Diseksiyon yaygın doku içindeki DNA, RNA ve protein incelenmesi için kullanılmıştır. Lazer yakalama mikroskobu (LCM) en sık kullanılan yöntem, ancak, yeni bir freze tekniği, mesodissection, son zamanlarda kullanılabilir. Biz mesodissected formalin sabit parafin Mycobacterium tuberculosis granülomlarının gömülü doku slaytlar RNA çıkarma göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kurtarma Bir Roman Mikrodiseksiyon Yaklaşımı
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Diseksiyon bir on yıl için DNA, RNA ve protein düzeylerinde dokuların incelenmesi için kullanılmıştır. Lazer yakalama mikroskobu (LCM), bugün kullanılan en yaygın mikrodisseksiyon tekniktir. Bu teknikte, bir lazer fokal dehidre doku bölümü 1 üzerinde uzanan bir termoplastik zarı eritmek için kullanılır. Doku kesiti bileşik daha sonra kaldırılır ve membran ayrılır. Bu tekniği, doku inceleme için başarılı bir şekilde kullanılabilir olmasına rağmen, zaman alıcı ve pahalı. Ayrıca, bu teknik kullanılarak prosedürlerin başarıyla tamamlanması böylelikle, bunun kullanımını sınırlayan, bir lazer kullanılmasını gerektirir. Mesodissection adlandırılan yeni daha ekonomik ve pratik bir yaklaşım mikrodisseksiyonla LCM tuzaklar olası bir çözümdür. Bu teknik, değirmen, bir slayt monte edilmiş doku numunesinden arzu edilen doku MESO-1/MeSectr sistemini kullanmaktadır eşzamanlı olarak arzu edilen bir doku örneği kurtarmak için sıvı dağıtma ve aspirasyon sırasındaBir sarf değirmen biraz. Diseksiyon işlemi başlamadan önce, kullanıcı (FFPE) gömülü formalin sabit parafin (H & E) referans slayt lekeli bir hematoksilen ve eozin ile slayt hizalar. Bundan sonra, operatör, arzu edilen diseksiyon alan annotates ve uygun bir bölümü incelemek için devam eder. Program diseksiyonu arşivlenmiş bir görüntü oluşturur. Mesodissection ana avantajı, bu deneyde nesil örnek kurmak on dakika ortalama alarak, bir slayt incelemek için gerekli kısa sürmesidir. Ayrıca, sistem önemli ölçüde daha düşük maliyetli ve kullanıcı dostudur. Hafif bir dezavantajı, bu lazer yakalama mikroskopisi gibi hassas olmasıdır. Bu yazıda mesodissection Mycobacterium tuberculosis (MTB) neden FFPE granülomlarında slaytları RNA ayıklamak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Giriş
Numuneler geleneksel elle bütün doku veya bir iğne ve neşter kullanılarak slaytlar birinden microdissected edilmiştir. Bu ilgi doku bölümünde ve çevre dokular bölümleri 2 arasında net bir ayrım gerektirir. Moleküler profil teknolojideki gelişmeler sayesinde, hücresel düzeyde doku değerlendirmek için artan bir ihtiyaç söz konusudur. Nedeniyle manuel mikrodisseksiyon sınırlamaları, LCM dahil teknikler daha fazla izolasyon hassasiyet sağlamak için kuruldu. Bu teknik, bir araştırmacı daha sonra, gen ekspresyonu profillemesi gibi alt-deneyleri için kullanılan çeşitli hücre tipleri ve slayt belirli hücre popülasyonlarının, izole sağlar. Alt deneyleri için çok etkili olsa da, LCM sınırlama olmadan değildir. Birincisi, LCM pahalı ve zaman alıcı bir süreçtir. Ayrıca nedeniyle RNA kararsız doğası, genellikle LCM örneklerinden 2 yüksek kalitede RNA elde etmek zordur. Nedeniyle diLCM sadvantages mikrodisseksiyon teknolojisindeki yeni gelişmeler hala bir ekonomik ve zaman hassas bir şekilde araştırmacıların daha fazla sayıda daha erişilebilir hale getirmek için gereklidir.
