Bir Ex vivo Kültür Sistemi Tiroid Geliştirme Çalışması

Özet

Bu protokol, fare embriyonik tiroid anlajeninin diseksiyonunu ve eksplantların yarı gözenekli filtreler veya mikroskopi plastik slaytlar üzerinde kültürünü tanımlar. Bu sistem, vahşi tip veya nakavt embriyoların tiroid gelişimi sırasında meydana gelen morfogenetik veya farklılaşma olaylarını incelemek için idealdir ve fonksiyon kazancı ve kaybı deneylerine uygundur.

Özet

Tiroid tiroid hormonları T3, T4 ve kalsitonin üreten, boyun tabanında lokalize bir bilobated endokrin bezdir. Kalsitonin foliküllerinin ve kan kılcal yoğun bir ağ arasına serpiştirilmiş C-hücreleri tarafından sentezlenen ise T3 ve T4, folikül adlandırılan kapalı alanlarda düzenlenmiş farklı tirositlerin, tarafından üretilmektedir. Yetişkin tiroid mimari ve fonksiyonlar, kapsamlı olarak tarif ve incelenmiştir edilmiş olmasına rağmen, "anjiyo-foliküler" birimleri, parankimasında C-hücrelerinin dağılımı ve epitelyal ve endotelyal hücreleri arasındaki iletişimin parakrin oluşumu uzak anlaşılmalıdır değil.

Bu yöntem yarı macunsu filtrelerinde veya mikroskopi plastik kızaklar üzerinde fare embriyonik tiroid anlagen diseksiyon ve kültürünün sıralı adımları açıklar. Dört günlük bir süre içinde, bu kültür sistemi sadakatle vivo tiroid geliştirme tartışıldı. Gerçekten de, (i) bilorganın obation (E12.5 eksplantlar için) ortaya çıkar, (ii) ön-maddeleri foliküllerine düzenlemek ve polarize, (iii) tirositler ve C-hücreleri ayırt eder, (iv) microdissected proliferatif doku içinde mevcut endotel hücreleri, içine göç tirositler Onlar in vivo gibi yakından tiroid lobları, ve, epitel hücreleri ile ilişkilendirmek.

Tiroid dokular vahşi tip, boşaltma ya da floresan transgenik embriyolardan elde edilebilir. Dahası, immün ve RT-qPCR ile Ex vivo gelişimi gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir. Kültür antikorlar, büyüme faktörleri, ya da hücreler ya da şartlandırılmış ortam engelleme, inhibitör ilavesiyle manipüle edilebilir eksplant ya da kültürün her zaman.

Aşağı bütün-mount veya bölümleri görüntüleme ve gen ekspresyon profili tiroid o bir morfogenetik ve farklılaşma olayları manipüle ve eğitim için güçlü bir sistem sağlar üzerinde kombine sonuç, tiroid eksplant kültürü içinderganogenesis.

Giriş

Tiroid bezi endotel kılcal damarların yoğun bir ağ ile çevrili folikül denilen bağımsız epitel küreler bir bütünüdür. Bu örgüt, tiroid fonksiyon verir: endotel kapilerler T3 ve T4 hormon sentezi için gerekli olan iyot ile tirositler sağlamak, ve tüm vücuda bu son dağıtmak. Foliküllerinin ve kılcal arasında dağınık, C-hücreleri ¹ kalsitonin Hipokalsemik hormonu üretir. Erişkin tiroid mimarisi ve fonksiyonları iyi bilinmesine rağmen, tiroid embriyonik gelişim (folikül oluşumu ve farklılaşma) dahil hücresel ve moleküler mekanizmalar çok anlaşılır olmaktan vardır.

Embriyojenez sırasında, (Cı-hücrelerinin ataları damla şeklinde çıkıntılar olarak E11.5 de kaynaklanan sırasında projenitör embriyonik gün foregut endoderm ventral duvarının kalınlaşması (orta hat anlage) (e) fare embriyo 8.5, olarak çıkar tirositler ultimobranchial boDördüncü faringeal torbalar ^2-6) ölür. Orta hat tomurcuk daha sonra, endoderm ayrılır trakea her tarafında ultimobranchial organları ile E13.5 kaynaştırmak için bilateral genişler. Son olarak, tirositler foliküllerinin düzenlemek ve C-hücreleri ayırt.

