Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İlköğretim Rat Yenidoğan kardiyomiyositlerin Canlı Hücre Görüntüleme Adenoviral izlenerek ve Lentiviral İletimi Confocal Disk Mikroskopi Spinning kullanma

13.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51666

⸱

24 Haziran 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Molecular Biomedicine and Institute of Cell Biology, 2Department of Internal Medicine, Yale Cardiovascular Research Center and Section of Cardiovascular Medicine

Bu makalede

Özet

Bu protokol, konfokal eğirme disk mikroskobu kullanılarak lentiviral ve adenoviral transdüksiyonu takiben primer sıçan neonatal kardiyomiyositleri kullanılarak canlı hücre görüntüleme yöntemini tanımlar. Bu, canlı kardiyomiyositlerde hücresel süreçlerin ayrıntılı gözlemlerini sağlar.

Özet

Kolayca tek bir işlem içinde çok sayıda izole edilebilir, çünkü Birincil sıçan neonatal kardiyomiyositlerde vitro Kardiyovasküler araştırmalarda temel yararlıdır. Nedeniyle mikroskop teknolojisindeki ilerlemeler bu hücrelere fototoksisite ilişkin en az endişe ile gerçek zamanlı olarak hücresel olayları araştırmak amacıyla canlı hücre görüntülerini yakalamak için nispeten kolaydır. Bu protokol hücrenin özelliklerini modüle Lentiviral ve adenoviral transdüksiyon izleyen bir konfokal dönen disk mikroskop kullanılarak primer sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin canlı hücre timelapse görüntüleri çekmek için nasıl açıklar. Virüs iki farklı uygulama daha kolay iki farklı genler için uygun bir iletim hızı ve ekspresyon seviyelerini elde etmek için yapar. Peki odaklı canlı hücre görüntüleri uzun süreler boyunca istikrarlı odak tutar mikroskop otofokus sistemi kullanılarak elde edilebilir. Bu yöntemde, dışsal mühendisinin işlevlerikültürlenmiş primer hücrelerde ifade ed proteinlerin analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu sistem siRNA'lar kullanımı yoluyla hem de kimyasal modülatörlerinin genlerin fonksiyonlarını incelemek için kullanılabilir.

Giriş

İlköğretim sıçan yenidoğan kardiyomiyositler uzun vitro 1 kardiyomyosit fonksiyonlarını araştırmak için kullanılmıştır. Onlar birkaç iyi kurulmuş yöntemlerle 2-4 sıçan yavrular izole etmek kolaydır. En yaygın yöntem kolajenazı önce veya hücre izolasyonu için kalbin bağ dokusu sindirmek için tripsin kullanır. Araştırmacılar ayrıca yetişkin kemirgenler 5-8 yanı sıra yenidoğan farelerin 9,10 dan kardiyomiyositlerin izole etmek için yöntemler geliştirmişlerdir.

Bu protokol, iki aşamalı bir prosedür kullanılarak enzim sindirimi, neonatal sıçan yavrularından kardiyomiyositlerde izole edilmesi için bir yöntem tarif eder. Tripsin ilk 4 ° C 'de O / N el ve 37 ° C sıcaklıkta ve sonra saf bir kolajenaz 4 ° C'de tripsin O / N, kalp dokusu inkübasyonu sıcak bir enzim solüsyonu 2 ardışık inkübasyonlar kullanan yöntemleri ile karşılaştırıldığında hücre hasat için gerekli adımları azaltır. Buna ek olarak, saflaştırılmış co kullanarakllagenase daha basit bir enzimlere göre, çok partiye değişkenlik dolayısıyla daha tekrarlanabilirlik sağlayan, elimine edilebilir.

, Belirli bir proteinin fonksiyonel çalışmalar, genellikle bir adenovirüs 11-13 ve / veya 14-16 lentivirüs kullanarak bir protein ifade sistemi kullanır. [Uyarıcı not] viral üretim ve manipülasyon NIH talimatlarına göre yapılmalıdır.

Adenovirüs konakçı genomu içine entegre değildir. Bu bölünen hücreler ve bölünmeyen hücreleri de dahil olmak üzere pek çok hücre tipi, hem birincil hücre ve hücre serileri de transdüksiyon çok yüksek bir etkinliğe sahiptir. Bu, adenovirüs gen ifadesi için güvenilir bir vektör sağlar. Adenovirüs vektörü tarafından kodlanan proteinin yüksek seviyeleri transdüksiyonu takip eden 48 saat içinde gelişir ve bunlar birkaç hafta 17 sürebilir. Bununla birlikte, protein ekspresyonu için bir adenovirüs kullanımının bir dezavantajı olduğu bir yeniden birleştirici ade geliştirilmesiAdenovirüs karmaşık ve zaman alıcı hem de. Birçok araştırmacı rekombinant gen ifadesi için Lentivirüslerden dönüm edilmiştir neden bu dezavantajı kısmen açıklıyor. Adenoviral yapıları aksine, bir lentiviral yapı üreten hızlı ve kolaydır. Lentivirüsler genellikle her iki bölme ve bölünmeyen hücrelere adenovirüs daha düşük transdüksiyon verimliliği, sahip olmakla birlikte, bunlar bir konakçı genom içine entegre yok. Sonuç olarak, kalıt aktarılan genin ifadesi için adenovirüsler daha lentivirüsler daha kararlıdır.