Şu anda mevcut mikrodiseksiyon teknolojide Böyle bir gelişme mesodissection olarak bilinen bir tekniktir. Bu teknikte bir makine değirmen ilgi açıklamalı doku kesiti için kullanılan ve bir tüketim değirmen parça 3 içine emer. Daha sonra, bu numune bir toplama tüpüne aspire edilir ve alt uygulamaları için de kullanılabilir. Bu sistemin avantajı, belirgin olarak daha az pahalı ve zaman duyarlı olmasıdır. Bizim tecrübelerimize göre, sistem on dakika içinde bir akciğer granülom dokusu bölümünün diseksiyon sağlar. Öte yandan, geleneksel LCM olasılıkla işlemini tamamlamak için saat gerektirir. Sistem operatörü açıklama için bir karşılaştırma yanı sıra aracı olarak kullanmak için bir referans slayt yüklemenizi sağlar. Ayrıca bir rapor özetleyen inci oluşturulurdisseke slayt e alanı. Mesodissection iki ana dezavantajı vardır. Birden fazla hücre ayıklanması etkili olmasına rağmen, tek bir hücreyi izole etmek zordur. Buna ek olarak, oluşturulan görüntünün hassas diğer görüntüleme mikroskop kullanıyorsanız kadar net değildir.
Tüberküloz (TB) önemli bir enfeksiyon hastalığı tüm dünyada insanlığın katil ve Mtb ile enfeksiyondan sonuçlanır. Mtb aerosollerle maruz kalan bireylerin çoğunda, latent enfeksiyon sınırlıdır. Yılda en az 10 milyon kişi, aktif verem hastalığı 4. sonuçlanır. Latent enfeksiyon esnasında, Mtb granülomlar olarak bilinen patolojik lezyonların içinde bulunur. Dolayısıyla Mtb enfeksiyon sonucu granülom 5 seviyesinde karar olduğu ileri sürülmüştür.
Burada mesodissection Mtb neden granülomlarını microdissect için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Kullanılan slaytlarEnfekte rhesus makakların FFPE akciğer dokusundan bulunmaktadır. Bu gösteri amaçla, kendi bütünlükleri içinde granülomlar teşrih edecek. Ayrıca RNA geri dokusundan elde edilebilir olduğunu göstermektedir. Bu teknik, çeşitli örneklerden doku örnekleri uygulanır ve daha sonra aşağı doğru bir çok analizde kullanılabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
2iD Görüntüleme Yazılımı ile 1. Kalibre Mesodissection Enstrüman
2iD görüntüleme yazılımı bu maddenin geri kalanı için yazılım veya program ya olarak adlandırılacaktır. Bu adımı doğru görüntüyü izlemek yanı sıra birden fazla slayt kareleri uyum için gereklidir.
- Enstrüman ve bilgisayarı açın.
- Açık yazılım ve "kalibrasyon aracı" seçeneğini seçin.
- Joystick'i kullanarak sahne seyahat kalibre. Sol üst konuma aşamasına gider. Programda adım 1 altında basın "set".
- Doğru konumunu indirmek için sahneye taşımak. Programda adım 2 altında basın "set".
- İlk kafası düzeneğini yükseltmek için "Z-tuşuna" basarak aspirasyon kalibre. Joystick basın "aspire darbe" butonuna ve "diseksiyon" butonuna dalgıç kontrol çubuğu kadar üst pozisyona ulaşır. Programın 3. adımda altında basın "set".
- Basın "aspirat sıfırlama &# 8221; düğmesine basın. Piston 4. adımda alt pozisyon basın "set" durur kez.
- "Ölçek sekmesine" üzerine tıklayın.
- Boş tarafına kalibrasyon cetvel yerleştirin.
