Optimize Sentetik Yüzeyler Hepatosellüler Fenotip kullanma Stabilize

Summary

Bu makalede, uzun vadede polimer kaplı yüzeylere geliştirilmesi üzerinde durulacak, kök hücre istikrarlı kültür, insan hepatositleri türetilmiş.

Abstract

Şu anda, hücre biyolojisindeki en büyük sınırlamalardan biri farklılaşmış hücre fenotipini korumaktır. Biyolojik matrisler, primer ve pluripotent kök hücre türevi hepatositlerin kültürlenmesi ve bakımı için yaygın olarak kullanılır. Biyolojik matrisler yararlı olsa da, kısa süreli hepatosit kültürüne izin vererek yaygın uygulamalarını sınırlarlar. Sentetik bir polimer kaplama kullanarak sınırlamaların üstesinden gelmeye çalıştık. Polimerler, en geniş biyomalzeme sınıflarından birini temsil eder ve amaca göre ince ayar yapılabilen çok çeşitli mekanik, fiziksel ve kimyasal özelliklere sahiptir. Daha da önemlisi, bu tür malzemeler kalite güvenceli standartlara göre ölçeklendirilebilir ve partiden partiye tutarlılık gösterebilir. Bu, farmasötik test endüstrisinde yüksek verimli tarama veya hücresel bazlı tedavi için hücrelerin genişletilmesi gerekiyorsa çok önemlidir. Poliüretanlar (PU'lar), hücre kültüründe umut vaat eden bir malzeme grubudur. Stabil fenotip sergileyen insan hepatositlerinin uzun süreli kültürü için poliüretan kaplı bir yüzeyin optimize edilmesindeki son ilerlememiz sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Introduction

Biyolojik maddeler, yaygın olarak, pluripotent kök hücreleri ¹ bakım ve farklılaşması kullanılmıştır. Sağlarken, bu biyolojik substratların tanımlanmamış bileşenlerin sayısız içerir. Matrigel kök hücre kültürü ve farklılaşması için yaygın olarak kullanılan bir alt-tabakadır. Ne yazık ki, değişken bileşim hücre fonksiyonu fenotipi etkiler. Alternatif, daha tanımlı biyolojik matris çeşitli ^2-7 kullanılıyor olsa, onların hayvansal kökenli veya kötü ölçeklenebilirlik onlara endüstriyel üretimi için uygun bir aday haline getiriyor. Bu nedenle, kök hücre araştırmalarında önemli hedefler tanımlanır kompozisyon ve güvenilir performansı ile sentetik alternatifleri, kimlik vardır.

Tanımsız hücre kültürü yüzeylerin sınırlamaları aşmak için bir girişim, kimya ve biyoloji arasında disiplinler arası işbirliği hücre fenotipi desteklemek için kapasite ile sentetik malzemeler tespit ettik. Synthetik yüzeyler, etkili ölçeklenebilir maliyet ve in vivo ortamda taklit, karmaşık 3D yapılarına imal edilebilir. Bu özelliklere bağlı olarak, sentetik alt-tabakalar, çoğu hücre tipinde yaygın olarak ^8-10 farklılaşmasını desteklemek ve sürmek için kullanılmıştır.

Gelişmiş ve yüksek kapasiteli testler büyük kütüphanelerinden, sentetik malzemelerin hızlı tarama kolaylaştırdı ve biyomedikal araştırma ve geliştirme ^11-13 geniş uygulamaları ile esnek özelliklere sahip yeni malzemeler teslim ettik. Yüksek verim, polimer mikro-dizi tarama teknolojisini kullanarak, hızla insan kök hücresi elde edilen hepatositlerin bakımı için uygun olan basit bir poliüretan (PU134), tespit. Bu polimer, hepatosit farklılaşımı ve fonksiyon ^14-16 ile ilgili olarak, hayvan kaynaklı alt tabakalara üstün olduğu bulunmuştur. Biz sonradan etkilerini erişmek için kaplama koşulları, topografya ve sterilizasyon işlemini optimizehepatosit fonksiyonları ve ömrünü stabilize polimer performansı. Bu hücre tabanlı modelleme ve rejeneratif tıp uygulamalarında hepatosit biyolojinin temel anlayış açısından önemli etkileri vardır.

Burada anlatılan teknoloji sentetik bir polimerin yüzey hücre fenotipi korumak için optimize edilebilir nasıl bir örneğini temsil eder. Verimli bir serumsuz hepatosit farklılaşma protokol ile bu teknolojinin kombinasyonu in vitro olarak modelleme ve rejeneratif tıpta kullanım için hepatosit ölçeklenebilir üretim sağlamak için bir potansiyele sahip olduğuna inanıyoruz.

