iyi rrotenon aracılı motorlu eksikliklerin etkilerini anlamak için hareketlilik ve uzun vadeli spontan lokomosyonu irkilme kaynaklı. Bunlar, bu kusurlar lokomosyon tersi diğer bileşiklerin çalışmaya izin vermesi nedeniyle, Parkinson hastalığının taklit lokomosyon eksiklikleri karakterizasyonu önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Drosophila irkilme kaynaklı Locomotion Deneyi

  1. İlaç Tedavisi
    1. Istenilen sayıda hareketsiz için oturaklı (yaklaşık 8-12) 1-3 günlük erkek CO 2 kullanarak ve ilaç takviyesi gıda içeren flakon taşırlar uçar. Not: Başka bir anestetik, örneğin, eter veya buz sayım ve kontrol edilebilmesi için sakinleştirici sinekleri için kullanılabilir.
    2. 25 ° C'de sinekler (sinekler önlemek için gıda saplanıyor) yatay konumda göz ile 20 dakika (ya da kurtarma kadar) sedasyon kurtarmak ve daha sonra 12 saat karanlıkta dik şişeyi yerleştirmek için izin, 12 saat ışık inkübatör Deneyin geri kalan bölümü için.
  2. Deney Kurma
    1. Kalıcı bir kalem ile şişelere etrafında daireler işaretleyerek 6.33 cm olmak üzere üç eşit parçaya bu çifte flakon kurulumu bölün.
    2. Ilaç maruziyeti 3 gün sonra, buraya, alt şişenin içine anestezi olmadan uçar ve hızlı bir şekilde üst şişe yerleştirinaçıklık boyunca yerleştirilir. Şeffaf bir bantla birlikte iki şişe bantlayın.
    3. Sinekler 15 dakika boyunca yeni ortamına alışmaları için izin verin.
    4. Yer beyaz bir arka plan üzerinde küçük şişeler ve görünümünde bir zamanlayıcı ile çift şişe cihazdan uygun bir mesafede bir dijital kamera kurmak. Bütün cihaz tek bir resim çerçevesi görünür olduğundan emin olun ve tüm sinekler odak olduğunu. Çalışmalar arasında tutarlı kareleri korumak için, kamera ve flakonun konumunu işaretleyin.
  3. Hareketlilik Deney
    1. Açıkçası kamera görüntüsü deneme sayısını, ilaç tedavisi ve zamanlayıcı gösterilecek.
    2. Sıkıca tezgah karşı 3 kez çift şişe aparatı dokunun ve tüm sinekler şişenin dibine düşer emin olun. Eşzamanlı sayacını başlatmak.
    3. Her 5 saniye ila 1 dakika boyunca, tertibatın bir resim alır. Not: Alternatif olarak, video yakalanan ve ölçümler için uygun aralıklarla durdurulmuş olabilir.
    4. Sinekler 1 dakika boyunca rahatsız kurtarmak için izin verin.
    5. Her deneme arasında 1 dakikalık iyileşme süresi ile 2 kez daha tekrarlayın. Not: Her bir cihaz veri toplama tamamlamak için 5 dakika almalıdır. Çalışmalar arasındaki dokunarak benzer güce sahip. Birden fazla (en az 3) Cihaz kolay olarak ele alınabilir.
  4. Veri Analizi
    1. Resimlere ve zamanla her bölümde sinek sayısını kaydedin. Zamanla her bölümde sinek yüzdesini hesaplayın. Notlar: Örneğin, gün 3, 5 için, ilgi 2 veya 3 kez noktalarında aynı sinekler ile tüm bu prosedürü tekrarlayın ve çok sinek telafi etmek için orijinal deneme sayısını büyütmek mümkün olduğu deney boyunca ölmek 7. Eğer mortalite için. Verileri karşılaştırmak için uygun istatistiksel analiz kullanın.