- Gerekirse mikroskop odaklanın.
- Fareyi kullanarak iki ölçek bar arasında bir çizgi çizin.
- 2. adım. Basın "hesaplama" butonuna etiketli kutuda mesafeyi girin.
- "Crosshair" sekmesine tıklayın. 1 motor hızını çevirin.
- Kafa montaj içine xScisor yerleştirin. "Z-ekseni" düğmesine basarak z-ekseni hazır pozisyona alt kafa montaj. NOT: kafası düzeneği üst diseksiyon enstrüman üzerinde büyük bir yapıdır. XScisor bu maddenin geri kalanı için sarf değirmen biti olarak adlandırılacaktır.
- Joystick düğmesine "diseksiyon meşgul" tıklayın. NOT: Bu düğme joystick üstünde yer almaktadır.
- Görsel dönme merkezini tanımlayın. Bunu yapmak için, define ile dönme merkezi üzerinde crosshair merkezini taşımakProgramın adım 1'de d parametresi. Crosshair hizalamak için piksel ayarlamak için "x" ve "y ekseni" barlarda yukarı ve aşağı okları kullanın. "Done" sekmesini tıklayın.
- "Ev" simgesine tıklayın. NOT: Bu sağ üst köşesinde bulunan bir ev görüntüsü ile temsil edilir.
2.. Referans resim oluşturun
- Sahnede H & E slayt yerleştirin. Slayt üstüne opak kapak yerleştirin. H & E slayt istenen alana joystick'i hareket ettirerek araç sürücü. Oluşturulan görüntü kaydetme. NOT: "yakalama referans" sekmesi veya "teşrih" sekmesi Ya bu adımı tamamlamak için kullanılabilir.
3. Diseksiyon için Doku hizalama
- Ana ekranda "dokusu disseke" seçeneğini tıklayın.
- "Operatörü", "diseksiyon katılım numarası", "referans erişim numarası," "xScisor barkod numarası" & # doldurun8220; diseksiyon sıvı lot numarası, "" xScisor boyutu "ve" setup "sekmesinde" açıklama ".
- "Doku bulmak" sekmesine tıklayın.
- İthalat önceden referans görüntü kaydedilir.
- Sahnede 5 mikron kalınlığında bir boyanmadı FFPE slayt yerleştirin. Referans resimde gösterilen ile aynı alana sahne hareket ettirin. "Insert image" sekmesine tıklayın.
- "Hizalama" sekmesine tıklayın. Boyanmamış görüntü referans görüntüyü hizalamak için fare ve ilişkili okları kullanın.
4. Slayt Annotate
- "Annotatesekmesindeki" sekmesine tıklayın.
- Microdissected olacak slayt istenilen alanın etrafında bir daire çizmek için fareyi kullanın.
5.. Sarf Mill Bit yükleyin
- Bir sıvı hareket yukarı ve aşağı birkaç kez pistonu çekerek, burada istenen tampon, PKD tampon ile sarf değirmen biraz doldurun. Emin hava dışlamak olunkabarcıklar.
- "Z-ekseni butonuna" basarak Z-ekseni kaldırın.
- Makinenin içine sarf değirmen biraz yükleyin. Makinenin üst kısmına sarf değirmen biraz kaydırarak bunu böylece sarf değirmen bit siyah çizgi ile alet hatları üzerinde beyaz çizgi. Dalgıç doğru pozisyona indirdi izin vermek için basın "aspirasyon reset" düğmesine basın. NOT: Bu sarf değirmen biraz slayt kolay olmalıdır. Değilse, çentikler doğru hizada olduğundan emin olun.
- Tekrar "Z-ekseni" düğmesine basarak alt Z-ekseni.
6.. Doku teşrih (Şekil 4)
- "Teşrih" sekmesini açın.
- 1 motor ve aspirasyon hızları çevirin.