Nedeniyle mikroskopi alanındaki teknolojik gelişmeler, bu rekombinant proteinleri ifade eden hücrelerin, canlı hücre görüntülerini yakalamak için çok daha kolaydır. Bu bile edinimi video oranı hızlarda geçerlidir. Bu durum araştırmacı ilgilenilen proteinin, özellikle işlevsel değişiklikler, gerçek zamanlı olarak etki hücreyi belirlemek için izin verir. Konfokal dönen disk mikroskop o liv için optimal bir tekniktir yapmak birçok önemli özelliklere sahiptirE hücre görüntüleme 18,19. Aynı anda nokta tarama konfokal mikroskoplar çok daha az lazer güç kullanırken Yokogawa eğirme disk, çok daha hızlı görüntü elde etmek için izin verir. Bu özelliklerin her ikisi de lazer örnekler aynı zamanda geçtiği çok sayıda eş odaklı delik içeren dönen bir disk, kaynaklanmaktadır. Satın alma sırasında disk kendisini hızla ve sürekli olarak 18-20 spin. Mikroskop otofokus sistemi kullanarak, istikrarlı odak uzun süreler boyunca devam edilir. Bu araştırmacılar, iyi odaklanmış canlı hücre görüntü almasına izin veriyor. Edinsel Görüntülerin bir film dosyası olarak oynatılır. Görüntüleri, ImageJ 21,22, FIJI 23 ya da başka ticari olarak temin edilebilen yazılımı gibi görüntü analizi yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin 1. İzolasyon

  1. Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) ve kültür ortamı olarak fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin / streptomisin (P / S) ile takviye edilmiş minimum temel ortam (MEM) kullanın. Izolasyon sonraki ilk 2 gün boyunca fibroblastların büyümesini önlemek için ortama bromodeoksiuridini (BrdU) ilave edin.
Taban ortamı FBS BrdU (mM) P / S (U / ml)
seçim DMEM % 10. 0 20
İlk gün DMEM % 10. 0.1 10
Ertesi gün DMEM / MEM % 5 0.1 10
Bundan başka kültürü DMEM / MEM % 5 0 10

Tablo 1:. Sıçan neonatal kardiyomiyosetlere Orta sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin kültürleme için bu ortam kullanın. DMEM / MEM, DMEM ve MEM ortamının 01:01 karışımıdır.

