T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

Summary

Statik yapışma deneyi T lenfositler ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimleri modellemek için kullanılabilecek bir güçlü bir araçtır. Etkileşimler, bir plaka okuyucu seri yıkama aşağıdaki yapışık hücre sayısını ölçmek için kullanılır ise, yapışma molekülleri ile kaplanmış oyuklarına etiketli T hücrelerinin enjekte edilerek üretilir.

Abstract

T lenfosit yapışması enflamasyon ve antijen sunan hücreler ile immünolojik sinaps oluşumu sitelerine göçü de dahil olmak üzere birden fazla T hücre fonksiyonları için gereklidir. T hücreleri, integrinler, ortak hücreler ya da hücre-dışı matrisi üzerinde hedef molekülü ile etkileşim transmembran proteinlerin çiftlerinden oluşan heterodimerik hücre yapışma moleküllerinin bir sınıf yapışkan özelliklerini kontrol ederek düzenlenmiş yapışmasını gerçekleştirmek. En belirgin T hücre integrin olan hedef hücre içi adezyon molekülü (ICAM) -1 alt birimi αL ve β2, oluşan, limfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen (LFA) -1. Yapışmayı kontrol etmek için bir T hücresinin yeteneği bireysel integrinlerin afinite durumlarını düzenleme yeteneğinden kaynaklanır. İç Çıkış sinyali, bir hücre içindeki sinyal integrinlerin dış etki aktive edilmiş bir durumunu almasına neden sayede işlemi tarif etmektedir. Bu karmaşık olayların bilgimizin çok mekanik dayanmaktadırçalışmalar, in vitro model sistemlerinde de basitleştirilmiş uygulandı. Burada anlatılan T lenfosit yapışma deneyi, T hücreleri, statik koşullar altında, molekülleri hedef alan uymak için sağlar ve daha sonra yapışkanlığını ölçmek için bir flüoresan plaka okuyucusu kullanır mükemmel bir araçtır. Bu deney, lenfositler üzerinde hareket yapışma uyarıcı ya da önleyici maddeler tanımlama, hem de söz konusu sinyal olayları için yararlı olmuştur. LFA-1, burada açıklanan halde - ICAM-1 aracılı yapışma; Bu deney hali hazırda başka bir yapışma etkileşimlerinde (- fibronektin örneğin VLA-4) çalışma sağlamak için adapte edilebilir.

Introduction

T lenfosit yapışma bağışıklık tepkisi ¹ temel bir süreçtir. Bu tarama antijen hedef hücreler ² ile lenf düğümleri içinde hücreler (APC) ve immünolojik sinaps oluşumu için (IS) için, endotel hücreleri, kılcal duvarlar dekorasyon ile T hücre etkileşimi için gereklidir. Bu gereksinimler, işlevsel ve kinetik farklıdır. Lenfositler ekstravazasyonunun süreci chemoattraction, haddeleme, sağlam yapışma ve göçü oluşur. Yapışmasını pekiştirmek için yuvarlanmaya geçiş hızlı bir G protein bağlı reseptör sinyaline yanıt T hücreleri gerektirir. Bu yanıt, haddeleme hücre ³ yavaşlatır ve tutuklama bir integrin ligand etkileşimini verir. Integrin aviditede ani bir değişim bu süreci aracılık eder. Göç 'ön uç' de adezyonların oluşumu ve 'arka ucunda' de yapışıklıklar kırılma dinamik etkileşimler betweenTcells ve endotel hücreleri gerektirirbiçimlendirilmiş ve ⁴ kırma arasında yaklaşık bir dakika ara ile. IS inminutes oluşturur, ama saat ⁶ bozulmadan kalması gerekiyor.