Tiroid oluşumu üzerinde akım bilgisi temel olarak sabit dokuların histolojik analiz gelmektedir, ancak tiroid oluşumunda rol oynayan morfojenik olaylar yüksek dinamik ve farklı hücre tipleri arasında ve hücre dışı matris ile iletişimi ve etkileşimleri içerir. Son çalışmalar tirosit progenitorlar gelişmekte olan tiroid endotel hücrelerini işe VEGF'nin yüksek düzeylerde üretilmesi, ve buna bağlı olarak, endotel hücreleri folikül oluşumunu teşvik etmek ve C-hücrelerinin farklılaşma ⁷ işe gösterdi.

Tiroid üzerinde en ex vivo çalışmalar hem 2D doku kültürü plastik d yetişen, izole erişkin tiroid kaynaklı hücreler üzerinde yapılmıştırishes veya 3D matrislerde. Bu tür kültürlerin, farklılaşmış foliküler hücreleri polarize kalır ve folikül olarak düzenlenen veya 3D organizasyon ^8-10 reacquire kullanarak. Ancak, fizyolojik bir ortamda eksplante ve 2D kültürlenmiş, bu saf epitel hücreler, hücre dışı matris, sitokinler, büyüme faktörleri ve normal olarak in vivo olarak karşılaştıkları gibi endotel veya sinir hücreleri gibi diğer hücre tipleri ile etkileşimi yok sayar. Çok güzel bir çalışma, son zamanlarda 3D matrigel ¹¹ bir son kültür adımı kullanarak tiroid foliküllerinin ES hücrelerinin bir farklılaşma protokol nitelendirdi. Bununla birlikte, bu 3D kültürler diğer hücre tipleri ile temas yoksundur.

Pankreas ve tükrük önceki uzmanlığa dayalı bir organ kültürü ^12-14, fare embriyonik tiroid Anlagen diseksiyon ve yarı macunsu filtrelerde veya mikroskopi plastik kızaklar üzerinde eksplantlarm için bir yöntem bezleri geliştirilmiştir.

Ne zamanE12.5 embriyolar ile çalışan tiroid anlagen (orta hat anlage ve iki yanal ultimobranchial organları) ikili kökeni dokusunun büyük bir parçasının mikrodiseksiyon empoze. Bu trakea, ancak yemek borusu bulunan ve aritenoid şişme kadar faringeal kemer arterlerden uzatıldı. Filtreler üzerinde kültürlenmiştir zaman yine de dar bir kıstak tarafından bağlanan iki tiroid lobları, meydana getirmek üzere ultimobranchial organlarla sigorta burada, orta hat Anlage, trakea her iki tarafına yatay olarak uzanır.

Kültüründe, epitel hücreler çoğalmaya folikül halinde organize ve kaynağına bağlı olarak, tirositlerin ve C-hücreleri içinde farklılık gösterir. Microdissected dokusunda bulunan endotel hücreleri çoğalır ve son olarak da, bağımsız bir şekilde kan akışının veya dolaşan faktörlerin foliküler epitel yapısı ile yakından ilişkilendirmek için tiroid lobları istila. Eksplantlarının gelişme sadakatle geliştirmek vivo özetlediği gibi,ment, bu kültür sistemi morfogenetik ve tiroid bezi gelişimi sırasında meydana gelen farklılaşma olayları incelemek için en uygunudur.