  1. Kardiyomyosit izolasyon, 1. Gün (Tahmini gereken süre, yaklaşık 1 saat)
    NOT: neonatal kemirgenler ile çalışma için, hayvan bakım programları tarafından belirlenen yerel üniversite kurallar ve kurallara başvurmak ve kurumsal olarak onaylanmış hayvan protokollere uygun. Bu protokol açıklanan tüm yöntemler Yale Hayvan Kaynak Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
    1. Reaktifler ve araçları hazırlayın: kalsiyum ve magnezyum içermeyen Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS CMF), 30 ml x 2, 10 ml x 2, buz üzerinde; Buz üzerinde CMF HBSS 2 ml ile yeniden 1 mg tripsin; araçları otoklave % 70 250 ml çanak içinde etanol (EtOH); dört adet 10 cm plastik tabaklar, kalplerin izolasyonu için üç ve tripsinleme için bir sterilize.
    2. Sipariş 1 Littdeneysel hayvan distribütör kendi baraj ile 1-to-2-günlük fare yavrularının (yaklaşık 10 yavrular) arasında er.
    3. Gün1, küçük kafes yavrular aktarın ve ketamin / ksilazin kokteyl (Ketamin, 200ml/10g ve ksilizin 20ml/10g) doz aşımı ile baraj euthanize.
    4. Bir yavru almak ve% 70 EtOH ile tüm vücut sterilize. Diğer yavrular izole bir yerde steril bir 10 cm plastik tabak bakımlı keskin cerrahi makas ile yavru işten çıkarmak.
      Not: kısa sürede örnekleri toplamak için, bu kemirgen ömrünü sona erdirilmesi için en hızlı ve etkili bir yöntem kullanmak en iyisidir. Düzgün bakımlı ekipmanları ile uzman profesyoneller tarafından kullanılan Decapitation hayvan için daha az korku ve kaygı neden ve ötenazi diğer formları daha hızlı ve pratik olabilir. Bu Hayvanların ötanazi Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Yönergeleri tavsiyeleri ile uyumludur.
    5. Kaldır he dayaksterilize araçları ile sanat, ve 50 ml konik tüp içinde 30 ml buz soğutulmuş CMF HBSS'de kalp koydu. NOT: Mümkün olduğunca çabuk kalpleri çıkarın ve hemen buz üzerine koydu. Vücuttan kalbini çıkardıktan sonra, tüm işlemler buz üzerinde yapılmalıdır.
    6. Buz soğutulmuş CMF HBSS, 30 ml soğutulmuş ve buz CMF HBSS başka bir 30 ml geri kalan 5 kalplerinde 5. kalpleri toplayın. Kalpleri durulama tüp girdap. NOT: Bu aşamadan sonra, bir laminar akış başlığı içinde bütün işlemleri gerçekleştirmek.
    7. Süpernatantı atın ve buz üzerinde yeni bir steril 10 cm plastik tabak için kalpleri aktarın. NOT: aspiratör ile aspire kalpleri için dikkatli olun.
    8. Büyük gemiler ve / veya istenmeyen dokuları kaldırmak. Kalpleri durulama çanak buz soğutulmuş CMF HBSS 10 ml ekleyin.
    9. Buz üzerinde yeni bir steril 10 cm plastik tabak için bütün kalpleri aktarın. Buz üzerinde en az 1 mm ila 3 makas ile kalpleri kıyma.
    10. Soğutulmuş CMF HBSS 9 ml ekleyin. Soğutulmuş tripsin reconsti 1 ml ekleyinCMF HBSS (son 50 ug / ml) ile ikâmeli.
    11. Parafilm çanak Seal ve alüminyum folyo ile örtün, sonra soğuk bir odada (4 ˚ C) o gecede yerleştirin.
  2. Kardiyomyosit izolasyon, 2. Gün (Tahmini gereken süre, yaklaşık 4 saat)
    1. Hazırlayın reaktifler ve araçları: 50 ml konik tüp x 2; Buz üzerinde CMF 1 ml HBSS ile yeniden 2 mg tripsin inhibitörü; Oda sıcaklığında (RT) Leibovitz L-15, 5 ml ile yeniden 1500 tane kolajenaz; Leibovitz L-15, steril 1 litre su ile tekrar oluşturulmuş ve bir 0.22 mikron filtre, oda sıcaklığında 8 ml geçirilerek filtre edilmektedir; Su içinde 10 mg / ml (32.6 mM) BrdU; P / S; DMEM +% 10 FBS; MEM; iki adet 10 cm plastik hücre kültürü yemekleri; 3.5 cm cam alt yemekler.
    2. Day2, jelatin kaplı yemekler hazırlanıyor. Kaplamak için bir görüntüleme deney için, 3.5 cm cam alt çanak% 0.1 jelatin çözeltisi 1 ml ilave edilir. Daha sonra aspire ve kullanımdan önce jelatin solüsyonu atın, birkaç saat boyunca 37 ° C'de ˚ yemekler inkübe edin.
      HAYIRTE: 3,5 cm cam alt tabak bir flüoresan mikroskop kullanılarak bir görüntüleme deney için uygundur. Western blot (WB) ile protein ekspresyonunu tespit etmek için birinci kardiyomiyositlerde proteinlerin ekstre edilmesi için,% 0.1 jelatin kaplı plastik hücre kültürü tabakları kullanılabilir.
    3. Steril kaputu buz üzerinde bir 50 ml konik tüp tamponla gece boyunca tripsin ile sindirilmiş bütün kalp dokusu aktarın. CMF HBSS tripsin inhibitörü 1 ml (son 182 ug / ml) eklenir. 50 ml konik tüp yakın kapak sıkıca bulaşmasını önlemek için.
    4. Doku ısınmaya bırakılmış ve 30-37 ˚ C'ye tampon için 37 ˚ C inkübatör içinde yaklaşık 30 dakika boyunca inkübe edin Tüpü Leibovitz L-15 olarak 5 ml kollajenaz (nihai 94 birim / ml) eklenir. Yumuşak (37 ˚ C kuluçka makinesi içinde 170-200 rpm çalkalama) çalkalama ile 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ˚.
      Not: Bu adım laminar akış başlığı dışında yapılabilir. Tüm takip eden aşamalar oda sıcaklığında yapılmalıdır.
    5. % 70 EtOH ile 50 ml konik tüp dışında dezenfekte edin ve koyunsterilize kaput o.
    6. 20 kez hız 3 ml / sn pipetleme ile otomatik pipet kullanarak öğütün dokular. Doku kalıntısı 70 um hücre süzgeç ile süpernatant 3 dakika dinlendirilir ve filtre için izin verin.
      Not: A normal boyut 10 ml pipet toz haline getirme için kullanılabilir.
    7. Kalan doku kümeleri ve trituratının için Leibovitz L-15 5 ml ekleyin ve tekrar süpernatant filtre. Leibovitz L-15, 2 ml hücre süzgeç yıkayın.
    8. Kolajenaz kısmen bozulmuş kolajen sindirimi izin 60 dakika - 20 için bir başlık olarak, süzüldü hücre çözeltisi yerleştirin.
    9. 5 dakika boyunca 100 x g 'de tortu hücreleri. ,% 10 FBS ve yüksek konsantrasyon P / S (20 U / ml) ihtiva eden DMEM, 20 ml hücrelerin yeniden askıya.
    10. Kardiyomiyosit seçim için 37 ˚ ° C'de CO2 inkübatörü içinde, 1 saat boyunca iki adet 10 cm plastik hücre kültürü tabakları üzerine, ön plaka hücreleri. NOT: Fibroblastlar kardiomyositlerindeki daha yemeğin altına daha kolay eklemek.
    11. WhIle bekleme, DMEM,% 10 FBS, P / S (10 U / ml) ve 0.1 mM BrdU içeren hazırlar. % 10 FBS ve P / S ihtiva eden DMEM içinde 325 ml 10 mg / ml 1 ml BrdU ekleme
    12. Nazikçe yemekleri girdap ve iki adet 10 cm yemekleri kardiyomyosit içeren süpernatant toplamak.
      NOT: Çoğu kardiyomiyositlerde hala inkübasyondan 1 saat sonra yüzer yüzen olacaktır. Hafifçe çanak bağlı olan fibroblast ile kirlenmesini önlemek için, pipetleme süpernatantı toplamak yok.
    13. İsteğe bağlı> hücre canlılığı kontrol etmek için tripan mavisi ile ve% 0.2 olmadan yüzer hücreleri sayın.
    14. 5 dakika boyunca 100 x g 'de tortu hücreleri. % 10 FBS, P / S (10 U / ml) ve 0.1 mM BrdU içeren DMEM içinde hücrelerin yeniden askıya. Mikroskop kullanarak gözlem için jelatin kaplı 3.5 cm cam alt yemekler 2 x 10 5 hücre / tabak plaka hücreleri. NOT: 37 ˚ C'de CO 2 inkübatör en az 24 saat boyunca kaplama sonra hücrelerin rahatsız etmeyin
    15. Gün 3, ChaNGE ortamı, 24 saat,% 5 FBS, P / S ve 0.1 mM BrdU içeren DMEM / MEM için kaplama sonrası.
    16. Gün 4,% 5 FBS ve P / S ihtiva eden DMEM / MEM sonra kaplama ortamı 48 saat değiştirme
      NOT:% 5 FBS ve P / S ihtiva eden DMEM / MEM ile her 2-3 günde bir ortam değiştirme

