Lusiferaz aktivitesi ile reseptör aktivasyonunun bir ölçümü: Memeli Koku reseptörünün yüksek throughput Analizi

Özet

Koku reseptör aktivasyonu desenler koku kimliğini kodlamak, ancak memeli koku reseptörleri için Odorant ligandlar belirlenmesi yayınlanan verilerin eksikliği koku kodlama kapsamlı bir modelinin gelişmesini engellemektedir. Bu protokol, koku reseptör ligandları ve reseptör aktivasyonunun miktar yüksek throughput belirlenmesini kolaylaştırmak için bir yöntem tarif etmektedir.

Özet

Parfüm yaklaşık 1000 murin ve 400 insan reseptörleri ailesidir koku binlerce tanımak için izin koku reseptör aktivasyonunun benzersiz ve üst üste gelen desenleri oluşturmak. Odorant ligandlar insan reseptörleri ^1-11 az% 6 yayınlanmıştır. Bu veri eksikliği, kısmen fonksiyonel heterolog sistemlerde bu reseptörleri eksprese zorluklar kaynaklanmaktadır. Burada, bir lusiferaz haberci deneyi kullanılarak koku reseptör aktivasyonunun, yüksek verimli değerlendirme ardından Hana3A hücrelerde koku reseptör ailesinin, çoğunluğu ifade etmek için bir yöntem tarif eder. Bu deney, koku reseptörlerinin panel karşı koku maddesi (1) ekran panelleri için de kullanılabilir; (2) doz tepki eğrileri ile odorant / reseptör etkileşimi teyit; ve (3) reseptör varyantlar arasında reseptörü aktivasyon düzeyleri karşılaştırın. Bizim örnek veri, 328 koku reseptörleri 26 koku karşı tarandı. Değişen tepki puanları ile odorant / reseptör çifti selec edildited ve doz yanıt olarak test edilmiştir. Bu veriler, bir ekran, bir koku verici madde için iyi niyetli bir tepki, yani reseptörleri, bir doz cevap deneyi geçecek odorant / alıcı çiftleri için zenginleştirmek için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, bu yüksek verimli bir lusiferaz deney memeli koku koku kodlama sisteminde bir modeline doğru koku reseptörleri temel bir adım karakterize etmek için etkili bir yöntemdir.

Giriş

Memeli koku algılama sistemi, ve koku binlerce ayrım sağlayan, kokulu uyaranlara bir çok sayıda yanıt yeteneğine sahiptir. Koku reseptörleri (OR) koku epiteli ¹² koku duyusal nöronlar tarafından ifade moleküler sensörler bulunmaktadır. Memeli koku tanıma koku tarafından ameliyathanelerinde diferansiyel aktivasyonu yoluyla gerçekleşir ve OR gen ailesi kabaca 1.000 kemirgen ve 400 insan reseptörleri ^12-16 ile kapsamlıdır. Koku nöronlarda ve heterolog hücrelerde ameliyathanelerinde önceki fonksiyonel analizleri farklı katkılar benzersiz tarafından tanınan olduğunu göstermiştir, ancak OR ^10,17-20 arasında toplulukları örtüşen var. Ameliya....

Protokol

Hana3A Hücreler 1. Culture

1. % 10 (v / v) FBS ile en az temel ortam (MEM) ile takviye M10 ortamı hazırlayın.
2. Kültür Muhafazası
   1. M10 ortam içinde hücreler koruyun. Not: RTP1L, RTP2, REEP1 ve G için ifade vektörleri Hana3A hücrelere puromisin direnç kazandıran _αolf, ancak bu antibiyotik ile hücrelerin bakımı anlamlı deney sonuçlarını etkilemez.
   2. 01:08 10 cm tabaklar, 2-3 gün arasında bir oranda alt kültürü.
   3. % 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir.

Transfeksiyonu 2. Kaplama Hücreler

1. Hana3A hücrelerin% 100 konfluent 10 cm çanak medya aspire.

Sonuçlar

Birincil ekran 100 uM bir konsantrasyonda 26 kokulara karşı 328 OR'lar test edilmiştir. Bu koku yoğunluğu etkin bilinen ligandlar ¹⁰ ORs önemli bir bölümünü etkinleştirmek için gösterilmiştir. İlk olarak, normalize edilmiş lusiferaz aktivitesi, Renilla lusiferaz okunması ile, ateş böceği luciferase okuma bölünmesi ile hesaplanmıştır. Daha sonra, başlangıç ​​çizgisi değerleri, her bir (Şekil 1) için normalize edilmiş lusiferaz okumalardan herhangi bir koku kontrolü için normalize .......

Tartışma

Koku maddesi kimlik olfaktori reseptör aktivasyon paternlerinin ile kodlanan, ancak reseptörleri aktive edilmiş ve hangi dereceye kadar olan da dahil olmak üzere alıcı aktivasyonu desenler insan olfaktori reseptör ^1-11 arasında daha az% 6 ile tanınırlar. Koku reseptörleri karakterize etmek için çabalar koku reseptör ailesi ^{17,23,24,33,34} sadece bir alt kendi emek-yoğun yöntemlerle veya uygulanabilirliği ile sınırlı kalmıştır. Hana3A heterolog sentezleme sistemi, test edilen koku reseptörlerinin çoğ.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hana3A hücreleri			üzerine Matsunami Laboratuvarı'ndan temin edilebilir
RTP1S-pCI	Talep
M3-R-pCI	Talep
pCRE-luc	Agilent	219076	LUC
>pSV40-RL	Promega	E2231	RL
Minimum Temel Ortam, Eagle	Sigma Aldrich	M4655	MEM
>FBS	Life Technologies	16000-044	FBS< / a >
PBS (Ca 2 + < / sup> ve Mg 2 + < / sup>)	Cellgro	21-040-CV	a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS
Tripsin (%0.05 Tripsin EDTA olmadan)	Yaşam Teknolojileri	25300	Trypsin
CD293	Yaşam Teknolojileri	11913-019	CD293
>96 kuyulu PDL beyaz/şeffaf plaka	BD BioCoat	356693	plates
Lipid transfeksiyon reaktifi: Lipofectamine 2000	Yaşam Teknolojileri	11668-019	Lipofektamin < / a >
ateşböceği lusiferaz substratı, ateşböceği lusiferaz söndürücü / Renilla< / em> lusiferaz substratı: Çift Glo Testi	Promega	E2980	dual glo
Synergy S2	BioTek	SLAD	BioTek S2
Mikroplaka okuyucu yazılımı: Gen5 Veri Analiz Yazılımı	BioTek	Gen5	Gen5
BIOSTACK	BioTek	BIOSTACK2WR	BioStack
Multiflo	BioTek	MFP	MultiFlo
300 μ l GripTips	Integra	4433	GripTips
>12.5 μ l GripTips	Integra	4414	GripTips
>300 μ l Kavrama İpuçları ViaFlo96	Integra	6433	XYZ ipuçları
12.5 μ l GripTips 384 XYZ	Integra	6403	XYZ tips
384ViaFlo	Integra	6030	384ViaFlo
TE tampon	Macherey Nagel	740797.1
DMSO	Sigma Aldrich	D2650-100ML	DMSO
Forskolin	Enzo Yaşam Bilimleri	BML-CN100-0010	FOR

talep üzerine Matsunami Laboratuvarı'ndan temin edilebilirüzerine Matsunami Laboratuvarı'ndan temin edilebilir<