Tiroid dokular vahşi tip, boşaltma ya da floresan transgenik embriyolardan elde edilebilir, ve kültür sistemi kaybı-ve kazanç-fonksiyon deneyleri elverişlidir. Son olarak, mikroskopi plastik tabaklar üzerinde floresan etiketli tiroid eksplantlarının zaman atlamalı görüntüleme daha iyi in vivo meydana kinetik ve morfogenetik hareketlerin devamlılığını araştırmak için yararlanılabilir. Zaman atlamalı görüntüleme önceden pankreas ^15,16 ya da ¹⁷ ureterik gonca arasında dallanma morfolojilerinden incelemek için kullanılmıştır.

Protokol

Fareler Üniversitesi Hayvan Refahı Komitesi laboratuvar hayvan bakım ilkelerine göre kaldırdı ve tedavi edildi. Tüm prosedürler ve protokoller bu Komitesi tarafından kabul edildi.

1.. Mikroskopi Plastik Kültür Odaları Kaplama

Not: bir laminar akış başlığı içinde steril koşullar altında, aşağıdaki tüm adımları uygulayın. Kaplamanın iki tür işlevsel olarak eşdeğerdir.

1. Fibronektin önce tiroid dokuların izolasyonu için bir gün ile kaplayın plastik kültür odaları:
   1. 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 0.25 ug / ml fungizon ve 2 mM glutamin, ¹² ile takviye edilmiş M199 ortamı içinde bir 50 ug / ml nihai konsantrasyona kadar steril fibronektinin seyreltin.
   2. Seyreltilmiş fibronektinin 200 ul ile kuyu kapağı ve 4 ° C gece boyunca buzdolabında inkübe edin.
   3. Diseksiyon gününde, M1 ile bir kez kuyu durulayın, fibronektin aspire99 ve antibiyotik, glutamin ve% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş M199 200 ul minimum hacim eklemek.
   4. Eksplantlar plaka hazır kadar inkübatör kaplı odaları bırakın.
2. Türü ile kaplayın plastik kültür odaları Ben tiroid dokularında izolasyonu 2 saat önce kollajen:
   1. I 10 mM HCI içinde 50 ug / ml nihai konsantrasyona kadar steril kollajen tipi seyreltin. NOT: buz üzerinde kollajen stok çözüm tutun.
   2. Tip I kollajenin seyreltilmiş 200 ul ile kuyu örtün ve oda sıcaklığında (RT), 2 saat boyunca inkübe edilir.
   3. I çözeltisi kollajen tipi aspire, M199 ile bir kez durulama kuyu ve antibiyotik, glutamin ve% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş M199 200 ul minimum hacim eklemek.
   4. Eksplantlar plaka hazır kadar inkübatör kaplı odaları bırakın.

Tiroid Anlagen içeren Dokular 2. Diseksiyonu (E12.5) veya tiroid lobları (E13.5-e14.5)

NOT: temiz kesme aletleri ve Petri / kültür plakaları kullanın. Aşağıda tarif edilen genel adımlar ve insizyon E12.5 ve E14.5 embriyolar için aynıdır.

