Method Article

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

DOI:

10.3791/51629

⸱

June 9th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Neuroscience, SMBS, University at Buffalo, SUNY, 2Department of Biochemistry, SMBS, University at Buffalo, SUNY, 3Molecular and Cellular Neuroscience Department, The Scripps Research Institute, 4Department of Biochemistry and Graduate Program in Neuroscience, SMBS, University at Buffalo, SUNY

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Iyon kanal proteinleri biyolojik zarların üzerinden hızlı iletişim için evrensel cihazlardır. Ürettikleri iyonik akının zamansal imzası her kanal proteini bunun yanı sıra oluşturulur ve kontrol edildiği mekanizma içsel özelliklerine bağlıdır ve güncel araştırma önemli bir alanını temsil eder. Iyon kanalı proteinlerin işlevsel dinamikleri ile ilgili bilgiler, tek bir molekül tarafından üretilen akımın uzun uzanır gözlemleyerek elde edilebilir. Ligand kapılı iyon kanalı, NMDA reseptörü için bir kanalı, hücre bağlı patch-clamp kayıtları akım elde etmek için bir protokol, aşağıda tarif edilmiştir, kortikal nöronlarda HEK293 hücrelerinde doğal olarak ya da heterolog bir şekilde eksprese. Ayrıca mekano duyarlı kanal PIEZO1 örneğini sunarak ilgi diğer iyon kanallarına yöntemi nasıl adapte talimatları vardır sağladı. Bu yöntem, kanal iletkenlik özellikleri ve ope zamansal dizisi ile ilgili verileri sağlayabilirBöylece sağlık ve hastalık onların işlevlerini anlamak için yardımcı kanalın aktivasyon mekanizmasını oluşturan n-kapalı konformasyonlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojik zarları arasında hızlı iletişim kanalları yaygın olarak adlandırılan oligomerik gözenek oluşturma membran proteinleri, neredeyse sadece dayanır. Bu proteinler aktivasyon sinyalleri, yolluk mekanizmaları ve iletkenlik özellikleri çok farklıdır. Gözenekleri iyonları seçici kanal proteinleri, iyon kanalları olarak sınıflandırılır; onların aktivasyon zarından iyonik akımları üretir ve bunların yanıtları elektrofizyolojik teknikler kullanarak gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlük ile kaydedilebilir. Aktivasyon sinyalleri konsantrasyon dereceleri, mekanik ve elektrik kuvvetleri, ve sıcaklık gibi kimyasal ve fiziksel girdilerin geniş bir dizi kapsar; Böylece, ba....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Hücre Kültürü ve Protein Expression

  1. HEK293 hücreleri,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile takviye edilmiş DMEM içinde tek tabakalı kültürü, ATCC tarafından gerçekleştirilen parçaları içerir geçitleri 22 ve 40 arasında (ATCC numarası CRL-1573) ve% 5 CO2,% 1 penisilin / streptomisin karışımı tutun ve 37 ° C. Deneyler arasında, 10 ml'lik bir final hacmi içinde, 5-20 kat seyreltmelerde T25 şişeleri içine geçiş hücreleri. Not: Bu geçişleri sırasında hücreleri kullanarak optimum mühür oluşumu ve yama istikrar sağlayacak olumlu hücre sağlığını garanti eder.
  2. Transfeksiyon için, çanak başına hücre süspansiyonu için ~ 0.5-0.6 ml karşılık ge....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant NMDA Reseptör

NMDA reseptörleri bağlayan ve iki eş agonistlerinin birlikte eyleme yanıt: glutamat ve glisin. Bunlar GluN1 alt birimleri ve GluN2 alt birimleri bağlayıcı iki glutamat bağlanması, iki glisin heterotetramers olarak monte edin. GluN2 alt birimleri beyindeki en yaygın formları transkribe çocuk ve yetişkin hayvanlarda GluN2B olarak GluN2A dört gen (MS) ile ve bunlardan kodlanır. Çünkü (Şekil 1A) alt birimi bileşimin kontrol, hem de ince.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Iyon kanalı alanında, araştırma önemli bir alan açılmasını veya kanalın yolluk mekanizmasını kanal açan olaylar dizisini anlamak için adamıştır. En çok kanal için, bu işlem karmaşıktır ve gözle görülebilir çok kanallı sinyalden çıkarılabilir edilemez kinetik çeşitli adımlar içerir. Buna karşılık, deneyler tek kanallı kayıt, açık / kapalı olaylar dizisini gözlemleyerek mekanizmaları yolluk hakkında daha detaylı bilgi üretebilir nerede dizayn edilebilir. Minimal invaziv patch-clamp kayıtları sabit koşullar altında gerçekl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazının yazarları hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma F31NS086765 (KAC) tarafından desteklenen, F31NS076235 (MAP), ve R01 NS052669 (GKP) ve EIA9100012. Yazarlar uzmanlık ve moleküler biyoloji ve doku kültürü ile yardım için Eileen Kasperek teşekkür ediyorum; ve Jason Myers erken prefrontal kortikal nöronların elde edilen veri paylaşımı için.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
KimyasallarSigmaÇeşitli
Borosilitatlı CamSutterBF-150-86-10
Parlak alan ters çevrilmiş mikroskopOlympus1x51Nikon da benzer mikroskoplara sahiptir
Fluroescent boxX-citeSerisi 120
Sıvı Işık KılavuzuX-citeOEX-LG15
MikromanipülatörSutter InstrumentsMP-225
OsiloskopTektronixTDS1001
AmplifikatörMoleküler CihazlarAxon Axopatch 200B
MasaTMC63561
NIDAQ kartıUlusal Aletler776844-01
ÇektirmeNarishigePC-10
ParlatıcıNarishigeMicroforge MF-830
Faraday KafesiTMC8133306
Yüksek Hızlı Basınç KelepçesiALA Scientific InstrumentsALA HSPC
Basınç/Vakum PompasıALA Scientific InstrumentsHSPC-1 içinALA PV-PUMP

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  2. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques f....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell attached Patch clampSingle Channel RecordingIon Channel ProteinsNMDA ReceptorPIEZO1 ChannelHEK293 CellsCortical NeuronsVoltage ClampQUB Data AcquisitionFire Polished Pipette

Related Articles