2. Drosophila spontane hareketlilik deneyi

  1. Gıda Hazırlama
    1. 15 deiyonize ml su ve arzu edilen rotenone anlık Drosophila orta 3 g sulandırın(Veya ilgi başka bir ilaç) doz.
    2. Gıda karışım firma (yaklaşık 5 dakika) hale geldikten sonra, dikkatlice üreticisi haline yüksek yaklaşık 1 cm şeffaf borular (5 mm X 65 mm) verilen olmak için gıda yükleyin. Dikkatli bir gıda dikey olarak yerleştirilmesi ve tüpler olarak, boru içindeki gıda ile temizlenebilir kadar bunları bükerek tüplerine gıda infüzyon ilacı ekleyin. Not: Bu bir vakum oluşturmak için tüpün ağzına bir parmak yerleştirmek yararlı olur. Gıda hava kabarcıkları içeren ya da sinekler gibi sıkıştığında, düzensiz bir yüzeye sahip olmamalıdır.
  2. Deneysel Kurulum
    1. Gıda yakın tüp ucunda bir plastik kap yerleştirin. Zorla itti eğer şişe içinde bir hava kabarcığı oluşturabilir gibi, mümkün olduğunca az tüp üzerindeki plastik kapağı itin.
    2. Oturaklı 1 günlük erkek CO 2 kullanarak ve dikkatli 1 erkek bir fırça ile her bir tüp içine sinek takın uçar. İstenen denemelerin sayısına bağlı olarak tekrarlayın.
    3. TakEl büyük deposundan rulo olabilir, küçük bir pamuk ile gıda tüp en uzak, sonu pamuk topları aldım.
    4. Sinekler 15 dakika boyunca yatay konumda tüpleri ile kurtarmak ve tüm sinekler canlı ve aktif olmasını sağlamak için izin verin. DAM içine tüpleri yerleştirin ve tüm tüpler DAM için aynı konuma olduğundan emin olun. Not: Bu, şişenin ortasında izleme alanı ile yerleştirmek için, veya borunun ucu, izlenmekte olan, böylece tarafında tüm şişeleri itmek mümkündür. Not: Bu yöntem üzerinde varyasyonlar için tartışma bakın.
  3. Veri Toplama
    1. 12 saat karanlıkta DAM yerleştirin, 12 saat ışık inkübatör 25 ° C'ye ayarlanır. Veri toplama sistemine DAM bağlayın. DAM yazılımını açın ve tercihleri ​​seçin bin uzunluğu altında 10 dakika. Veri toplama başlatın ve programı 7 gün boyunca veri toplamak için izin verir. Not: gerekirse kutusu uzunluğu ayarlanabilir.
    2. Veri Analizi
      Not: SüreçVeri uzun süreli spontane hareketlilik için bir ölçüt olarak dakika başına sayımları elde edildi.
      1. Belirleyin giriş verilerini açık tıklayarak BARAJI dosya tarama programı ve erişim monitör verileri.
      2. Uygun monitör aralığını seçin ve 10 dk aralıklarla bin uzunluğunu seçin.
      3. Çıktı dosya türü içinde kanal dosyaları seçebilirsiniz. Varsayılan olarak, tüm diğer seçenekleri bırakın.
      4. Tarama verilerini tıklayın ve belirli bir klasöre kaydedebilirsiniz.
      5. Sirkadiyen veri analizi yazılımı ithalat verileri dakika başına sayıları elde etmek. Not: Veri analizi Clocklab yazılım yaygın olarak kullanılır için. Diğer seçenekleri de mevcuttur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila irkilme kaynaklı Locomotion Deneyi

Yabani tip, kanton S, sinekler 30 sn (Şekil 1) sonra çift flakon tertibatının, sadece sırasıyla yaklaşık% 88 ve üst ve alt bölümlerinde sinekler% 5 güçlü bir negatif geotactic tepki gösterdi. 125 mcM ve 3 gün boyunca 250 mcM rotenone maruz sinekler üst bölümde ve alt kısmında sinek sayısında hafif bir artış sinek sayısında hafif bir azalma gösterdi. 500 ıLl rotenone maruz sinekler sinekler