Protocol

PHNGAD (poli [1,6-hexanodiol / neopentil glikol / di (etilen glikol) -Alt-adipik asit] dio) 1. sentezi

Şema 1: PHNAGD sentezi PHNAGD sentezinin şematik gösterimi.. PHNAGD 1,6-Hexanodiol reaksiyonu, dietilen glikol, neoppentyl glikol ve adipik asit ile hazırlandı. PHNAGD, poli [1,6-hexanodiol / neopentil glikol / di (etilen glikol) -Alt-adipik asit] dio.

1. Herhangi bir artık suyun ayrılması için bir vakumlu fırın içinde 48 saat boyunca 40 ° C 'de monomerler 1,6-heksandiol, di (etilen glikol) ve neopentil glikol için ısıl işlem uygulanır. Vakum altında oda sıcaklığına soğumuş izin verin.
2. Bir Dean-Stark aparatı ile karıştırıldı çubuğu ile donatılmış ve bağlı olan, bir iki-boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişeye, her monomer ve adipik asit (55 mmol), 22 mmol ekleyin.
3. Bir vakum altında bütün tertibatım yerleştirin, yavaşça GLA ısıtmakşişe içine kimyasal maddenin ilave edilmesi sırasında nem emilmesini önlemek için, 6 saat boyunca 40 ° C, ssware.
4. Damla katalizör titanyum (IV) butoksit 0.0055 mol damla şırınga ile ilave edin.
5. 24 saat boyunca, bir _N2 atmosferi altında 180 ° C'de, reaksiyon karışımı, karıştırın ve Dean-Stark tuzağı içinde kalan suyun toplanması. Ürün oda sıcaklığına soğumaya bırakın.

PU134 2. sentezi

Şema 2: PU134 sentezi PU134 bir 4,4 '-metilenbis (fenil izosiyanat) 2.0 eşdeğer bir PHNGAD 1.0 eşd reaksiyonu ile hazırlandı poliüretan 134. sentezinin şematik temsili, 1.0 ilave edildi. bir 1,4-bütandiol zincir uzatıcının eşdeğer.

1. 4, iki eşdeğeri ile poliol PHNGAD bir eşdeğeri (Mn ~ 1800 Da, 3.2 mmol) karıştırınSusuz N '4-metilenbis (fenil izosiyanat) (6.4 mmol) N, N-dimetilformamid (12 mi).
2. Bir _N2 atmosferi altında 70 ° C de, reaksiyon karışımı, ilave edin.
3. , Şırınga ile, katalizör ekleme damla damla titanyum (IV) butoksit (0.8% wt).
4. 1 saat sonra, zincir uzatıcı 1,4-bütandiol (3.2 mmol) bir eşdeğeri ilave edin. 90 ° C de sıcaklığı artar ve bir _N2 atmosferi altında 24 saat için karıştırın.
5. Reaksiyonu takiben, çökelti oluşacak kadar reaksiyon çözelti içine damla damla (de kullanılabilir heksan ya da su), dietil eter ilave edilerek çökeltme poliüretan toplar.
6. 5 dakika boyunca 5,300 x g'de çözümü santrifüj.
7. Süpernatant süzün ve çözücü buharlaşana kadar bir vakum fırınında 40 ° C'de kurutunuz.
   Not: amacıyla reaksiyonun nihai ürünün molekül ağırlığı dağılımına ilişkin parametreler doğru sahip olduğundan emin olmak için işlevsel Groupolimer ve ergitme ve cam geçiş sıcaklıklarının PS, çeşitli analitik teknikler ve yöntemler, jel geçirgenlik kromatografisi veya Ramazan spektroskopi gibi, kullanılabilir.

PU134 Çözümleri 3. hazırlanması

1. Bir cam şişe içine 200 mg PU134 tartılır.
2. Kloroform, 1 kloroform ve toluen bir kombinasyonu: a çözücüler sayısındaki% 2'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltilir PU134 1 oranında, tetrahidrofuran, ve kombinasyon 1 tetrahidrofuran ve diklorometan arasında: 1 oranında.
   Not: Sağ çözücünün seçimi, kullanımı polimere bağlı olarak değişir. Değişik çözücüler polimerin çözünürlüğünü etkiler farklı kaynama noktalarına sahiptir.
3. Çözelti homojen hale gelir ve çökelti gözleninceye kadar, 200 mot / dakika hızda bir çalkalayıcı kullanılarak, oda sıcaklığında kuvvetli bir şekilde 20 dakika süre ile çözelti çalkalayın.