İlginç bir şekilde, tek bir yapışma molekülü, integrin ailesi elemanıdır limfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen (LFA) - 1, tüm bu işlemler ⁵ için gereklidir. LFA-1, immünoglobulin süper familyasının çeşitli üyeleri ile etkileşim yoluyla bir yapışmaya neden olur. LFA-1, en yüksek afiniteye sahip en yaygın olarak incelenmiştir ligand arası yapışma molekülü (ICAM) -1. Non-aktive dolaşımdaki lenfositler, bu nedenle, hücre yüzeyi üzerinde LFA-1 ve ICAM-1 kaplı yüzeylerin uygun durumda olan düşük afiniteye ifade eder. LFA-1, değişken afinite ve bu tür G-protein kenetli reseptör aktivasyonu, sitokin stimülasyonu ve T hücre reseptörlerinin (TCR) kaynaklı sinyaller gibi çeşitli sinyal olayları tarafından düzenlenir. LFA-1 hücre dışı alanı, hücre içi aktivasyonu taşır Sonuçta elde edilen yüksek afiniteli bir şekilde tICAM-1 ile hrough etkileşimleri. Bu yol ⁷ sinyalizasyon iç-out denir. Benzer şekilde, hücre dışı alan ikinci LFA-1 ile sinyal dış-in sinyal olarak adlandırılır.

Iç-dış ve sinyalizasyon dışarıdan katılan sinyal basamaklarının içi mevcut araştırmaların önemli bir odak noktası vardır. Küçük GTPaz Rap1 son zamanlarda TCR ligasyonu ve ⁸ sitokin sinyal için ortak olan sinyalizasyon iç-out anahtar bileşeni olarak ortaya çıkmıştır. T hücre yapışma baskın negatif Rap1 ⁹ ekspresyonu ile bloke edilir ise integrin aktivasyonu Rap1 kritik rolü, Rap1 aşırı ifadesi T hücreleri integrin bağımlı yapışmayı teşvik keşfi ile vurgulanır. Rap1 tarafından integrin düzenleme anlayışımızda bu gelişmeler vitro araçları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bunlar arasında Burada açıklanan yapışma deneyidir.

Bu yöntemin genel amacı T incelemektirICAM-1 kaplı yüzeylere hücre yapışma. Daha özel olarak ise, bu ölçmenin ve farklı koşullar altında, gerçek zamanlı canlı hücrelerde, karşı ligandları doğru LFA-1 afinite ölçmek için kullanılır. Bu teknik, T hücreleri ile etkileşime hücre yüzeyleri taklit etmek için ICAM-1 ile kaplanmış polistiren kuyu kullanır. Pek çok daha önce tarif edildiği statik T hücre yapışma deneyleri, deneysel karmaşıktı. Genellikle T hücreleri için gerekli Bu deneyler, radyoaktif etiketli T hücre yapışması için alt-tabaka olarak hücre dışı bir matris oluşturmak için kültürlenmiş sığır kornea hücreleri kullanılmaktadır, ya da T hücre yapışmasını ¹⁰ desteklemek için uzun bir süre boyunca fizyolojik olmayan, T hücresi uyarımı için çağrılacak. Diğer birçok deney sistemlerinde ¹¹ kullanılan gibi, akış sitometrisi ve mikroskopi ile karşılaştırıldığında yapışma, inkübasyonu takiben T hücresi sayısını bulmak için florometrik ölçüm kullanılması miktarının daha hassas ve kesin bir yöntemdir. Buna ek olarak, tek bir hücre mikroskopintegrin lokalizasyon ic analizi fluorometrik ölçümü ile aynı şekilde geniş, nüfus tabanlı analiz için izin vermez. Aktivasyon durumu spesifik LFA-1 antikorlar, ticari olarak mevcut olmakla birlikte, bu antikorlar, burada tarif edilen yönteme göre düşük duyarlılık sunmaktadır. Alternatif teknikler üzerinde ana avantajı sadeliği ve aynı anda birden fazla deneysel koşulları incelemek için yeteneğidir. Belirli bir uygulama için bu yöntemi göz önüne alındığında, bir T hücreleri olumsuz, seçilmiş taze izole edilmiş ve bir floresan işaretleyici ile etiketlenmiş gerektiğini dikkate almalıdır.

