Method Article

Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren Trichoderma reesei Tütün Bitkilerinde

DOI:

10.3791/51711

⸱

June 13th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Biotechnology, Bio7, RWTH Aachen University, 2Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tütün bitkileri, bir geçici ekspresyon sistemi ile, bir fungal selülaz, TrCel5A üretmek için kullanıldı. Ekspresyon, bir floresan füzyon proteini kullanılarak takip edilebilir, ve protein aktivitesi post-ekspresyon karakterize edilmiştir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selüloz alçaltıcı enzimler arasında, selülazlar, araştırma ve hem de sanayi ilgi hedeflerdir. Bu tür hifler-yapı mantar ve anaerobik bakteriler gibi zor-organizmaların kültür, bu enzimlerin üstünlüğü, bu alanda yeniden birleştirici teknolojilerin kullanımı hızlandırdı. Bitki ifade yöntemleri enzimler ve diğer endüstriyel olarak kullanışlı proteinlerin büyük ölçekli üretimi için arzu edilen bir sistemi vardır. Burada, Nicotiana tabacum bir mantar endoglukanazın, Trichoderma reesei Cel5A arasında geçici ekspresyonu için yöntemler gösterilmektedir. Başarılı bir protein sentezleme mCherry-enzim füzyon proteini kullanılarak floresan ile gözlenmiş gösterilmiştir. Buna ek olarak, temel testler bir dizi geçici ifade T. aktivitesini incelemek için kullanılır SDS-PAGE, Western blotting, zimografi, hem de ve floresan boya bazlı alt-tabaka bozulması deneyleri de dahil olmak üzere reesei Cel5A. Burada anlatılan sistem etkin bir hücre üretmek için kullanılabilirKısa bir süre içinde ulase, kurucu ya da uyarılabilir sentezleme sistemleri ile bitkilerde daha fazla üretim potansiyelini değerlendirmek üzere.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lignoselülozik biyokütle ve sıvı yakıt dönüştürülmesine Bozulması fosil yakıtlara bağımlılığı azaltmak için bir yöntem olarak tasavvur edilmiştir. Ekonomik açıdan biyokütle işleme sistemleri kurulmasında önemli bir engel selüloz ve hemiselüloz 1 enzimatik bozunma bulunmaktadır. Bitki ekspresyon sistemleri, bir endüstriyel ölçekte enzimlerin üretimi için büyük bir potansiyel göstermektedir. Onlar binlerce yıldır olduğu gibi hasat bitkilerin ekonomik ve hacim için Tarımsal sistemler zaten kurulmuş. Bitkilerdeki selülaz üretimi nedeniyle autohydrolysis 2'nin kolaylığı ve bitki hücre duvarlarının 1 sindirilebilirliğini arttırara....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vahşi tipli N. tabacum Bitkiler 1. Büyüme

  1. N. büyümek tabacum'un L. cv. Toprak Petit Havana SR1 bitkiler, çimlenme için, normal saksı toprağı ile doldurulmuş uygun saksılara tütün tohumları yerleştirin. 2 hafta sonra, ayrı saksılara fidan aktarın. Sabit 22 ° C (karanlık dönemi) ya da 25 ° C (ışık periyodu) ile bir sera içinde bitkiler ve% 70 nispi hava nemi inkübe edin. 16/8 saat aydınlık / karanlık döngüsü aydınlatma sağlamak (örneğin Philips IP65 400 W lamba, 180 ľmol · sn -1 · m -2; λ = 400-700 nm) günlük ve su.

TrCel5A ve TrCel5A mCherry Proteinlerin 2. Geçici....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TrCel5A ve TrCel5A mCherry geçici ekspresyon sistemi (Şekil 1A ve 1B) kullanılarak başarılı bir şekilde tütün bitkilerinde ifade edildi. TrCel5A mCherry füzyon proteininin ifade deseninin incelenmesi sağlıklı yaprakları yeşil ışık (Şekil 1D) altında yaygın bir protein ekspresyonu gösterdi (Şekil 1 C) ortaya çıkardı.

Toplam çözünür proteinlerin çıkarımı ihtiva yaprağı vardı tütün bitkileri üzerinde gerçekleştirilmiştir geçici.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selülazlann Rekombinant ifadesi nedeniyle daha verimli biyoyakıt üretim sistemleri 1 için arzu, büyük ilgi alanıdır. Bitkiler, ekonomik hasat teknikleri ve büyük ölçekli biyoyakıt üretimi için çok cazip özellikleri olan autohydrolysis yöntemleri gibi özellikleri ile başarılı selülaz üretimi için pek çok olanak sunuyor. Ayrıca, proteinlerin üretilmesi için farklı lokalizasyonu kullanımı, gerekirse, translasyon sonrası modifikasyonlar 20 izin verir. Belirgin avantajlar sunarken, selülazlar esas ifade.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Bmbf Forschungsinitiative tarafından desteklenen "BioEnergie 2021 - Forschung für nutzung von BIOMASSE ölmek" ve bilimi teşvik etmek için Alman federal ve eyalet hükümetleri tarafından Mükemmellik Girişimi aracılığıyla finanse edilmektedir Mükemmellik "Biyokütle den Tailor-made Yakıtlar", bir küme ve Alman üniversitelerinde araştırma.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-metilumbelliferil ve beta;-D-selyobiyosidSIGMA-ALDRICHM6018
Asetik asitROTH3738
Asetosyringon (konsantre)ROTH6003
Antibiyotik - kanamisinROTHT832
Antibiyotik - rifampisinROTH4163
Antibiyotik - karbenisilinROTH6344
Antikor - tavşan anti His(6) pAbROCKLAND600-401-382
Antikor - keçi anti tavşan AP, FC pAbDIANOVA111-055-008
Azo-karboksimetil selülozMEGAZYMES-ACMC
β-siklodekstrinSIGMA-ALDRICHC4805
Kalsiyum klorür dihidratSIGMA-ALDRICHC5080
Karboksimetil selülozROTH3333.1
Trichoderma reesei ATCC 26921SIGMA-ALDRICHC2730
Kongo kırmızısıSIGMA-ALDRICH75768
Coomasie parlak mavi G 250ROTH9598.2
D (+) - glikozROTH8337
EtanolROTHK928
Filtre kağıdı - Rotilabo kurutma kağıdıROTHCL67
NBT/BCIPSIGMA-ALDRICH72091
MES tamponuROTH4256
MetanolROTH8388
Sodyum sitratROTH3580
Sodyum dodesilsülfatSERVA20765
Sodyum hidroksitROTH6771
Toprak, Einheitserde classic PATZER GMBH
Spektrometresi - Sonsuz M200TECAN
SükrozSIGMA-ALDRICHS-5390
4-Hidroksi benzhidrazid SIGMA-ALDRICHH9882
Fosfat tamponlu tuzlusu ROTH1058
UV ışık kaynağı - BLAK RAYUVP
Vibratom - VT1000SLeica

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
  2. Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transient ExpressionTobacco PlantsAgrobacterium InfiltrationProtein PurificationSDS PAGEWestern BlottingZymographyFluorescence AssayEnzymatic ActivityCellulase Cel5A

Related Articles