1. İstenilen embriyonik (E12.5 itibaren E14.5 için) (e) günlük zaman aşımına gebe dişi fareler Kurban ve diseksiyon aletleri kullanarak rahim kaldırmak.
2. HBSS içeren bir 10 sm'lik plaka içinde parçalara rahim yerleştirin.
3. Forseps ile rahim bir ekstremite tutun ve giderek tüm embriyolar kurtarmak için küçük bir makas ile rahim açın.
4. Makas ile plasenta embriyoların ayırın ve HBSS içeren yeni bir 10 sm'lik plaka içinde kendi Extraembryonic membranlarla embriyolar aktarın.
5. Sarısı kesesi ve amniyon çıkarın. NOT: Bu noktadan itibaren, alttan transillüminasyon ile stereomicroscope altında çalışmak; diseksiyon adımlarla büyütme artmaktadır. Kesme aletleri gibi cam kılcal tungsten iğneler kullanın.
6. Gibi iğneler kullanarakBir bıçak ve çatal, üst çene ve kulak (a boyunca kesilir Şekil 1A) de dahil olmak üzere, başın üst kısmını çıkarmak.
7. Sırtında embriyo tutun ve ilk nöral tüp ilave bir parça (b boyunca kesilir Şekil 1A), embriyo daha sonra alt kısmı, sadece ön bacaklarda altında ve kalp (Şekil 1B) yukarı kaldırın.
8. HBSS içeren yeni bir 10 sm'lik plaka içinde dil (doku yönlendirmek için) ve boyun bölgesini içeren embriyo dilim aktarın.
9. Nöral tüp çıkarın ve dokular (Bir boyunca kesilir Şekil 1C) yemek borusu / trakea posterior.
10. Yavaşça bölüm (b ve b 'birlikte kesme Şekil 1C) dilin her iki tarafın birlikte doku dilim.
11. Dilin uzaması, özefagus ve trakea bulun ve (Şekil 1D bir birlikte kesme), ve bot üzerindeki dokuların şişmesine Aritenoid bırakarak, dil uzak teşrih(b ve b 'birlikte kesme Şekil 1D) yemek borusu / trakea h yanları.
12. Yemek borusu çıkarın ve ventral yüzü yukarı bakacak trakea yerleştirin.
13. Böyle timus (Şekil 1E) ve yutak kemer arterlerin lateral bulunan tüm dokular gibi istenmeyen dokuların uzak teşrih. (Şekil 1F; kırmızı noktalı çizgiler) E13.5 veya E14.5 embriyolar için, trakea her tarafında tiroid lobları görselleştirmek ve daha trakea lobları teşrih.
14. Antibiyotik, glutamin ve% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş, önceden ısıtılmış M199 ortamı ihtiva eden bir 35 mm kültür levhası içine izole edilmiş E12.5 trakea bölge veya E13.5-E14.5 tiroid lobları aktarın. P-200 mikropipet bir önceden filtre ucu kullanarak eksplantlar aktarın. E12.5 eksplantlar için, açılış genişletmek için ucunun ekstremite kesti. NOT: embriyolar aynı genotipi varsa Rutin ve tüm embriyolar üzerinde adımları 6 & 7 gerçekleştirmek,n, 9-11, ve son olarak da 12 ve 13.

Tiroid Eksplantlarından 3. Kaplama ve Kültür

1. Önceden ısıtılmış kültür ortamı, 1 ml ihtiva eden bir 24-yuvalı plakanın üç kuyu ardışık transferi ile eksplantların yıkayın (= M199 antibiyotik, glutamin ve% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiştir).
2. Kaplı mikroskopi plastik kültür odalarına tiroid lobu Kaplama:
   1. Kaplanmış odalarından aspire M199 kültür ortamı.
   2. Dikkatle, bir mikropipet ve filtre ipuçlarını kullanarak kültür odalarına tiroid eksplantlarının aktarın. Her bir bölmenin ortasına bir eksplant yerleştirin.
   3. Aşırı Ortamı çıkarın ve bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde kültür odası yer (37 ° C,% 5 _CO2), 2 saat boyunca, eksplantlar matrise takmak izin.
   4. Yavaşça her kuyuya, önceden ısıtılmış kültür ortamının 200-300 ul ekle.
   5. Doku kültürü inkübatörü içinde, uzun dönemli kültür inkübe edin.
3. Kaplama oyarı macunsu filtreleri f trakea bölge veya tiroid lobu:
   1. Önceden ısıtılmış kültür ortamının 330 ul gereklidir, 24 gözlü bir levhanın gözleri sayısının doldurun.
   2. Kültür filtrenin altında hava kabarcıkları yakalama önlemek için özen ortamında yer filtreler (örneğin 0.4 mikron Millipore filtresi).
   3. Dikkatle, bir mikropipet ve filtre ipuçlarını kullanarak, filtrelerin merkezine (maksimum 4/filter) üzerine orta bir minimal hacimde tiroid eksplantlar aktarın.
   4. Tungsten iğne ile eksplantlardan dışarı orta ve uzayın aşırı çıkarın.
   5. Doku kültürü inkübatörü içinde, uzun dönemli kültür inkübe edin. NOT: laminer akış kaputun altında Change kültür ortamı her gün. 7 güne kadar Kültür eksplantlan.