Protocol

1.. Mikroplate Wells Kaplama

Not: Bu adımın amacı T-hücresi LFA-1 için ligandlar olarak hizmet etmek için ICAM-1 ile kat polistiren yüzeylere etmektir.

1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
   1. Resuspending kaplama solüsyonu hazırlayın rekombinant ICAM-1, kalsiyum (1 mM zenginleştirilmiş fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi (137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO _4, pH 7.4) ile _CaCl2) ve magnezyum (2 nM _MgCl2). ICAM-1'in son konsantrasyonu 0.7 mg / ml stok çözeltisi yapılmış ve -80 ° C dondurucuda tutuldu 10 ug / ml, olduğundan emin olun.
   2. % 0.5 insan (veya bovin) serum albümini (HSA / BSA), 2 mM _{MgCI2 ve} 1 mM _CaCI2 ile PBS zenginleştirerek yapışma çözelti hazırlayın.
   3. PBS ile 2 mM _MgCl2 ve 1 _mM CaCl2 eklenerek yıkama çözeltisi hazırlayın. 37 tüm çözümler ısınmakKullanmadan önce C °.
2. Yıkama çözeltisinin 50 ul ile 24 kuyu yıkayın. Bu yıkanmamış kuyu, pozitif (PMA tedavi hücreleri) ve negatif (kaplanmamış kuyuları) kontrolleri içerecektir. Her koşul en az üç kuyu (üçlü) set için.
3. Her bir oyuğa kaplama solüsyonu 50 ul ekle. Kaplanmamış kontrol kuyulara katmayın. 37 ° C inkübatör içinde bir saat boyunca inkübe edin.
4. Ucu kuyuların alt dokunmasına izin vermeden, nazikçe kaplama çözüm aspire. Yıkama çözeltisi, 50 ul bir kere yıkayın.
5. Yapışma çözeltisi 50 ul ilave edin ve 37 ° C inkübatör içinde bir saat için mikroplak inkübe edin.
6. Yavaşça aspire ve 50 ul yıkama çözeltisi ile yıkayın. Ancak bu gece boyunca 4 ° C'de tutmak mümkündür, aynı gün plaka kullanarak, ve ertesi gün kullanın.

Blood 2. T Hücre İzolasyonu

1. 50 ul / ml o insan T hücresi zenginleştirme kokteyl eklemef tam kan (antikoagülan, 3 ml (heparin, EDTA veya sitrat) tam kan, örneğin kokteyl 150 ul ekle). İyice karıştırın.
2. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
3. 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne 3 ml işlenmiş kan ve oda sıcaklığında% 1 D-glükoz ile zenginleştirilmiş bir (kalsiyum ve magnezyum olmadan) PBS eşit hacimde. Pasteur pipeti ile yavaşça karıştırın.
4. Santrifüj tüpüne 15 ml Ficoll-Paque PLUS ekleyin.
5. Dikkatle lenfosit izolasyon ortamında kan örneği seyreltilmiş 6 ml katman.
6. Ara kapalı olarak 20 ° C'de 20 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
7. Arayüzde bozulmamış lenfosit tabakası bırakarak temiz bir Pasteur pipeti kullanarak üst katman kapalı çizin. Plazmanın üst tabakası daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Temiz bir Pasteur pipeti temiz bir santrifüj tüpüne lenfosit katman transferi kullanma.
8. Lenfositlere karşı PBS 3 hacim (9 mi) ilave edin. Hafifçe hücreleri tarafından askıya drakanat onları ve bir Pasteur pipeti dışarı.
9. 20 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje
10. Süpernatant kaldırmak. Lenfositler şimdi uygulama için uygun bir ortam içinde süspansiyon gerekir. 20 ml bir T-75 kültür şişesine transfer hücreleri,% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin içeren RPMI 1640 ortamı.

Hücreler 3. Hazırlanması

Not: hücreler, bir flüoresan tepkime maddesi ile etiketlenmiş edilmesi için bir ön şarttır. Bu protokolde ifade eden hücreler kabul edilebilir bir alternatiftir karboksi floresan süksinimidil ester (CFSE), bununla birlikte, yeşil flüoresan protein (GFP) kullanın.