- "Show izleme" kutusunu işaretleyin. Not: Bu, kullanıcının diseksiyon işlemi sırasında kesilmiş alan görselleştirmek için izin verir.
- Teşrih etmeye hazır olduktan sonra, butonuna "meşgul" yanı sıra "aspire & # tutmaya devam8221; düğmesine doku incelemek için bir saat yönünün tersine joystick'i hareket ederken.
- Aspirat "tam" sekmesi kırmızıya döner kadar bir saatin tersi yönde incelemek için devam ediyor.
7. Sarf Değirmen biraz boş ve kaldır
- Sarf değirmen bitinin ucu altında bir 0.5 ul mikrofuge'de tüp yerleştirin.
- Basın "aspirasyon" kontrol çubuğu hızla mikrofuj tüpüne örnek çıkartmak için.
- Kullanılmış sarf değirmen biraz çıkarmak için artan bir güçle basın.
- Pistonu geri çekerek doku fragmanı durulayın. Sarf değirmen biraz içine kalan numuneyi ifade ileri pistonu itin. Doku parçası artık mikrofüj tüpü içinde ihtiva edilecektir.
Isıl İşlem Ardından proteinaz K Sindirim 8. Lizleyin Örnek
- Doku örneği geri için proteinaz K içinde 5 ug ihtiva eden 70 ul TE pH 8.5 ekleyin.
- Programlanabilir ısıtıcı-karıştırıcısı içine örneği yerleştir.
- Aşağıdaki ayara göre programlanabilir ısıtıcı-çalkalayıcı kullanılarak tam sindirim: 1500 rpm'de 30 dakika boyunca 60 ˚ ° C; 1500 rpm'de, 15 dakika boyunca 82 ˚ ° C; ve 450 rpm'de 1 dakika için 25 C ˚. Numune artık alt uygulamaları için hazır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Anılan protokol FFPE doku slaytlar RNA ayıklamak için yeni bir mesodissection tekniği nasıl kullanılacağını gösterir. Bu protokolün etkinliği çeşitli enfeksiyon aşamalarında Mtb ile enfekte NHP'ın akciğer granülomlarının FFPE slaytlar aracılığıyla gösterilir. 1-3 alet. Şekil 4. görüntüleri Rakamlar diseksiyon sürecinin nasıl oluştuğunu gösteriyor ve yazılım. Tablo 1. tarafından oluşturulan çıkan görüntü Her durum, iltihaplı bir NHP bir gran...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mesodissection patojenlerin geniş bir dizi neden olduğu patolojik lezyon slaytlardan RNA ekstre uygulanabilir bir tekniktir. Bu kullanıcı görüntü izler ve doğru olarak görüntü hizalayan bir zorunluluktur. Bunu gerçekleştirmek için, alet görüntüleme yazılımı yönleri aşağıdaki kalibre edilmelidir. Diseksiyon disseke ilgi slayt ve alan uyum yoksa, kullanıcı tekrar kalibrasyon gerekir. Diseksiyon sürecinde bir diğer kritik adım, diseksiyon önce (5.1 Adım) kabarcıklar yoksun böyle bir şekilde sarf değirmen biraz yüklemektir....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir mali çıkarları olduğunu ifşa.
Teşekkürler
R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, ve P51OD011104: Yazarlar bu araştırmanın destek için aşağıdaki NIH ödül / subawards kabul etmek istiyorum.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Mevcut diğer boyutlar | |
| THOR | AvanSci Bio | Programlanabilir Isıtıcı-Çalkalayıcı | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE ekstraksiyon kiti ve nbsp; | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE Sistemi | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Saflaştırma Kiti | Qiagen | 28104 |
Kaynaklar
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
- Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
- Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us. Science. 328 (5980), 852-856 (2010).
- Mesodissection of fibrous tissue. AvanSciBio. , (2013).
- Paige, C., Bishai, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view. Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).
- Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8 (6), (2012).
- Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).
- Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3 (1), (2008).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
