Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren Trichoderma reesei Tütün Bitkilerinde

Özet

Tütün bitkileri, bir geçici ekspresyon sistemi ile, bir fungal selülaz, TrCel5A üretmek için kullanıldı. Ekspresyon, bir floresan füzyon proteini kullanılarak takip edilebilir, ve protein aktivitesi post-ekspresyon karakterize edilmiştir.

Özet

Selüloz alçaltıcı enzimler arasında, selülazlar, araştırma ve hem de sanayi ilgi hedeflerdir. Bu tür hifler-yapı mantar ve anaerobik bakteriler gibi zor-organizmaların kültür, bu enzimlerin üstünlüğü, bu alanda yeniden birleştirici teknolojilerin kullanımı hızlandırdı. Bitki ifade yöntemleri enzimler ve diğer endüstriyel olarak kullanışlı proteinlerin büyük ölçekli üretimi için arzu edilen bir sistemi vardır. Burada, Nicotiana tabacum bir mantar endoglukanazın, Trichoderma reesei Cel5A arasında geçici ekspresyonu için yöntemler gösterilmektedir. Başarılı bir protein sentezleme mCherry-enzim füzyon proteini kullanılarak floresan ile gözlenmiş gösterilmiştir. Buna ek olarak, temel testler bir dizi geçici ifade T. aktivitesini incelemek için kullanılır SDS-PAGE, Western blotting, zimografi, hem de ve floresan boya bazlı alt-tabaka bozulması deneyleri de dahil olmak üzere reesei Cel5A. Burada anlatılan sistem etkin bir hücre üretmek için kullanılabilirKısa bir süre içinde ulase, kurucu ya da uyarılabilir sentezleme sistemleri ile bitkilerde daha fazla üretim potansiyelini değerlendirmek üzere.

Giriş

Lignoselülozik biyokütle ve sıvı yakıt dönüştürülmesine Bozulması fosil yakıtlara bağımlılığı azaltmak için bir yöntem olarak tasavvur edilmiştir. Ekonomik açıdan biyokütle işleme sistemleri kurulmasında önemli bir engel selüloz ve hemiselüloz ¹ enzimatik bozunma bulunmaktadır. Bitki ekspresyon sistemleri, bir endüstriyel ölçekte enzimlerin üretimi için büyük bir potansiyel göstermektedir. Onlar binlerce yıldır olduğu gibi hasat bitkilerin ekonomik ve hacim için Tarımsal sistemler zaten kurulmuş. Bitkilerdeki selülaz üretimi nedeniyle autohydrolysis ^2'nin kolaylığı ve bitki hücre duvarlarının ¹ sindirilebilirliğini arttırarak düşük enzim seviyeleri kullanımını maksimize etmek için potansiyeli gibi faktörler arzu edilir. Son olarak, bitki sistemleri, bitki hücrelerinin belirli alanlarda rekombinant proteinlerin hedefleme izin ve posttranslationally gereklidir ³ enzimleri değiştirmek edebiliyoruz.

"ve_content>

Nicotiana tabacum (tütün), çok yaygın olarak nedeniyle hızlı büyüme ve biyokütle birikiminin özelliklerine ^4, bitkilerde heterolog protein ifade araştırmaları için bir model organizma olarak kullanılmaktadır. Rekombinant proteinlerin geçici ifadesi lokalizasyonuna olarak esnekliği ve böylece seçilen proteinler örneğin, selülazlar posttranslasyonel modifikasyonlar da, kısa zaman dilimleri ⁵ protein üretimini sağlayan bir tekniktir. Aynı zamanda, bitkilerde de sentezleme stratejileri için zemin ise bu, temel analiz için selülaz (ler) üretilmesini sağlar. Böyle bir strateji kullanarak geçici ifade, ev sahibi fungal Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) türetilen bir glikozil hidrolaz ailesi 5, Cel5A, ⁶ bir endoglukanaz (bundan sonra TrCel5A olarak anılacaktır) üretilir. TrCel5A doğal glikosile bir 42 kDa proteini olan ve hyd olarak oldukça aktiftirselüloz zincirler ⁷ roylzing.