2.. Lentiviral transdüksiyon

  1. Lentiviral plasmidlerin ambalajlama
    NOT: Bu konu 24-26 hakkında daha derinlemesine bilgi için başka kaynaklara başvurun. Bu Lentiviral çözeltisi hazırlamak için yaklaşık 3 gün sürecek. Daha yüksek transdüksiyon etkinliğini elde etmek için taze Lentiviral çözümü kullanmak en iyisidir. Lentiviral plasmidler ve paralel olarak neonatal sıçan kardiyomiyositlerde izolasyonun paketleme başlatın. Bunun yerine lentiviral plasmidlerin paketlenmesi için polietilenimin (PEI) 27 kullanmak yerine, bir ticari olarak temin edilebilir transfeksiyon reaktifi kullanılabilir. Üreticisinin talimatlarına uyun.
    1. Reaktifler ve araçları hazırlamak; HEK293T hücreleri, 10 cm Plastik hücre kültürü kapları, lentiviral plasmid çözeltiler (pMDLg / pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G, lentiviral transfer vektörü, 1.0 mg / ml her biri), 1 g / l PEI, serum içermeyen ortam, 20 mM % 70 EtOH içinde suda klorokin,% 10 ağartma maddesi,% 1 SDS
    2. Gün 0, 10 cm başına 2-2.5 x 10 6 HEK 293T hücreleri transfeksiyondan bir gün önce çanak Plate.
      NOT: transfeksiyondan% 30-60 izdiham uygunudur.
    3. Gün 1, PEI transfeksiyon solüsyonu hazırlanması. Bir 1.5 ml bir tüp içinde 960 ul serumsuz ortama 1 g / l PEI 30 ul ekle. 1.5 ml tüp içinde PEI transfeksiyon çözelti içine 4 plazmidler ekleyin ve dokunarak ile karıştırın.
    Plasmid Adı Not Boyut (KBP) hacmi eklenmiş (ml) 10 cm çanak Final miktarı (mg) 10 cm çanak (PM) nihai konsantrasyonu
    Lentiviral transfer vektörü paketlenecek olan geni kodlayan 9-13 3,6-5,2 3,6-5,2 60
    pMDLg / pRRE HIV-1, gag / pol ifade 8.8 1.76 1.76 30
    pRSV-Rev HIV-1 ifade eden REV 4.1 0.82 0.82 30
    pMD2.G VSV G ifade 5.8 1.16 1.16 30

    Tablo 2:. Lentiviral ambalaj plasmidlerin miktarı 10 cm tabaklarda HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu için, bu plazmid miktarda kullanın. Tabak başına lentiviral transfer vektörü nihai miktarı, boyutuna göre farklılık 60 uM'de tabak başına son konsantrasyon muhafaza edebilir. Çift şeritli DNA, bir baz çiftinin ortalama moleküler ağırlığı 660 daltondur.

