Bu makale FRET kullanarak canlı hücreler glutamin dinamiklerini izlemek için nasıl gösterecektir. Genetik olarak kodlanmış sensörler hücrealtı çözünürlükte biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. Deneysel tasarım, deneysel ayarları teknik detayları ve post-deneysel analizler için düşünceler genetik olarak kodlanmış glutamin sensörler için ele alınacaktır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Genetiği Kodlanmış Sensörleri kullanarak glutamin Akı Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Genetik olarak kodlanmış sensörler hücrealtı çözünürlükte biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. Biyolojik moleküller için bu tür sensörler muazzam çeşitliliği birçok laboratuvarda rutin kullanılan vazgeçilmez araçları haline bazıları, son 15 yıl içinde kullanılabilir hale geldi.
Genetik olarak kodlanmış sensörlerin verici uygulamalarından biri hücresel nakil işlemleri araştıran bu sensörlerin kullanılmasıdır. Böyle kinetik ve zemin özgünlükleri gibi taşıyıcıların özellikleri taşımacılık faaliyetlerinin hücre tipi özel analizler için olanakları sağlayan, bir hücresel düzeyde incelenebilir. Bu yazıda, taşıyıcı dinamikleri bir örnek olarak genetik olarak kodlanmış glutamin sensörünü kullanarak görülebilir nasıl gösterecektir. Deneysel tasarım, deneysel ayarları teknik detayları ve post-deneysel analizler için hususlar ele alınacaktır.
Giriş
Nedeniyle hücresel düzeyde transcriptome ve proteomun incelenmesini sağlar teknolojilerindeki olağanüstü ilerleme için, artık biyokimya ve metabolitleri ve iyonların çıkan akı yüksek hücre türüne özgü olduğu açık hale gelmiştir. Örneğin, memeli karaciğer, ardışık glutamin bozulması ve sentez ikinci 1-3 aşırı amonyak tüketirken eski bir hücre tipinde üre döngüsü amonyum besleme sırasıyla periportal hücreleri ve perivenöz hücreleri ile aynı anda gerçekleştirilmektedir. Bazı durumlarda, önemli biyokimyasal heterojenite da tek bir "hücre tipi" 4, 5 içinde tespit edilir. Mekansal özgüllük ek olarak, metabolitlerin ve iyonların hücre seviyeleri (örneğ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. Numune Hazırlama
Not: Birçok durumda perfüzyon deneyleri sinir bozucu bir sorun haline, hangi hücrelerin önemli bir kısmını silsin. Poli-L-lizin ile tüm hücre hatları, kaplama, cam yüzeyler için kapak (yüzeye% 0.01 çözelti 1.0 ml/25 cm 2 eklemek gerekli değildir, ancak, hücre kültürü dereceli su ile iki kere yıkayın,> 5 dakika inkübe edilir, ve kuru biyogüvenlik kabini) hücre yapışmasını artırır. Ayrıca, kullanılan hücre hattının biyogüvenlik düzeyi (BGS) farkında olmak ve yerel çevre, sağlık ve güvenlik ofisi tarafından onaylanan standart işletim prosedürü izleyin. Bu deneyde, COS7 hücreleri (bkz. Şekil 4) b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tipik zaman süreçli deneyler, Şekil 2 de temsil edilmiştir., Bu deneylerde, 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, Şekil 2A ve 2B) ve 100 uM (FlipQTV3.0_100 μ C ve D) afinitelere sahip glutamin FRET sensörler ile birlikte ifade edildi COS7 hücreleri 10 zorunlu bir amino asit değiştirici ASCT2 18. Glutamin akını verici (mTFP1) ile alıcı (venus) (Şekil 2A ile 2C) arasındaki flüoresan yoğunluğu oranlarında değişiklik olarak tespit edil.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Görüntüleme deneylerin başarısı birkaç kritik faktöre bağlıdır. Bu faktörlerden biri yukarıda ele alındığı gibi, kullanılan sensörlerin eğilimidir. Ilgi konusu hücre içi bölme içindeki alt-tabakanın mutlak konsantrasyon, ancak, genellikle bilinmemektedir. Bu nedenle arzu edilen deneysel koşul altında en uygun olanı bulmak için kaydırılmış afinitelerle çoklu sensör denemenizi öneririz. Örneğin, bizim durumumuzda 1.5μ ile glutamin sensörleri ile transfekte edilmiş COS7 hücreleri, 100μ, 2m ve 8m (Şekil 3 v.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH hibe 1R21NS064412, NSF hibe 1052048 ve Jeffress Memorial Trust hibe J-908 tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ters floresan mikroskop | Olympus | IX81F-3-5 | Diğer tedarikçilerden eşdeğer bir ters floresan mikroskobu da uygun olacaktır. |
| Uyarma filtresi (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | Bant genişliği 450-460 nm |
| Uyarma filtresi (Venüs) | Chroma | ET500/20 | Bant genişliği 490-510 nm |
| Emisyon filtresi (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | Bant genişliği 475-505 nm |
| Emisyon filtresi (Venüs) | Chroma | ET535/30m | Bant genişliği 520-550 nm |
| Dikroik ayna (FRET kanalları) | Chroma | 470dcxr | Uzun geçiş, 470 nm kesilmiş |
| Dikroik ayna (YFP kanalı) | Chroma | 89002bs | Geçer 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm |
| mCherry filtre seti | Chroma | 49008 | Uyarma 540-580 nm, 585 nm kesikli uzun geçişli dikroik, emisyon filtresi 595-695 nm |
| Işık kaynağı | Olympus | U-LH100L-3-5 | Sabit ışık yoğunluğu üreten LED veya halojen ışık kaynağı, cıva lambaları önerilmez |
| CCD kamera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| Apokromatik floresan objektif | Olympus | ||
| Perfüzyon sistemi, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Hızlı çözelti değişimine izin veren diğer perfüzyon sistemleri de işe yarayacaktır |
| Laminer akış odaları | C & L Instruments | VC-MPC-TW | Diğer larminar akış odaları da işe yarayacaktır. |
| Odacıklı slayt | Lab-Tek | 154534 | Açık odacıklı deneyler için |
| Perfüzyon pompası | Thermo Scientific | 74-046-12131 | Açık |
| odacıklı deneyler için Oransal ölçümleri destekleyen yazılım | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminer akışlı biyogüvenlik kabini | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 İnkübatör | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco'nun MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Kozmik buzağı serumu | Hiklon | SH3008703 | |
| Penisilin/streptomisin | Hyclone | SV30010 | |
| Transfeksiyon için serumsuz ortam (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Lipofektamin 2000 ile birlikte kullanılır |
| Poli-L-Lizin çözeltisi | Sigma | P4707 | |
| 25 mm dairesel cam kapak kızağı | Thermo Scientific | 12-545-102 | VC-MPC-TW kullanılması durumunda |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Diğer transfeksiyon reaktifleri de kullanılabilir. |
| Çözelti A (Hank'in tamponu) | 9.7 g HANK tuzu (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES ila 1 L, pH NaOH ile 7.35'e ayarlandı | ||
| Çözelti B | Çözelti A + 0.04 mM Gln Çözelti | ||
| C | Çözelti A + 0.2 mM Gln | ||
| Çözelti D | Çözelti A + 1 mM Gln | ||
| Çözelti E | Çözelti A + 5 mM Gln | ||
| Çözüm F | Çözüm A + 5 mM Ala |
Kaynaklar
- Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
- Haussinger, D. Hepatic glutamine metabolism. Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).
- Watford, M., Chellaraj, ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