Burada anlatılan teknik, geçici ifade, bitki Agrobacteria uygun bir ekspresyon vektörü içinde, ilgi konusu geni taşıyan ile yaprakların süzülmesiyle, nispeten yaygın olarak kullanılan sistemine dayanır. Planta ifade başarılı hızlı analizi için izin vermek için, TrCel5A da mCherry, orjinal Discosoma sp türetilmiş bir monomerik floresan proteini ile bir füzyon proteini olarak ifade edilebilir. Protein birleşik bir ek altı Histidin artığı (His-tag) ile, ^8, DsRed C-terminali (TrCel5A mCherry). Heterolog füzyon proteini, TrCel5A-mCherry, böylece sentezlenmesi MCherry dağılımı incelemek için yeşil ışık kullanarak büyüyen bitki içinde izlenebilir. Eğer arzu edilirse, bitki malzemesinin ince kesitler proteinin belirli bir yeri oluşturmak için mikroskobik olarak yeşil ışık altında incelenebilir. Bu çalışma, sinyal ve tran içinoturmak peptidler, endoplazmik retikulum ^9, heterolog protein ihracat yerleştirmek üzere, yapı içinde yer almıştır.

Selülaz aktivite testleri bir dizi çalıştırılabilir TrCel5A içeren bitki ifade selulazlann, etkinliğini analiz etmek. Toplam çözünür bitki proteinlerinin ekstre etmeden sonra, TrCel5A kısmen bir ısıda inkübasyon teknikle saflaştırılabilir. Protein boyutu Western blotting ile ve ardından SDS-PAGE ile kurulur. Çözünürlük ^10: (CMC karboksimetil selüloz hale getirmek) Zymography alt-tabakalar, karboksi-metile edilmiş, örneğin selüloz karşı aktivitesini analiz etmek için kullanılabilir. Selülaz ve glukosidaz aktivitesi (4-MUC birleştirilmiş) β-D-sellobiyosid ilişkili fluorofor 4-metilumbelliferil-(4-MU) kullanılarak izlenebilir. Endoglukanaz etkinliğini değerlendirmek için başka bir yöntem, bir azo-d ile ilişkilendirilmiştir CMC spektrometrik analiz gerektirirye (Remazolbrilliant Mavi R) ^11. Buna ek olarak, endoglukanaz ve selülazların bir dizi hem de protein aktivitesi, p-hidroksi benzoik asit hidrazid (PAHBAH) deneyi ¹² gibi bir şeker analizi testinin kullanımı ile kontrol edilebilir. Bu teknikler ilgi ifade selülaz aktivitesini aydınlatmak ve ölçmek için kullanılabilir.

Protokol

Vahşi tipli N. tabacum Bitkiler 1. Büyüme

1. N. büyümek tabacum'un L. cv. Toprak Petit Havana SR1 bitkiler, çimlenme için, normal saksı toprağı ile doldurulmuş uygun saksılara tütün tohumları yerleştirin. 2 hafta sonra, ayrı saksılara fidan aktarın. Sabit 22 ° C (karanlık dönemi) ya da 25 ° C (ışık periyodu) ile bir sera içinde bitkiler ve% 70 nispi hava nemi inkübe edin. 16/8 saat aydınlık / karanlık döngüsü aydınlatma sağlamak (örneğin Philips IP65 400 W lamba, 180 ľmol · sn ^-1 · m ^-2; λ = 400-700 nm) günlük ve su.