    1. Eski orta atınyavaşça 10 cm HEK 293T hücreleri tabak ve yeni ortamın 9 ml ekleyin (DMEM +% 10 FBS, P / S olmadan).
    2. PEI-DNA karışımını ekleyin, yavaşça tabağa-bilge bırakın ve yavaşça orta ile karıştırın girdap. 10 ml ortama 20 mM klorokin'e (nihai 20 uM), 10 ul ekle. Not: Chloroquine lızozomal bölmeleri 28 içindeki pH kısmi nötrleştirilmesi ile plasmid ihtiva eden transfeksiyon komplekslerinden bozulmasını azaltmak için düşünülmektedir.
    3. 6 saat boyunca 37 ° C'de ˚ CO2 inkübatörü içinde inkübe edilir. Daha sonra, PEI-DNA karışımını ihtiva eden orta kaldırmak ve yeni ortamı 10 ml ekleyin (DMEM +% 10 FBS + 20 mM 4 - (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), pH 7.4 + P / S) . Not: inkübasyondan sonra, virüs ortamında üretilecektir. Çekiş Pasteur pipetler ve / veya ipuçları% 10 çamaşır suyu ile dezenfekte edilmelidir. Her zaman biyolojik güvenlik kabini yüzeyi arındırmak ve bağımsız yüzer dökülmüş olup olmadığını% 70 EtOH ile potansiyel kirlenmiş ekipman,ya da. Dökülmesi oluştu,% 70 EtOH içinde% 1 SDS ile tam bir dekontaminasyon gereklidir.
    4. Gün 2-3, CO Ġnkübasyon 48-72 saat. 4. Gün boyunca 37 ˚ C'de 2 inkübatör, lentiviral çözüm (Bölüm 2.2 devam) toplamak.
      NOT: Orta transfeksiyonundan sonra 48 saat değiştirilebilir. Iki virüs süpernatant 48 saat ve 72 saat Toplama yüksek titresi virüs çözümleri elde etmek için elde edebilir.
  2. Lentiviral çözeltisi ve transdüksiyon toplanması
    1. Reaktif ve araçları hazırlayın: 15 ml konik tüpler, 1 M HEPES, pH 7.4 (0.22 um süzülmüş)
    2. 4. gün, Luer-Lok şırınga steril 10 ml lentivirüs parçacıklar (lentiviral çözelti) ihtiva eden supernatant toplamak, daha sonra 0.45 um filtre süpernatan, bir 15 mL konik tüp içine filtre. Süzüldü lentiviral çözelti (son 10 mM) ve 1 M HEPES pH 7.4 içinde 1/100 hacim.
      NOT: filtreleme için, sadece selüloz ace kullanınTate veya polietersülfon (PES) (düşük protein bağlama) filtreler. Nitroselüloz filtre kullanmayın. Nitroselüloz Lentiviral zarfın yüzey proteinleri bağlanır ve virüs yok.
    3. Bölüm 1.2 son aşamasında elde edilen sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin 3.5 cm yemekler, orta çıkarın, 3,5 cm çanak süzülmüş Lentiviral solüsyonu 1 ml ekleyin.
    4. Heksadimetrin bromit (nihai konsantrasyon 4-6 ug / ml) ilave .
      NOT: Heksadimetrin bromür Lentiviral transdüksiyon etkinliğini artırabilir. Heksadimetrin bromür konsantrasyonu optimize edilmelidir.
    5. Lentiviral transdüksiyon boyunca 37 ° C'de ˚ CO2 inkübatörü içinde 6 saat boyunca inkübe çanak, sonra% 5 FBS ve P / S ihtiva eden yeni bir DMEM / MEM için orta değiştirmek 3 gün boyunca 37 ° C'de ˚ CO2 inkübatöründe inkübe çanak.
      Not: lentivirüs ile konakçı genom içine egzojen genin entegrasyonu 72 saat tamamlanması olarak kabul edilir.
    7. Gün 7, bir sonraki aşama için adım 2.2.5 hücreleri kullanın. Not: lentiviral plazmidinden protein sentezleme göreli ekspresyon seviyesini belirlemek amacıyla transdüksiyonunun 48-72 saat sonra WB imünosito kimyasal olarak ya da (ICH) tarafından teyit edilebilir (Şekil 1a ve 1b).
  3. Lentiviral çözeltisinin konsantrasyonu
    NOT: Bu lentıvıral çözüm titre yeterince yüksek değilse bu durumda, en yüksek iletim verimliliği elde etmek için taze Lentiviral çözümü kullanmak en iyisidir, lentiviral solüsyon polietilen glikol (PEG) çöktürme 29 konsantre edilebilir.
    1. 4x PEG çözeltisi (% 32 PEG6000, 400 mM sodyum klorür (NaCl), 40 mM HEPES pH 7.4) Hazırlanması
      1. 4x 125 ml PEG çözeltisi için, PEG6000, 40 g ağırlığında daha sonra 60 ml su içinde çözülür.
        Not: Not: (. Örneğin PEG6000, Ortalama molekül ağırlığı 6000 olan) PEG sonra sayısı ortalama molekül ağırlığıdır
        NOT: 2.3.1.2) yavaş yavaş 10 ml ekleyin5 M NaCl. Yavaş yavaş 1 M HEPES pH 7.4, 5 ml ekleyin. 2 M sodyum hidroksit kullanılarak pH 7.4 'e ayarlayın.
        NOT: 2.3.1.3) 125 ml su ekleyin. Bir 0.22 um filtre ile membran filtrasyonu ile 4x PEG solüsyonu sterilize ve 4 ˚ C'de saklayın
    2. Lentivirüstür konsantrasyonu
      1. Filtre lentiviral, 0.45 um filtre kullanılarak yeni bir 50 ml tüp içine süpernatant kalıt.
        NOT: yüzer = 01:03): 2.3.2.2) 4x PEG çözüme 01:03 oranını (PEG çözüm ekleyin. 16-48 saat boyunca 4 ˚ C'de saklayın.
        Not: 30 dakika boyunca 4 ° C'de ˚ 2600 x g de 2.3.2.3) santrifüjleyin. 5 dakika boyunca 4 ° C'de ˚ 2600 x g de santrifüj süpernatan ve atın.
        NOT: 2.3.2.4) pelet rahatsız etmemek için dikkatli bir şekilde süpernatant atın. Yeniden askıya 1/2, orijinal süpernatan hacminin 1/25 hacme kadar kullanılarak serum barındırmayan ortam içinde pelet.
        NOT: 2.3.2.5) doğrudan kullanın ya da daha sonra -80 ˚ C'de saklamak sıvı azot kullanılarak dondurmak

3.. Adenoviral iletimi

Not: adenoviral yapıların 13 inşası ve yayılması için yöntemler için diğer kaynaklara bakınız. Çekiş Pasteur pipetler ve / veya ipuçları% 10 çamaşır suyu ile dezenfekte edilmelidir. Her zaman biyolojik güvenlik kabini yüzeyi arındırmak ve potansiyel bağımsız yüzer dökülmüş olup olmadığını% 70 EtOH ile ekipmanları kirlenmiş. Dökülmesi oluştu,% 70 EtOH içinde% 1 SDS ile tam bir dekontaminasyon gereklidir.