PU134 Cam Slaytlar 4. Kaplama

1. Bir rou yerleştirinSpin lak nd 15 mm ² lamel.
2. Bir pipet kullanılarak her PU134 solüsyonu 50 ul uygulayın. Oranı ile orantılı yüzeye hacim tutarak gerekli lamel boyutu için buna PU134 çözümün ses seviyesini ayarlayın.
3. 23 x g 7 saniye boyunca her lamel Spin.
4. Sterilizasyondan önce en az 24 saat boyunca oda sıcaklığında kuru hava lamel.

Lamel 5. Işınlama

1. 12 dakika süre ile, laboratuar ışınlama kullanılarak 10 Grays bir dozunun uygulanmasıyla polimer kaplı lamel Gama-ışın tedavisi.
2. 16 dakika her iki taraf için bir 30 W, UV ampulü kullanarak polimer kaplı lamel ışın UV.
3. Slayt boyutuna uygun olarak uygun bir doku kültürü plakasında, polimer kaplı lamel yerleştirin.

6. Taramalı Elektron Mikroskobu

1. Basınç 5 x 10 milibar ^-1 atmosferinde 200 saniye boyunca püskürtme ile altın kaplama polimer lamel.
2. Microg yakalayınİkincil elektron görüntüleme modunda 20 kV bir hızlandırma voltajı bir tarama elektron mikroskobu kullanılarak polimer ile kaplanmış lamel raphs.

7. Atomik Kuvvet Mikroskobu Gözlemler

1. Polimer yüzeyin 20 x 20 um tarama alanı içinde, bir.
2. 1.32 Hz 1.60 Hz tarama hızı ayarlayın.
3. Taranan bölgede 512 x 512 piksel çözünürlüğe ayarlayın.
4. Kök ortalama resim veri düzleminden alınan yükseklik sapmalarının ortalaması kullanılarak kaplamanın karesi (RMS veya Rq) hesaplayın ortalama olarak ifade edilen:
   
   Nerede Zi akım Z değeri ve N belirli bir alanda nokta sayısıdır.
5. Kullanarak görüntünün 7,5 sapmasını hesaplayın ve ortalama yüzey pürüzlülüğüne (Ra),
   
   Burada Z (X) t tarif fonksiyonuduro yükseklikte (Z) ve değerlendirme uzunluğu "L" üzerinden örnek konumuna (x) cinsinden analiz yüzey profili. Ra orta düzlemine yüzey nisbetle ortalama değeri temsil eder.

8. Hücre Kültürü ve Farklılaşma

1. Kültür ve Hay ^17'de tarif edildiği gibi, insan embriyonik kök hücre çizgisi (HESC) H9 ayırt eder.
2. Bir ayırma reaktifi kullanılarak hücreleri ayırmak ve Szkolnicka ^18,19 'de anlatıldığı gibi bir serumsuz ortam varlığında, farklılaşma gün, 9 ile kaplanmış dilimlerin üzerine PU134 bunları Replate.
   Not: Enzimatik Çözülme fiziksel hücre ayrılması için tercih edilir.

9. Sitokrom P450 üzerinde fonksiyonel denemeler

1. Üreticinin talimatlarına CYP3 aktivitesini ölçmek.
2. Hücreler olmaksızın HESC türetilmiş Gün 13 ve Gün 19 hepatositleri ve ortam inkübe - negatif kontrol olarak, uygun olan substr37 ° C'de 5 saat boyunca yedi.
3. , Hücreler ve ortamdan süpernatantlar toplamak üreticinin talimatlarına göre analizini gerçekleştirmek.
4. Yüzey alanı ^(cm2) için CYP aktivite ve normalize seviyesini ölçer.