TrCel5A ve TrCel5A mCherry Proteinlerin 2. Geçici İfade

1. , Steril koşullar altında, Agarobacterium tumefaciens'in tek koloniler (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RIFR) pTRAkc-ER-ya da TrCel5A pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry ve 10 ml maya özütü ihtiva eden bir Erlenmeyer şişesine transfer birini içeren almakseçimi için suyu (YEB, üretici talimatları uyarınca elde edilmiş) orta ve kanamisin (50 mg / ml), rifampisin (50 mg / ml) ve karbenisilin (100 mg / ml). 26 ° C'de 36-40 saat ve 180 rpm'de inkübe edin. Not: protein ifadesi için uygun yapılarının tasarımı, bu çalışmanın kapsamı dışında olduğu, ama rehberlik için, Maclean ve ark ¹³ ve Munro ve Pellham ¹⁴ yöntemleri yapı tasarımı için takip edilebilir..
2. Yukarıda belirtilen antibiyotik konsantrasyonları ile 20 ml YEB aşılamak ve daha önce olduğu gibi aynı koşullar altında kuluçkalanması, her kültür, 200 ul al.
3. 36-40 saat sonra, 2 ul asetosiringon (200 uM son konsantrasyon), 100 ul% 40 (ağ / hac) glikoz çözeltisi ve 1 M MES tamponu, pH 5.6, 200 ul. Ekleyerek kültürleri preinduce Gecede inkübe.
4. 2x infiltrasyon tamponu (100 g / L sükroz, 3.6 g / L glukoz, 8,6 g / L Murashige ve Skoog bazal tuzlar, 100 ml hazırlanması,) Potasyum hidroksit kullanılarak pH 5.6 'ya ayarlanır.
5. Bir 5-6 OD ₆₀₀ ulaşıncaya kadar 1:05 seyreltmeleri ile kültürlerin OD ₆₀₀ ölçün. OD ₆₀₀ 30 ml sızma ortamı için gerekli kültür hacmini hesaplayın. 2x tamponu infiltrasyonu 15 ml ilave edilir, daha sonra 30 ml kadar tampon için deiyonize _H2O ekleyin.
6. Sera bitkileri alın ve sızma kolaylaştırmak için üstten 5 ^inci yaprak nick 3 ^rd abaxial tarafını bir pipet kullanın.
7. Sızmasını kolaylaştırmak için nick yaprakların abaxial tarafını bir pipet kullanın.
8. Infiltrasyon orta ile bir şırınga doldurun ve önceden yapılmış rumuz birinde (iğne olmadan) koydu. Adaksiyel yaprak tarafında bir parmak ile şırınga destekleyin. Aralarının yaprak bölgelerinin doku içine dikkatle orta basın. Not: infiltrasyonu sonra, yukarıda tarif edildiği gibi aynı koşullar altında bir sera içinde bitkiler yetiştirmek. Ayrıca, untr eşit oranda korumakSüzülmüş bitkilerin ile aynı koşullar altında kontrol olarak eated olmayan geçici ifade bitkileri (NTEPs).

Bitki Leaves TrCel5A mCherry İfade 3. Değerlendirilmesi

1. 4-6 gün sonra, A ile infiltre bitkileri almak seradan pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry içeren ve floresan analizi için karanlık bir odaya koyun tumafaciens.
2. Kırmızı bir filtre (620-750 nm) ile 515 nm yeşil ışık yayan, taşınabilir bir ışık kaynağı kullanılarak TrCel5A-mCherry, ışık bitkileri ifade yaprak bölümlerinde floresan görselleştirmek için. Not: Derinlemesine bitki yapraklarda protein ifade karakterizasyonu ışık ve floresan mikroskobu altında bir vibratome ve muayene ile ince kesit yaprakları ile elde edilebilir. Bunun için aşağıdaki adımları izleyin:
   1. Bir infiltre yapraktan yaklaşık 5 x 5 mm büyüklükteki, küçük bölümler kesin ve agaroz 50 mM fosfat tampon maddesi (pH 5.7) içinde çözülmüş% 4 onları gömmek.
   2. KesimBir Vibratome kullanarak gömülü yaprakları 80-90 mikron boyutunda bölüm. Geçici bellek ya da bir kapak kayma ile kapatın ve yukarıda belirtilen aynı dalga boyu ve filtre kullanılarak, floresans dedektörü ile 10X büyütmede mikroskop kullanarak incelemek, bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin.