  1. % 50 doku kültürü enfeksiyon dozu ile Adenoviral titrasyon (TCID50)
    NOT: transdüksiyon önce, adenoviral stok solüsyonu titre etmek için gereklidir. TCID50 viral titre etmek için en iyi yöntemlerden biridir. Yöntem TCID50 hesaplanan HEK 293T hücrelerine bulaşıcı bir kapasite, bir titre değerlendirir için adenovirüs stoklar gerçek Bulaşabilirliği yansıtır. PFU (plak oluşturucu units) yaklaşık 0.56 bir 30 faktörü ile TCID 50 ile orantılıdır.
    1. HEK 293T hücreleri, 10 cm hücre kültür kapları, 96-gözlü düz dipli hücre kültürü plakası, 8 kanallı pipet multi: hücreleri ve araçları hazırlanması
    2. 10 cm çanak 70-90% Konfluent HEK 293T hücreleri hazırlayın.
    3. Virüs stokunun 1/10 4 bir ön seyreltme gerçekleştirin. Bir 96-gözenekli düz tabanlı hücre kültürü plakasının her oyuğuna DMEM +% 10 FBS, 50 ul ekle. A'dan H., ilk satırda içine önceden seyreltilmiş virüs stokunun 25 ul ekle
    4. İyice karıştırın ve 8-kanallı multi pipet ile ikinci satıra kuyu ilk satırdan 25 ul aktarın. 1/3 kadar kuyuların her satır için viral çözelti seyreltme ve 11. satırda dahil olmak üzere tekrarlayın ve son 25 ul atın.
    5. Öğütün HEK 293T DMEM +% 10 FBS içinde 10 ml hücre. 1 ile 12 arasındaki sıralarındaki her bir hücre içine çözeltisinin 50 ul ekle.
    6. 11-13 gün boyunca CO2 inkübatöründe 37 ° C'de ˚ hücreleri inkübe edin. DMEM + 1, 50 ul ekle4-5 gün ve kaplama 7-8 gün sonra% 0 FBS.
    7. Enfeksiyondan sonra 11-13 gün sonra, her oyuktaki sitopatik etkiler ölçün.
    şerit 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    Satır A d d d d d d d d d
    Satır B d d d d d d d d d
    Satır C d d d d d d d d d
    Satır D d d d d d d d
    Satır D d d d d d d d d d d d
    Satır F d d d d d d d
    Satır G d d d d d d d d
    Sıra H d d d d d d d d d d d
    satır başına pozitif kuyu sayısı 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    satır başına pozitif olan kaynaklar oranının 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0.63 0.25 0.25 0
    d % 50 Sitopatik etkileri üzerinde gösteriliyor
    % 50 ya da hiç Sitopatik etkileri altında gösteriliyor

    Şerit 1, 1 seyreltme 3 x10 4; şerit 2, seyreltme 3 2 x10 4; ...; şerit 11, seyreltme 3 2 x10 11; Şerit 12, kontrol.
    S sıra başına pozitif kuyuların oranlarının toplamı =
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0,75 0,63 0,25 0,25 0 = 8.875
    TCID 50 = 3 x 10 4 x 3 x (8,875-0,5) = 2.97 x 10 8
    TCID50 / ml = 5.94 x 10 9

    Tablo 3:. Enfekte olmuş bir 96 well-levha 10 gün inkübe edildikten sonra her bir hazne içinde sitopatik etkisini ölçmek ve sıra başına pozitif kuyuların oranlarının toplamı örneği.

    1. Kaerber ait formüle uygun olarak titreyi hesaplamak 31.
    2. TCID50 = (ilk şerit seyreltme) x (seyreltme) (S-0.5)
    3. S sıra başına pozitif kuyuların oranlarının toplamı =
      NOT: Bu protokol için, TCID 50 = (30000) x (3) (S-0.5). Viral çözeltisi 50 ul Bu protokolde kullanıldığı için, TCID50 / ml hesaplamak için 0.05 TCID50 ile bölün.
  2. Adenoviral transdüksiyon
    1. Kendi titresi (PFU / ml, ya da TCID50 / ml viral partikül /) için adenoviral çözeltinin gerekli miktarı hesaplanır. MOI (enfeksiyon çokluğu) hesaplamak için formül kullanın.
    2. em> [buraya yerleştirin Tablo 4]
    3. Serumsuz ortama virüs çözeltisi hesaplanan miktarını ekleyin (bkz. Tablo 5). İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
    4. em> [Burada Yeri Tablo 5]
    5. Day7, Bölüm 2.2 son aşamasında elde edilen çanak alın ve% 5 FBS ve P / S içeren yeni DMEM / MEM 750 ul ile orta yerine
      Not: orta hacminorijinal hacminin yaklaşık% 50 transdüksiyon yüksek transdüksiyon verimliliği için çok önemlidir.
    6. Çanak seyreltilmiş virüs solüsyonu ekleyin. 37 ˚ C'de CO2 inkübatör içinde 4-8 saat inkübe çanak Daha sonra, taze ortam ile değiştirin.
    7. 37 ˚ C'de CO2 inkübatör 24-48 saat boyunca inkübe çanak Gün, 8-9 de, canlı hücre görüntüleme deneyi için hücreler kullanın. Not: adenoviral plazmidinden protein sentezleme göreli protein ekspresyon seviyesi (Şekil 1c ve 1d) belirlemek amacıyla transdüksiyon 24-48 saat sonra WB veya ICH ile teyit edilebilir.