10. immün

1. Yıkama HESC 1 dakika boyunca PBS ile hepatositleri türetilmiş, iki kez tekrarlanır.
2. 10 dakika boyunca -20 ° C'de buz soğukluğunda% 100 hücreleri düzeltmek için, metanol, yer ekleyin.
3. 5 dakika boyunca PBS ile yıkayın ve hücreler iki kez tekrarlayın.
4. PBS / T (% 0.1 Tween), oda sıcaklığında 1 saat boyunca /% 10 BSA ile hücreleri inkübe edin.
5. PBST solüsyonu aspire ve PBS / T (% 0.1 Tween) /% 1 BSA içinde seyreltilmiştir ve uygun bir primer antikor ekleyin, hafif çalkalama O / N 4 ° C'de inkübe edin.
6. 5 dakika boyunca PBS / T (% 0.1 Tween) /% 1 BSA hücreleri yıkayın ve üç kez tekrarlayın.
7. PBS / T (% 0.1 Tween) /% 1 BSA içinde, uygun bir antikor seyreltik hücrelere eklenir ve hafif çalkalanarak 1 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe.
8. 5 dakika boyunca PBS ile hücreleri yıkayın ve üç kez tekrarlayın.
9. Her bir oyuğa hava kabarcıkları sayısını azaltmak için hafifçe bir lamel ekleyin: (1000 DAPI içeren 1) Mowiol 488 ekleyin. Mağaza karanlıkta 4 ° C'de duran hücrelerin. Uygun bir filtre ve floresan lambası ile bir mikroskop kullanılarak boyama dikkate alınmalıdır. Optimize edilmiş birincil ve ikincil antikorlar, Tablo 1 'de listelenmiştir.

Results

Polimer çözücü polimer kaplanmış bir yüzey topografisi etkiler

Poliüretan 134 tek başına ya da toluen ya da tetrahidrofuran ya da diklorometan ve cam slaytlar farklı formülasyonlar ile kaplı dönüşü ile kombinasyon halinde, kloroform içinde çözüldü. Tarama elektron mikroskopi (SEM) ve atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) (Şekil 1) polimer kaplamaların fiziksel özelliklerini karakterize etmek için kullanıldı. Toluen veya kloroform kullanılarak elde edilen kaplama ...

Discussion

Kök hücrelerden hepatositleri üretmek için kullanılan mevcut yöntemlerin çoğu hayvan menşeli tanımlanmamış matrisler dayanır. Bu alt-tabakalar uygulama için önemli bir engel temsil eden hücre fonksiyonu ve stabilitesini etkileyen, pahalı ve son derece değişken olabilir. Bu nedenle, kök hücre elde edilen hepatositlerin kültürünü destekleyen sentetik malzemeler için bir ekran ısırttı. Biz belirledik, sağlam bir hepatosit farklılaşma yaklaşımı ile kombinasyon halinde PHNGAD, MDI ve bir genişletici, bu polimerleştirilmesiyl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polimer PU134 kaplı lamellerin sentezi, hazırlanması, kaplanması ve karakterizasyonu
Shaker	Edmun Bü hler	KS-15
Işınlayıcı	BDT Biointernational	IBL 637
Spin kaplayıcı	Özel Kaplama Sistemi	P-6708
Taramalı Elektron Mikroskobu	Philips	XL30CPSEM
Atomik Kuvvet Mikroskobu	DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4	Promega	V8902
UV ampul	ESCO
NanoScope analiz yazılımı	VEECO		sürüm 1.20
Floresan mikroskobu	Olympus	TH45200	Volocity 4 Yazılımını Kullanın
Doku kültürü plakaları	Corning, İngiltere	3527
cam slaytlar		Dietilen
	Malzemeleri; Aldrich	93171
1,6-heksandiol	Sigma– Aldrich	240117
Neopentil glikol	Sigma– Aldrich	408255
Adipik asit	Sigma– Aldrich	9582
susuz N,N-Dimetilformamid	Sigma– Aldrich	227056
Dietil eter	Sigma– Aldrich	676845
titanyum (IV) butoksit	Sigma– Aldrich	244112
1,4-bütandiol	Sigma– Aldrich	493732
Vakumlu fırın	Termobilimsel
4,4'-Metilenbis (fenil izosiyanat)	Sigma– Aldrich	101688
Tetrahidrofuran	Sigma– Aldrich	401757
Sputter kaplayıcı	Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Fosfat tampon salin (-MgCl2, -CaCl2)	Gibco	10010031	Oda sıcaklığında saklayın
PBST, PBS %0.1 TWEEN 20	Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri Ltd	EC607
Metanol	ve nbsp; Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri Ltd	CHE5010
Sığır Serum Albümini	Sigma-Aldrich, İngiltere	A7906
MOWIOL 488 DAPI	Calbiochem	475904	Üreticilerin talimatlarına göre Tris HCl ve gliserolden yapılmıştır
< güçlü > Hücre kültürü ve Fonksiyonel tahlil< / güçlü > CYP3A aktivitesi pGLO kiti Promega V8902
Hepatozim	Gibco	17705021
TryLE express	Life Technologies	12604013