Tütün yapraklarından 4.. TrCel5A Ekstraksiyon

1. A ile enfekte bitkilerden, 1 g yaklaşık bir ağırlık tütün yaprakları parçalar keserek pTRAkc-ER-TrCel5A ve sıvı azot ile soğutulmuş bir havan içinde yer ihtiva tumefaciens. Örnekler, sıvı azot, uygun bir miktarda ekleyin. Taşlama bir soğutulmuş havan tokmağı kullanılarak toz halinde bırakır.
2. Zemin yaprak konuyla 1 mM fenilmetilsülfonil florür ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde bir 2 ml ilave edilir ve yaprak maddenin büyük çoğunluğu süspansiyon haline gelinceye kadar karıştırın. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 15,000 x g ve protein içeren süpernatant alır santrifüj ekstresi.
3. Centrifuge 4 ° C'de 20 dakika boyunca 15,000 xg'de özü ve pelet bozmak için dikkatli olmak protein içeren süpernatant alır. Pelet atın.
4. Kısmen, 10 dakika boyunca 55 ° C'de protein içeren süpernatant ile inkübe TrCel5A arıtın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 15,000 xg'de santrifüj, sonra ilave bir 10 dakika boyunca oda sıcaklığında dinlenmeye bırakın. Kontrol örnekleri elde olmayan infiltre bitkiler için kısmi saflaştırma işlemi tekrarlayın. Tüm deneyler için, bu, aşağıdaki örnekleri kullanarak. Not: Protein çözeltiler 3 aya kadar için en fazla 1 hafta ya da -20 ° C 'de 4 ° C' de muhafaza edilebilir.
5. Kontrol örnekleri elde olmayan infiltre bitkiler için kısmi saflaştırma işlemi tekrarlayın. Tüm deneyler için, bu, aşağıdaki örnekleri kullanarak. Not: Protein çözeltiler 3 aya kadar için en fazla 1 hafta ya da -20 ° C 'de 4 ° C' de muhafaza edilebilir.