4. Canlı hücre görüntüleme

  1. Sıcaklık kontrollü bir oda ile bir konfokal dönen disk mikroskop ve CO 2 çevre sistemi (isteğe bağlı) kullanarak görüntü elde etme
    1. Tüm cihazlar önce satın başlamasından 37 ˚ ° C'ye kadar dengeye, böylece önceden satın alınması, en az 1 saat üzerindeki sıcaklık kontrol sistemi getirin. Confoc açınal diski mikroskop sistemi (PC operasyon için, mikroskop, dönen disk ünitesi, CCD kamera, lazerler, floresan ışık kaynağı, normal ışık kaynağı, motorlu sahne ve otomatik kepenkler) iplik.
      NOT: Daha fazla 1 saat tüm cihazların tam sıcaklığı dengeye ulaşmak için gereklidir.
    2. Gerekirse, edinimi için istenen ortama 3,5 cm cam alt yemekler orta değiştirin. Sıcaklık kontrollü odasında konfokal dönen disk mikroskop sahnede çanak yerleştirin.
      NOT: nedeniyle No 1.5 cam kapak ile 3.5 cm cam alt çanak (yaklaşık 0,16-0,19 mm kalınlık) mikroskopi kullanılarak optimum gözlem için küresel sapmaları idealdir. Kullanılan amacı, düzeltme yaka varsa, 0.17 mm'den daha kalındır örtücü camları elde görsel düzeltilebilir. Ayrıca, Fenol kırmızı hafif bir floresan var. Bazen fenol kırmızısı olmadan bu DMEM gibi bir fenol kırmızı içermeyen ortam, kullanımı tercih edilir. CO denetlemek için bir cihaz varsa 2 konsantrasyonu, onu kullanmak daha iyidir bir CO 2 bağımsız uzun vadeli time-lapse görüntüleme için HEPES'e tarafından tamponlu, orta ya da orta.
    3. Okülerlerinde ışık yolu seçin.
    4. Üzerinde parlak bir alan ışık kaynağının deklanşöre çevirin. Göz mercekleri ile mikroskop altında hücrelere odağı ayarlayın. Aydınlık alan ışık kaynağı off için deklanşöre çevirin.
    5. Üzerinde floresan ışık kaynağı için deklanşöre çevirin. Göz mercekleri ile mikroskop altında floresan proteinleri ifade eden hücrelerin bulun. Floresan ışık kaynağı off için deklanşöre çevirin.
    6. İsteğe> Basın time-lapse edinimi sırasında sabit odak tutmak için üzerinde mükemmel odaklama sistemi açmak için mikroskop önünde mükemmel odaklama sistemi için aktivasyon düğmesine basın.
    7. Dönen bir disk konfokal mikroskop ışık yolu değiştirin. Uygun görüntüler displa kontrol, işletim yazılımı kullanarak edinimi için ayarlarınıEkranda yed. (Örneğin Odak, lazer güç, etki süresi, CCD kamera kazanç ve off-set)
    8. Işletim yazılımı kullanılarak floresan görüntü elde etmek için set ayarları. Örnek: Kanal biri için EGFP'nin floresan sinyali elde etmek: "ışık yolları kullanarak kanal değiştirme" ve "EGFP Kanal 1" seçeneğini seçin.
    9. Işletim yazılımı kullanarak zaman atlamalı görüntü almak için time-lapse ayarlarını yapılandırarak zaman noktaları arasındaki frekansı ayarlayın. Örnek: Bir zaman noktasını her 5 dakikada kazanmak için, açılan menüden "Time-noktası başına Dakika" seçeneğini seçin ve metin alanına 5 girin.
      NOT: gerçek hızda bir film yapmak için "Maksimum Hız" seçeneğini seçin. Floresan protein ifadesi düşükse, floresan time-lapse edinimi sırasında hızlı beyazlatabilir. Bu durumda, bu satın alma zaman noktalarının sayısını azaltmak için daha iyidir.
    10. "Sta tıklayarak time-lapse satın alma başlayınBir görüntü dizisini elde etmek rt "düğmesine basın.
      NOT: Birden fazla puan toplama işlevini kullanmak daha iyi değil. Bu time-lapse görüntüleme sırasında görüntüleme alanında odak veya hareket kaybına neden olabilir.
  2. Alınan görüntülerin Analizi
    NOT: Edinsel Görüntülerin bir film dosyası olarak oynatılır ve analiz yazılımı kullanılarak analiz edilebilir.
    1. Bir filmde dahil edilecek edinilen görüntüleri seçin. Gerekirse, kırpma görüntüleri ilgi bölgeleri ve işletim yazılımı kullanarak filmin dosya boyutunu azaltmak için ilginç bir zaman-noktalarını seçin.
    2. Bir AVI film dosyasına veya MOV formatında İhracat görüntüler. "Format" açılır menüsünden ve bitmiş film için gerekli zamanlama bir film biçimini seçin, ardından "Export" tıklayın. NOT: Her 5 dakikada gerçek hızdan 3.000 kat daha hızlı saniyede 10 kare, bir film olarak geri çalınabilir bir zaman noktasında edinilen Time-lapse görüntüleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Teknik, lentivirüs encoding EGFP (gelişmiş yeşil floresan protein)-etiketli Cx43 (Connexin43) veya hücrelerde EGFP-etiketli proteinleri ifade etmek için kullanılan bir mutasyona uğramış Cx43 32 ve bir adenovirüs kodlama FGFR1DN (fibroblast büyüme faktörü reseptörü 1 baskın negatif açıklamak için ) hücrede 33-35 FGF sinyalizasyon kapatmaya kullanıldı. Kardiyomiyositlerde izolasyonu, aşağıdaki üç gün, izole edilmiş kardiyomiyositlerde hücrelerinde EGFP-etiketli proteinleri ifade etmek için lentivirüs...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Neonatal sıçan izole edilmiş primer kardiyomiyositlerde uzun in vitro kardiyomiyosit fonksiyonlarını incelemek için kullanılmıştır. Bu protokol, ilk olarak 4 ° C'de tripsin O / N ile sindirerek ve daha sonra saflaştırılmış kolajenaz, iki aşamalı bir enzim sindirimi yöntemi kullanılarak sıçan yavrularından neonatal kardiyomiyositlerde izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Saflaştırılmış kolajenaz adımı kullanarak bir avantajı enzim aynı sınıf tüm izolasyon için kullanılan olmasıdır. Böylece, izole edilmiş h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Dr. Alengo Nyamay'antu ve Dr. Ilse Timmerman'a lentiviral paketleme konusundaki tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Bilim İnsanı Geliştirme Hibesi 10SDG4170137 tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 Dekapitasyon için makasWPI501749Kullanmadan önce otoklav
1 Kalp izolasyonu ve doğrama için ince makasWPI14393Kullanmadan önce otoklav
2 İnce forseps (Dumont No. 5)SigmaF6521Kullanmadan önce otoklav
3 Sterilize edilmiş 10 cm plastik tabakSigmaCLS430165Kalp izolasyonu için