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, Parkinson hastalığı ile indüklenen Drosophila rotenon modelinde uzun süreli spontane hareketlilik ve kısa süreli irkilme kaynaklı hareketlilik iki ölçüm için iki prosedürleri tarif eder. Bir de, Parkinson hastalığı, örneğin modellemek için bilinen diğer farmakolojik ajanlar, parakuat 14, Parkinson hastalığı, örneğin genetik modelleri, alfa-sinüklein mutantlar 15, ve hareketlilikte bir etkileyen hastalıklar ve diğer uçucu modelleri maruz sin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar arka plan müziği sağlamak için, video işleme ve Eric Thomas, müzik departmanı, Colby College ile teknik yardım için, Qiuli Wang, Dil Kaynak Merkezi, Colby College teşekkür etmek istiyorum. Bu proje Araştırma Kaynakları, INBRE için Ulusal Merkezi (P20RR016463-12), Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (P20 GM103423-12) hibe ile desteklenen, Sağlık ve Bilim Bölümü Grant, Colby College (STA) vatandaşları Enstitüleri. JL ve LWM Yaz Scholar Fonu, Colby College hibe tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Standart dar şişelerGenesee Scientific32-120
RotenoneSigmaR8875Dondurucuda saklayın, her deney için taze yapın
Dimetil Sülfoksit (DMSO)SigmaD8418Rotenon için
Çözücü Anında Drosophila ortamıCarolina Biological Formül 4-24
Drosophila aktivite monitörü (DAM)TrikinetikDAM2trikinetics.com
DAM tüpleriTrikinetikTüpler 5 X 65 mm
Rotenon + gıda tarifi (125 mM doz)25 mg rotenonu 1 ml DMSO'da çözerek DMSO'da 62.5 mM rotenon stok çözeltisi yapın; 125 mM doz için, DMSO'da 5 ml suya 10 mM rotenon stoğu ekleyin.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Olanow, C. W., Tatton, W. G. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annual review of neuroscience. 22, 123-144 (1999).
  2. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 10993-10998 (2004).
  3. Hosamani, R., Ramesh, S. R., Muralidhara, Attenuation of rotenone-induced mitochondrial oxidative damage and neurotoxicty in Drosophila melanogaster supplemented with creatine. Neurochemical research. 35, 1402-1412 (2010).
  4. Islam, R., et al. A neuroprotective role of the human uncoupling protein 2 (hUCP2) in a Drosophila Parkinson's disease model. Neurobiology of disease. 46, 137-146 (2012).
  5. Lawal, H. O., et al. The Drosophila vesicular monoamine transporter reduces pesticide-induced loss of dopaminergic neurons. Neurobiology of. 40, 102-112 (2010).
  6. St Laurent,, O'Brien, R., M, L., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  7. Sherer, T. B., et al. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 10756-10764 (2003).
  8. Munoz-Soriano, V., Paricio, N. Drosophila models of Parkinson's disease: discovering relevant pathways and novel therapeutic strategies. Parkinson's disease. , 520640(2011).
  9. Steffan, J. S., et al. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
  10. Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
  11. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8024-809 (2005).
  12. Ahmad, S. T., Steinmetz, S. B., Bussey, H. M., Possidente, B., Seggio, J. A. Larval ethanol exposure alters free-running circadian rhythm and per Locus transcription in adult D. melanogaster period mutants. Behavioural brain research. 241, 50-55 (2013).
  13. Seggio, J. A., Possidente, B., Ahmad, S. T. Larval ethanol exposure alters adult circadian free-running locomotor activity rhythm in Drosophila melanogaster. Chronobiology international. 29, 75-81 (2012).
  14. Chaudhuri, A., et al. Interaction of genetic and environmental factors in a Drosophila parkinsonism model. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 2457-2467 (2007).
  15. Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
  16. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
  17. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  18. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  19. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila LokomosyonuRotenon Modelirkilme Tepkisi DeneyiSpontan Lokomosyonift T p D zenene iDrosophila Aktivite Monit rKarbondioksit SedasyonuRotenon Takviyeli BesinGeotaktik TepkiLokomosyon Bozukluklar

İlgili makaleler