5. SDS-PAGE, Western Blot ve TrCel5A-mCherry

1. Satın alma veya kurulmuş yöntemleri başına ¹⁵ (w / v) SDS-PAGE jelleri% 12 hazırlar.
2. % 1.5 (ağırlık / hacim) çözelti elde etmek için su içinde CMC çözülür. CMC-SDS-PAGE jelleri yapmak için, (a / h) CMC +% 12 (w / v% 0.1 'de elde edilen, 10 ml SDS-PAGE jel karışım çözeltisi içinde su, 1 ml% 1.5 CMC 1 ml yerine ) SDS-PAGE jeli karışımı. Normalde jel dökün. Not: (doğrudan önce jel çözeltisinin hazırlanması için tekrar) orijinal çözelti içinde CMC tam olarak 40 ° C'ye kadar karıştırma ve ısıtma kombinasyonu ile çözülür emin olun.
3. ¹² bilinen yöntemlere uygun olarak, SDS varlığında kaynatılarak örnekleri denatüre. Bir pozitif kontrol olarak, T., bir ticari olarak temin edilebilir selülaz karışımı bir 1:500 seyreltme kullanın örneğin T. reesei gibi, reesei ATCC 26921. Negatif kontrol olarak non-infiltre yaprak (NTEPs) için, benzer şekilde hazırlanmış bir protein solüsyonu kullanın.
4. Normal protokoller başına ¹⁵ olarak elektroforezi yürütmek,boya cephesinin, jel tabanına erişmesine bir kez, örneğin durduruldu elektroforez ile ~ 50 dakika için 200 V kullanır.
5. % 0.1 kullanarak bir SDS-PAGE jel leke (ağ / hac) Coomassie parlak mavi ve bir metanol / buzlu asetik asit karışımını kullanarak destain. Not: Rapid boyama ve lekeleme destaining yavaşça ısıtılarak ve 10 dakika sonra çözelti destaining değiştirme, sıcak (ama kaynamaya) ilk olarak boyama ve daha sonra destaining çözeltiler için ~ 15 saniye boyunca bir mikrodalga kullanarak, yani solüsyonlar, lekenin tarafından yapılabilir veya soğutulmuş ve yeni destaining çözeltisi ile tekrar ne zaman.
6. Tespit edilmiş protokollerin ^16,17 kullanılarak bir SDS-PAGE jel Western blotting yapın. (Ikincil) bir alkalin fosfataz konjuge edilmiş bir His-tag (birincil) ve bir poliklonal keçi anti-tavşan antikoru Fc bölgesine karşı bir poliklonal tavşan antikoru: Aşağıdaki antikorlar kullanın. Not: ikincil antikorlar nitroblue tetrazol kullanarak görselleştirme izin seçilmelidiryum chloride/5-bromo-4-chloro-3 'indolyphosphate-p-toluidin tuzu (NBT / BCIP), ^18, ​​tarif edildiği gibi.
7. % 0.15 'in üzerinde tekrar katlama jel protein (w / v), oda sıcaklığında, β-siklodekstrin, 20 mM fosfat sitrat tamponu, pH 6.5, 1.5%' si olarak jel inkübe edilerek (w / v) SDS-PAGE CMC jeli gerçekleştirme yumuşak, 15 dakika çalkalanarak ^19.
8. Β-siklodekstrin çözeltisi ve kısa bir süre atın _H2O ile jel yıkayın Ilave bir 15 dakika boyunca 50 mM sodyum asetat tamponu (pH 4.8) içinde oda sıcaklığında inkübe edin. 50 ° C'de 20 dakika boyunca 30 mM sodyum asetat tamponu pH 4.8 'de inkübe jel ile katlanmış% 0.15 CMC SDS-PAGE jeli kullanılarak CMC zimografi gerçekleştirme
9. (W / v) SDS-PAGE CMC jeli, 50 ° C'de 20 dakika boyunca 30 mM sodyum asetat tampon maddesi (pH 4.8) 'de jel inkübe edilerek yeniden katlanmış% 0.15' i kullanılarak CMC zimografi gerçekleştirme
10. Bir% 0.1 ile 10 dakika boyunca jel leke w / 30 dakika boyunca Congo kırmızı çözeltisi ve destain v ya da açık bantları 1 M Na kullanılarak gözlenmiştir kadarCl. Net görüntüleme için% 0.3 (v / v) asetik asit ile jel yıkayın.

TrCel5A 6. 4-MUC Aktivite Deneyi

1. % 50 içinde 10 mM 4-MUC (v / v) metanol içinde bir stok çözelti hazırlayın, ve oda sıcaklığında karanlıkta depolamak
2. Hemen önce tahlil için, bir 4-MUC 2x çalışan 1 mM 4-MUC oluşan solüsyonu ve 60 mM sodyum asetat, pH 4.8 hazırlanır.
3. (Endüklenen ifade edilen veya TrCel5A olmadan) yaprak protein 100 ul, T. 100 ul, bir ticari olarak temin edilebilir selüloz karışımı içeren bir numune üzerinde bu testi reesei 1:1,000 ve saf ₂ H, O, sırasıyla. Üç nüsha olarak her örnek çalıştırın.
4. 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına ayrı 4-MUC çalışma çözeltisi Pipet 100 ul, daha sonra her bir numune 100 ul ilave edin.
5. 360 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullanılarak, flüoresan spektroskopisi 4-MU floresan 0 dakika zaman noktası belirler.
6. 20 plakaları inkübe50 ° C'de min, buharlaşmayı önlemek için yapışkan kapak ile kaplıdır. Dondurma (veya ul 0.15 M glisin, pH 10.0, ve ayrı bir tabak içinde, örneğin her 100 ul 100 birleştirerek) ile reaksiyonu durdurun.
7. 360 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullanılarak, flüoresan spektroskopisi 4-MU floresan uç noktasını belirler. Floresans değerlerindeki değişikliği elde etmek için uç (20 dakika) 0 dakika zaman noktasında çıkarın.