3,5 cm Cam alt kültür kaplarıMatTekP35G-1.5-20-CGelecekteki canlı hücre görüntülemesi için kardiyomiyositlerin son kaplaması için. İbidi mikro yemekleri kabul edilebilir bir alternatiftir.
3,5 cm Cam alt kültür kaplarıMatTekP35G-0.17-14-CTIRF veya yüksek çözünürlüklü görüntü için
Etanol çözeltisi, suda %70 (h/h)SigmaE7148
%2 JelatinSigmaG1393
1 Sterilize edilmiş 10 cm plastik tabakSigmaCLS430165Tripsinizasyon için
Alüminyum folyoHerhangi bir marka
ParafilmSigmaP7543
İki adet 10 cm plastik hücre kültürü kabıSigmaCLS430165Seçim için
AutopipetteDrummond Scientific4-000-300Tritürasyon için
Hücre sayacı
Selometre, otomatik hücre sayacınexcelomHücreleri kontrol etmek ve saymak için
Mikroskop ve hematositometreHerhangi bir markaHücreleri kontrol etmek ve saymak için
Tripan mavisi çözeltisi, %0.4invitrojen15250-061
CO2 inkübatörSanyoMCO-19AIC
İnkübe orbital çalkalayıcıSigmaZ673129Kalp dokusunu 37 ° C'de kollajenaz ile sallamak için; 170-200 rpm'de C
10 mg / ml BrdU çözeltisiBD Pharmingen550891
DMEM, yüksek glukozinvitrojen41965039Protokolde belirtildiği gibi ortamı karıştırın ve kullanmadan önce ısıtın
MEMinvitrojen31095029Protokolde belirtildiği gibi ortamı karıştırın ve kullanmadan önce ısıtın
Fetal sığır serumuinvitrojen26140079
Penisilin-streptomisin (10.000 U/ml) invitrojen15140-122
Bölüm 2 Lentiviral transdüksiyon
3 Paketleme plazmitleri
pMDLg/pRREAddgene12251
pRSV-RevAddgene12253
pMD2.GAddgene12259
Lentiviral transfer vektörü, pLVX-IRES-PuroClontech632183
Opti-MEM (serumsuz ortam)invitrojen31985070
Transfeksiyon reaktifi
polietilenimin" Max", (MW 40.000) - Yüksek etkili lineer PEI (serbest baz formunda Mw 25.000'e eşdeğer) Polysciences24765-2Roche'dan X-tremeGENE 9 ile ikame edilebilir
X-tremeGENE 9Roche6365779001transfeksiyon reaktifi olarak PEI yerine
geçer KlorokinSigmaC6628Suda çözün ve 100 mM stok çözeltisi yapın. Endozomal asitleşmenin inhibisyonu 10-100 & mu ile sağlanabilir; M Klorokin.
HEPESSigmaH3375
10 ml Luer-Lok şırınga, sterilizeBD309604
0.45 μ m filtrelerSigmaF8677Yalnızca selüloz asetat veya polietersülfon (PES) (düşük protein bağlayan) filtreleri kullanın. Nitroselüloz filtreler kullanmayın. Nitroselüloz, lentiviral zarf üzerindeki yüzey proteinlerini bağlar ve virüsü yok eder.
Heksadimetrin bromürSigmaH9268Suda çözün ve 8 mg / ml stok çözeltisi yapın, ardından sterilize etmek için süzün.
Polietilen glikol 6.000Sigma81260
Sodyum klorürSigmaS9888
Sodyum hidroksitSigmaS5881
Bölüm 3 Adenoviral transdüksiyon
HEK 293T hücreleriATCCCRL-11268
Bazı 10 cm'lik hücre kültürü kaplarıSigmaCLS430165
96 oyuklu kapaklı mikroplaka, düz tabanlı, doku kültürü, sterilBD Falcon353072Titrasyon için
Çok kanallı pipet, 10-100 μ l, 8 kanallıeppendorf3122 000.035
Bölüm 4 Canlı hücre görüntüleme
Eğirme diski konfokal mikrospopyPerkinElmerL7267000
Sıcaklık kontrollü bir oda Herhangi birmarkaSıcaklığı 37 ° C'de tutmak için; C
Bir CO2< / sub> çevre sistemiHerhangi bir markaCO2< / sub> konsantrasyonunu korumak için isteğe bağlı optimum
CO2< / sub> Bağımsız ortam, glutamininvitrojenyok 18045-054   Uzun süreli zaman atlamalı görüntüleme için
DMEM, yüksek glikoz, HEPES, fenol kırmızıinvitrojen21063-029Uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme için

Kaynaklar

  1. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
  2. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  3. MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
  4. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
  5. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).
  6. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31 (31), (2009).
  7. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28 (28), (2009).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
  9. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79 (79), (2013).
  11. Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
  12. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
  13. Metzger, J. M. Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. , Humana Press. Totowa, N.J. (2003).
  14. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  15. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
  16. Bonci, D., et al. Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
  17. Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
  18. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
  19. Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
  20. Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  24. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32 (32), (2009).
  25. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).
  26. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).
  27. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
  28. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
  29. McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'. Virology. 40, 745-746 (1970).
  30. Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
  31. Kaerber, G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. , Springer. Berlin, 480–483. (1931).
  32. Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
  33. Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).
  34. Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
  35. Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
  36. Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).
  37. Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. , 264-573 (1993).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Adenoviral TransdüksiyonZaman Atlamalı GörüntülemeHücre İzolasyon ProtokolüEGFP Etiketli ProteinDominant Negatif FGFRCam Tabanlı KaplarOtomatik Odaklama Sistemi
İlköğretim Rat Yenidoğan kardiyomiyositlerin Canlı Hücre Görüntüleme Adenoviral izlenerek ve Lentiviral İletimi Confocal Disk Mikroskopi Spinning kullanma
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.