1. Hemasitometre kullanarak 2,4 x 10 ⁶ T hücrelerini (her bir kuyu için 1 x 10 ⁵⁾ saymak.
2. Serumu (serum açlık) eksik kültür ortamı hücreleri tekrar süspansiyon. 37 ° C bir inkübatörde 2 saat boyunca inkübe hücreleri.
3. 5 dakika (400 xg) için hücreler santrifüj. Medya ve aspire1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon haline getirin.
4. 1:1000 seyreltme (5 mM yapılan stok) CFSE ekleyin. Işıktan örtün ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca inkübe edin.
5. 37 ° C PBS ile 10 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun ve 5 dakika boyunca 400 x g 'de dönerler.
6. Önceden ısıtılmış yapışma çözeltisi (50 ul başına 1 x 10 ⁵ hücre) 1.2 ml hücre pelletini yeniden askıya.

Hücreler 4. Uyarılması

Not: yapışma başlatmak için, hücreler teşvik edilmelidir. Aşağıdaki deneyde hücreler, anti-CD3 antikorları ile çapraz bağlama, TCR ile uyarılır, ancak çözünebilir SDF-1, alternatif olarak hizmet verebilir. Deneylerin amacına bağlı olarak, çeşitli farmakolojik reaktifler hücre yapışması üzerindeki etkilerini incelemek için stimülasyon öncesi veya sırasında ilave edilebilir. Phorbol myristate asetat (PMA), ikinci haberci diasil gliserol (DAG) ile yapısal olarak benzer olan ve bu nedenle çok sayıda kinaz aktifleştiren bir forbol ester,alt TCR (özellikle protein kinaz C) s; burada bir pozitif kontrol olarak kullanılır.

1. 37 ° C'ye ısıtın mikroplak
2. 8 1.5 ml boş boruların (her bir tüpe 150 ul), her bir durum için, bir tüp içine hücreleri bölün.
3. Buna göre hücreleri tedavi:
   1. Pozitif kontrol olarak hizmet etmek için 10 ng / ml PMA ile bir tüp teşvik. Uyarılması için kontrolü ("Hiçbir uyarım"), yıkanmamış yükleme kontrol ("hiçbir yıkama") ve ICAM-1 kaplama için kontrol ("kaplanmamış") olarak hizmet etmek, işlenmemiş üç tüpleri tutun.
   2. Anti-CD3 antikorlarının farklı konsantrasyonda (0.1, 1, 5, ve 10 ug / ml) ile dört tüp teşvik. Gecikme olmadan sonraki adıma devam edin.
4. De her boş içine uyarılmış hücre karışımı aliquot 50 ul. Göz başına hücre nihai sayısı 1 x 10 ^5'tir.
5. 15 dakika boyunca 37 ° C inkübatör mikroplak yerleştirin.
   Not: Bazı T hücre hatları kısa uyarıdan gerektirir tion zaman. Bu süre içinde, hücreler kuyu dibine yerleşmek ve hedef ligandlara bağlı.

5. Yıkama takım Yapışkan olmayan hücreler

Not: Bu adımın amacı ligand kaplı yüzeyler ile sıkı bir temas oluşturmak için mümkün değildi hücreleri kaldırmaktır. Aynı fiziksel kuvvetler tüm oyuklara uygulanmasını sağlamak amacıyla, bu aşama için, çok kanallı bir pipet kullanın. Bu yapışık hücre yüzdesinin hesaplanmasında yardımcı olmak için yıkanmamış belirtilen kontrol kuyuları tutmak önemlidir.

1. Her kuyu için, sıcak yapışma çözeltisi 150 ul ekle. Kuyulardan orta çıkarmadan önce birkaç saniye hafifçe plakayı sallayın. Ipuçları ile kuyuların dibine dokunmayın.
2. Bu adımı üç kez tekrarlayın. Tamponu ve dışarı pipetlerken pipet yönünü değiştirin.