Tiroid Eksplantlarından 4. Tüm montaj İmmünofloresan Boyama Protokolü

Tungsten iğneler kullanılarak veya (aşağıda 2 adımından sonra) filtreler üzerinde yetiştirilen eksplantlarını bağdakiince forseps ve primer (aşama 5) ve ikinci (basamak 7) antikor inkübasyonunun (96 çukurlu plaka) hariç tüm adımları, için bir 24-çukurlu plaka içinde transferi. Mikroskopi plastik odalarına kültüre yapışık eksplantlanndakinden, kültür odalarında tüm adımları uygulayın.

1. Aspire M199 kültür ortamı, 20 dakika boyunca (24 çukurlu tabak 500 ul ve mikroskopi slaytlar olarak 300 ul), buz soğukluğunda% 4 paraformaldehit (PFA) ile eksplant sabitleyin.
2. Triton ile Tris Tamponlu Salin içinde 2 x 10 dakika yıkayın (TBST, 50 mM Tris HCI pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.1 Triton X-100), oda sıcaklığında karıştırıldı.
3. -20 ° C'de hemen eksplantlarm veya mağaza Süreç Not: -20 ° C de, uzun süreli depolama için, kademeli olarak% 100 metanol ulaşmak için TBST içerisinde metanol konsantrasyonunu arttırarak, metanol içinde eksplantlar kurutmak. Hazır imüno (aşama 4) ile devam etmek için, yavaş yavaş metanol TBST ekleyerek eksplantlar rehidrate.
4. Bloklama çözeltisi (% 10 TBST içerisinde normal keçi serumu ile TBST yerine) Ve oda sıcaklığında, 30-60 dakika boyunca bir deniz testere rocker üzerinde inkübe edilir.
5. (Koşul başına 100-200 ul) çözümü engelleme birincil antikor sulandırmak. 96 oyuklu bir plaka, 24-çukurlu plaka "filtre" eksplantlar aktarın. 4 ° C'de gece boyunca bir deniz testere rocker primer antikorlar ile inkübe eksplantlar
6. Ertesi gün, birincil antikor solüsyonu atın arka bir 24-çukurlu plaka içindeki "filtre" eksplantlar transferi ve 45-60 dakika oda sıcaklığında her biri için bir deniz testere rocker TBST ile en az beş kez yıkayın.
7. Normal keçi serumu,% 1 ihtiva eden TBST içinde sekonder antikor (1:2,000 seyreltmede örneğin keçi anti-X-Alexa Fluor) seyreltilir ve 4 ° C'de ve karanlıkta bir deniz testere rocker gece boyunca bu seyreltme ile eksplantların inkübe edin. Nükleer counterstaining için, birlikte ikincil antikor çözeltisi ile bis-Benzimide (Hoechst) içinde 1 ug / ml içerir.
8. Ertesi gün, ikincil antikor çözüm atmak ve bir deniz gördüm üzerinde TBST'yi 5x yıkayın45-60 dakika oda sıcaklığında her biri için rocker. Yıkama sırasında, karanlıkta eksplantlar tutun.
9. TBST yavaşça karanlıkta 4 ° C'de gece boyunca dönen ek bir yıkama yapın.
10. Postfix 10 dakika boyunca 4 ° C 'de% 4 PFA içinde immunosteyn eksplantlar.
11. TBST ile 2x 10 dakika yıkayın.
12. -20 ° C de, uzun süreli depolama için ya da kademeli olarak metanol içinde% 100 transfer eksplantlar ya da hemen analiz. Filtreler üzerinde kültürlenmiş ve bir 24-çukurlu plaka içinde immunosteyn önce bir multiphoton veya konfokal mikroskobu ile analiz TBST ya da daha iyi floresan montaj ortamı ile bir mikroskopi bölmesi (örneğin LABTEK veya Ibidi) transfer için eksplantlar.