TrCel5A 7. Azo-karboksimetil selüloz Aktivite Deneyi

1. % 1,5 'lik bir stok hazırlanması (a / h), oda sıcaklığında muhafaza edilir ve Azo-CMC 18 mM çinko asetat, 0.5 M sodyum asetat, pH 5 ve% 80 etanol (v / v), oda deposu ihtiva eden bir çözelti, çökeltme sıcaklığı.
2. Hemen önce tahlil için,% 1 oluşan bir Azo-CMC 2x çalışma çözeltisi (w / v) Azo-CMC (H ₂ O) ve 60 mM sodyum asetat, pH 4.8 hazırlanır.
3. Örnek 50 ul ve 50 ul çalışma birleştirin1.5 ml tüpler içinde çözelti ing.
4. (Geçici olarak ifade veya TrCel5A olmadan) yaprak protein 50 ul içeren test numuneleri; T. bir ticari olarak temin edilebilir selüloz karışımından 100 ul reesei 1:1,000 seyreltilmiş; ve saf ₂ H O. Üç kopya halinde çalıştırmak numuneleri ve standartları.
5. 50 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin Çökeltme çözeltisinin 250 ul ekleyerek reaksiyonu durdurun. Vortex hızlı bir şekilde 10 saniye için her bir örnek çözümler tamamen birleştirildi sağlamak.
6. Tekrar 10 dakika ve daha sonra girdaplı oda sıcaklığında inkübe edin. 10 dakika boyunca 1.000 xg'de Santrifüj örnekleri. Pelet bozmaya dikkat ederek, 96 oyuklu bir plakaya her bir numune 200 ul süpernatan çıkarın.
7. 590 nm bir dalga boyunda emme spektroskopisi kullanılarak Deneyi.

TrCel5A 8. PAHBAH Assay

1. Filtre kağıdı bir daire (~ 5.5 mm çap) kesmek için bir delik yumruk kullanın. 100 ul 60 mM NaAc, pH 4.8, ve 1 ile eklemeÖrnekler, (endüklenen ifade edilen veya TrCel5A olmadan) yaprak ya da protein ihtiva eden bir ticari T. 00 ul reesei selülaz karışımı, 1:1000 seyreltilmiş ve 300 rpm çalkalanarak 50 ° C'de 20 saat boyunca filtre kağıdı daireler ile inkübe edin. Filtre kağıdı ile kuluçkalanmıştır Her bir örnek için, aynı zamanda ayrı ayrı numune kontrol olarak filtre kağıdı olmadan yinelenen bir çözelti inkübe edin.
2. Oda sıcaklığında 5 100 mi çözeltisi toplam HCl ml konsantre edildi, ve mağaza ilavesi ile, _H2O içinde PahBah çözülmesiyle bir 330 mM p-hidroksi benzoik asit hidrazid (PAHBAH) çözeltisi A hazırlayın. Not: En iyi sonuçlar, _H2O ile 100 ml hacim yapmadan önce çözülmesini için sıcaklık altında karıştırılır PAHBAH bulamacın örneğin, 30 ml, daha küçük bir hacme kadar HCI ekleyerek elde edilir
3. Oda sıcaklığında 50 mM sodyum sitrat, 10 mM kalsiyum klorür ve 500 mM NaOH ve mağaza içeren PAHBAH çözelti B hazırlayın.
4. Immedgeçirmeden önce tahlile, kullanılana kadar (4 saat içinde kullanılmalıdır) buz üzerinde 9 ml tampon çözelti, saklamak için 1 mi PAHBAH reaktifi bir 1.5x çalışma çözeltisi hazırlayın.
5. Isı ayarlı 0.2 veya 0.5 ml tüpler içinde örnekleri hazırlayın. Filtre kağıdı (adım 8.1), _H2O içinde 45 ul ve PAHBAH çalışma çözeltisi 100 ul ile inkübe her bir çözeltinin 5 ul birleştirin. Numune kontrolleri (filtre kağıdı olmadan kuluçkaya örnekleri) aynı konsantrasyonlarda (5 ul örnek, 45 ul H ₂ O, 100 ul PAHBAH çalışma çözeltisi) altında çalıştırmak gerekir. Ayrıca, 0 ve glukoz 0.2 g / L ihtiva eden 5 standartlarına (5 ul) ve saf ₂ H O. testi Üç kopya halinde çalıştırmak numuneleri ve standartları.
6. 100 ° C'de tam olarak 10 dakika süreyle inkübe edin, daha sonra tam olarak 10 dakika için oda sıcaklığında soğumaya. 410 nm bir dalga boyunda, 96 oyuklu bir plaka ve spektroskopik tahlil pipetleyin çözümler. Nihai elde numunelerden (filtre kağıdı olmadan kuluçkaya) bireysel örnek-kontrolleri çıkarmadeğerleri.