6.. Yapışık hücrelerin yüzdesini belirlemek

_content "> Not: Bu adımda, bir floresan plaka okuyucu içinde her bir floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılan yoğunluk yapışık hücrelerin sayısı ile doğrudan ilişki içindedir..

1. Plaka okuyucusu açın. Masaüstünde kısayol simgesini tıklatarak plaka okuyucu yazılımı açın.
   1. "Görev" menüsünden yeni bir protokol kurmak için "Yeni" butonuna tıklayınız.
   2. "Eylemler" menüsünden "Oku" seçeneğini seçin. "Floresan yoğunluğu" ı tıklayın ve "Tamam" sekmesine tıklayın.
   3. Menüsünden açılan "Uyarma dalga boyu 485" ve "Emisyon dalga boyu 528" seçeneğini seçin. "Tamam" sekmesine tıklayın.
   4. "Optik" seçeneği menüsünde "Bottom" seçin ve "Tamam" sekmesine tıklayın. Geri "Eylemler" menüsüne gidin ve 37 ° C sıcaklığına ayarlamak ve "Tamam" a tıklayın.
   5. Plaka okuyucu içine mikroplağı yerleştirin ve"Çalıştır" a tıklayın. Sonuç excel elektronik tablo halinde ihraç edilecek.
2. Aşağıdaki formül kullanılarak yapışkan hücrelerin yüzdesini hesaplayın: yapışık hücre yüzdesi = (yıkandı kuyularda oku ortalama floresan yoğunluğu) / (yıkanmamış hücre oku ortalama floresan yoğunluğu) x% 100.

Results

Aşağıdaki, anti-CD3 antikorlarının çeşitli konsantrasyonları ile uyarılmış T-hücreleri, primer yapışma deneyinin bir örnektir. Bu yıkanmamış hücrelerin floresan (yani toplam yükleme) bilmek yararlıdır. Stimüle edilmemiş hücreler bir negatif kontrol olarak hizmet etmek ve PMA ile muamele edilmiş hücreler, anti-CD3 antikorları için pozitif kontrol edilir. Kaplanmamış kuyularda kaplı hücreler, ICAM-1 için bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Uyarılmamış hücre yüzdesi% 10 ila% 5 arasında iken Tipik bir deneyde ya...

Discussion

LFA-1 aktivasyonu ve T hücre yapışmasının ¹² sinyalleri çalışma için çeşitli tahliller vardır. Akış sitometrisi bükülmüş ya da LFA-1 ya da genişletilmiş seçici olarak bağlanan monoklonal antikorlar kullanılarak canlı hücreler içinde LFA-1 afinite durumlarını ölçmek için kullanılır. Bu yöntemin sınırlamaları biri dikkate İntegrinler 'avidite almaz olmasıdır. Göç deneyleri yararlı araçlardır ama onlar belli bir zaman noktasında cimri yapışma değil göç ölçmek, ve. T lenfosit göçünü (örn. deri aşırı ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaka okuyucu	BioTek	Synergy H1 Hibrit
pipet	Fisher	21-377-829
Optik tabanlı 96 oyuklu mikroplaka	Corning Costar	3603
Rekombinant ICAM-1	R& D Sistemleri	ADP4-050
Anti-CD3 antikorları	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
CFSE	Moleküler Problar	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
Kalsiyum ve magnezyum	Gibco	içeren DPBS
Periferik lenfositler	örneğin fare veya insan
Magnezyum klorür	Sigma-Aldrich	M8266
Kalsiyum klorür	Sigma-Aldrich	499609
Open Gen 5 yazılımı	BioTek	Sürüm 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Sağlık	71-7167-00
15 ve 50 ml santrifüj tüpleri	Fisher	352099, 352070
Tek kullanımlık plastik Pasteur pipetleri	Fisher	13-711-7M
T-75 kültür şişeleri	Fisher	50-754-1366
RozetSep T hücre zenginleştirme kiti	Kök Hücre Teknolojileri	15061