Tiroid RNA 5. Ekstraksiyon

Bir Rnase-serbest ortamda çalışmak. Bu nedenle, nükleik asit ve nükleaz ücretsiz pipet ipuçlarını kullanın ve kirletici ve RNases gelen tezgah ve ekipman hem de temizleyin. Fenol / kloroform dayalı olarak bu protokol, ilk adımı gerçekleştirinKimyasal bir başlık altında (1 ile 7).

1. 1.5 ml tüp için tek kullanımlık bir havan tokmağı kullanılarak RNA ekstraksiyon çözeltisi 300 ul bir eksplant tiroid ya da iki tiroid lobları homojenize. In örnekleri arasında, etanol, daha sonra su, daha sonra,% 2 SDS içinde havan tokmağı yıkayın.
2. RNA ekstraksiyonu çözeltisi başka bir 100 ul, 10 saniye girdap ilave edin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
3. 30 saniye vorteksleyin ve her numune için 20 ng tRNA ekleyin.
4. 1 dakika vorteksleyin ve kloroform içinde 80 ul ekle.
5. Vortex sert biçimde 30 saniye süre ile ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
6. Bir buzdolabında (4 ° C) santrifüjü içinde 19,000 x g'de 15 dakika boyunca Spin.
7. Coprecipitant olarak glikojen 20 ug içeren bir tüpe dikkatli bir şekilde renksiz bir üst sulu faz transfer.
8. Vorteks ve% 100 izopropanol alkol 200 ul ekleyin.
9. 15-30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde Vortex ve 2-3 saat boyunca -20 ° C'de ve 1 saat boyunca -80 ° C'de RNA çökelti sağlar.
10. 19.000 ° C'de 30 dakika boyunca Spin4 ° C'de xg, ve yüzen ortadan kaldırır.
11. Pelet çıkarmak için, soğuk% 75 etanol ve vorteks 450 ul pelet yıkayın.
12. 4 ° C'de 19,000 x g'de 10 dakika boyunca Spin ve supernatant ortadan kaldırır.
13. 5 dakika için kaputun altında pelet kurulayın.
14. RNase-içermeyen su içinde 10 ul ile pelet yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
15. Tahlil RNA konsantrasyonu, -80 ° C'de mağaza veya ters gen ekspresyon analizi için uyarlamak.

Sonuçlar

Tiroid anlages (orta hat ve UB, birlikte çevre dokulara), ve tiroid lobları sırasıyla E12.5 ve e13.5/e14.5 fare embriyoları, (Şekil 1) disseke. Filtre üzerinde kültür bir gün sonra, orta hat anlage trakea üstüne yayılan uzun bir doku olarak (Şekil 2A) görülebilir. Bu giderek trakea her iki tarafında iki lobu oluşturur. Izole tiroid lobları (E13.5 veya E14.5) kültür varsa, bunlar, genişletmek morfolojilerinden ve epitel hücreler makroskopik olarak görülebilen foliküler yapılar (Ş...

Tartışma

Bu çalışma, kesme ve tiroid oluşumuna yol açan karmaşık olay çalışma ve daha iyi anlamak amacıyla, tiroid eksplantlar (E12.5) ya da loblar (E14.5) kültürlenmesi için bir yöntem tarif etmektedir. Nedeniyle tiroid anlagen (orta hat anlage ve iki yanal ultimobranchial organları) ve kendi küçük boyutu, yutak kemer arterlere E12.5 doku lokalize rostral bir parçası, ve trakea içeren, ancak yemek borusu ikili kökeni microdissected edilir. Gösterildiği gibi, dört günlük bir süre içinde, bu kültür sistemi sadık Başlangıcı vi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
&mikro;-slayt 8 kuyu, ibiTreat, doku kültürü tedavi edilmiş, steril	proxylab	80826
Kollajen Tip I, sıçan kuyruğu	Millipore	08-115
İnsan plazmasından fibronektin	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Tungsten tel	Goodfellow LS237450
kültür plakası eki (12 mm çap)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-cadherin	BD Biosciences	610182	1/1.000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261