Sonuçlar

TrCel5A ve TrCel5A mCherry geçici ekspresyon sistemi (Şekil 1A ve 1B) kullanılarak başarılı bir şekilde tütün bitkilerinde ifade edildi. TrCel5A mCherry füzyon proteininin ifade deseninin incelenmesi sağlıklı yaprakları yeşil ışık (Şekil 1D) altında yaygın bir protein ekspresyonu gösterdi (Şekil 1 C) ortaya çıkardı.

Toplam çözünür proteinlerin çıkarımı ihtiva yaprağı vardı tütün bitkileri üzerinde gerçekleştirilmiştir geçici...

Tartışma

Selülazlann Rekombinant ifadesi nedeniyle daha verimli biyoyakıt üretim sistemleri ¹ için arzu, büyük ilgi alanıdır. Bitkiler, ekonomik hasat teknikleri ve büyük ölçekli biyoyakıt üretimi için çok cazip özellikleri olan autohydrolysis yöntemleri gibi özellikleri ile başarılı selülaz üretimi için pek çok olanak sunuyor. Ayrıca, proteinlerin üretilmesi için farklı lokalizasyonu kullanımı, gerekirse, translasyon sonrası modifikasyonlar ²⁰ izin verir. Belirgin avantajlar sunarken, selülazlar esas ifade...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
4-metilumbelliferil ve beta;-D-selyobiyosid	SIGMA-ALDRICH	M6018
Asetik asit	ROTH	3738
Asetosyringon (konsantre)	ROTH	6003
Antibiyotik - kanamisin	ROTH	T832
Antibiyotik - rifampisin	ROTH	4163
Antibiyotik - karbenisilin	ROTH	6344
Antikor - tavşan anti His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
Antikor - keçi anti tavşan AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-karboksimetil selüloz	MEGAZYME	S-ACMC
β-siklodekstrin	SIGMA-ALDRICH	C4805
Kalsiyum klorür dihidrat	SIGMA-ALDRICH	C5080
Karboksimetil selüloz	ROTH	3333.1
Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
Kongo kırmızısı	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie parlak mavi G 250	ROTH	9598.2
D (+) - glikoz	ROTH	8337
Etanol	ROTH	K928
Filtre kağıdı - Rotilabo kurutma kağıdı	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
MES tamponu	ROTH	4256
Metanol	ROTH	8388
Sodyum sitrat	ROTH	3580
Sodyum dodesilsülfat	SERVA	20765
Sodyum hidroksit	ROTH	6771
Toprak, Einheitserde classic	PATZER GMBH
Spektrometresi - Sonsuz M200	TECAN
Sükroz	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-Hidroksi benzhidrazid	SIGMA-ALDRICH	H9882
Fosfat tamponlu tuzlu	su ROTH	1058
UV ışık kaynağı - BLAK RAY	UVP
Vibratom - VT1000S	Leica