Kuyruk-deri transplantasyonu, farelerde allojenik immün yanıtlar sırasında T hücresine bağlı reddi ve tolerans indüksiyonunu incelemek için güçlü bir modeldir. Bu protokolün avantajları, minör invaziv cerrahi ve alıcı fareyi feda etmeye gerek kalmadan izleme kolaylığıdır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerde allojenik CD4 + T hücre Cevapları Eğitim için Kuyruk Cilt Nakli
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Allo-antijen tanıma sırasındaki T hücresi yanıtları ve sonuçlarının incelenmesi, donör ve konakçı T hücreleri arasında ayrım yapmayı, grefti kolayca izlemeyi ve farklı immünolojik soruları yanıtlamak için sistemi uyarlamayı sağlayan bir model gerektirir. Medawar ve meslektaşları 1955'te farelerde allojenik kuyruk derisi nakli kurdular. O zamandan beri, deri nakli modeli, belirli soruları yanıtlamak için sürekli olarak değiştirildi ve uyarlandı. Kuyruk derisinin kullanılması, bu modelin greft reddi için puanlanmasını kolaylaştırır, ne kapsamlı hazırlık ne de derin anestezi gerektirir, tüm genetik geçmişe sahip hayvanlara uygulanabilir, iskemik nekrozu caydırır ve kimyasal ve biyolojik müdahaleye izin verir.
Genel olarak, hem CD4+ hem de CD8+ allojenik T hücreleri, farklı fare suşlarından eşleşmemiş majör histouyumluluk antijenlerini tanıdıkları için allogreftlerin reddedilmesinden sorumludur. Deri nakli yapılan farelerde allojenik T hücrelerini aktive etmek için çeşitli modeller tanımlanmıştır. C57BL / 6 fareleri de dahil olmak üzere farklı fare suşlarında majör histouyumluluk kompleksi (MHC) sınıf I ve II moleküllerinin tanımlanması, T hücresi aracılı alloyanıtları anlamak ve incelemek için önemli bir adımdı. Burada tarif edilen kuyruk derisi nakli modelinde, MHC sınıf II (I-A b) molekülünün antijen sunan oluğundaki üç noktalı bir mutasyon (I-A bm12), C57BL / 6 farelerinde güçlü allojenik CD4 + T hücresi aktivasyonunu indüklemek için yeterlidir. C57BL/6 fareler üzerindeki I-Abm12 farelerinden alınan deri greftleri 12-15 gün içinde reddedilirken, sinjeneik greftler 100 güne kadar kabul edilir. T hücrelerinin (CD3-/- ve Rag2-/- fareler) yokluğu, 100 güne kadar deri grefti kabulüne izin verir, bu da 2 x 104 vahşi tip veya transgenik T hücrelerinin aktarılmasıyla üstesinden gelinebilir. Evlat edinerek transfer edilen T hücreleri, I-Abm12 nakledilen Rag2-/- farelerde çoğalır ve IFN-γ üretir.
Giriş
Bu tür deri, kalp ve böbrekler gibi katı organ nakli artık dünya çapında tıbbi uygulamada 1 standart bir işlemdir. Başarıyla nakledilen organlar vericinin MHC antijenleri tanıyan alıcı bağışıklık sisteminin aktivasyonu ile reddedilebilir. Bu nedenle nakledilen hasta immünosüpresif ilaçlar 2 ile tedavi gerekir. Farelerde allojenik deri transplantasyonu 1955 yılında Medawar ve arkadaşları tarafından kurulan ve daha sonra MHC kompleksi (MHC) sınıf I ve II olarak tanımlanan hedeflenen moleküllerinin belirlenmesi için yararlı oldu. O zamandan beri, deri nakli modelinin sürekli değiştirilmiş ve T hücre alt rolü ve greft reddini 2-4 bastırmada kimyasal ve biyolojik müdahale ilişkisini incelemek için adapte edilmiştir. Kulak ve gövde cilt hazırlamak için daha zordur ve kuyruk-cilt 5 daha hipoksi ve nekroz daha yatkındır; Bununla birlikte,Transplantasyon prosedürü; benzer. Buna ek olarak kuyruk deri nakillerinin izlenmesi nedeniyle cildin karakteristik saç dokusu kolaydır.
Bu makalede, CD4 + T hücre aracılı allograft reddi ve farelerde tolerans farklı yönlerini çalışmaya olanak MHC sınıf II uyumsuzluk tail-deri nakli için ayrıntılı bir işlem sağlar. (IA bm12 olarak da adlandırılır), MHC sınıf II molekülü IA b doğal üç nokta mutasyonu 6-9 C57BL / 6 fare deri 8 allograftlara neden olmak için yeterlidir. IA bm12 molekülü çeşitli αβ-T hücresi reseptörü Vα2Vβ8 TcR-spesifik T hücreleri, bir TcR transgenik fare 10 oluşturmak için tespit edilmiştir, bunlar arasında C57BL / 6 fareden (TcR) zincirleri ile CD4 + T hücreleri aktive eder. Vα2Vβ8-TCR-özgü T hücrelerinin adoptif transfer C57B bağışıklık yetersizliği olan bir ret model kurmak için kullanılmıştırL / 6 RAG2 - / - IA bm12 deri ile nakledilen fareler.
Alıcı ve verici arasındaki genetik farklılıklar nakli kabul ve reddedilme sonucu etkileyebilir. Nakillerinin farklı türleri vardır: otogreftleri alıcı bireyin kendisinden nakli olan; syngrafts ve allogreftler sırasıyla genetik olarak özdeş ve akrabalık ilişkisi olmayan kişilerden nakilleri vardır. Farklı alojenik organ nakillerinin kabul hasta ve fare modellerinde 11,3,4 kimyasal ve biyolojik müdahale ile gösterilmiştir. Temel bir yaklaşım olarak, anti-CD3 antikoru ile tedavi edilen C57BL / 6 fareleri IA bm12 tail-derinin (yayınlanmamış veriler) uzun süre hayatta kalması gösterdi. Hücreleri alıcı farelerde transplantasyon öncesi CD4 + ve CD8 + T tükenmesi MHC sınıf I ve II uyumsuz greft (12 in rev.) kabul sonuçlandı. İlginç bir şekilde, deri graftları reddi CD4 + varlığına bağlıdır T-hücreleri (12 Rev.) Bu modelde, düzenleyici T hücreleri ile antikor veya bastırılması ile birlikte uyaran molekülleri bloke farklı bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri hedef toleransı (yayınlanmamış veriler) neden olabilir. Gerçekten de, CD40 ve CD28, blokaj uzun süreli deri allograft toleransı 13,14 yol açtı.
Kuyruk deri nakli, diğer organların nakli ile karşılaştırıldığında gerçekleştirmek kolay ve izlenmesi kolaydır. Buna ek olarak, kuyruk deri nakli hazırlanması kolaydır ve diğer deri dokularının çok iskemiye daha az duyarlıdır. Enjekte anestezik aksine, transplantasyon sırasında anestezik gaz (izofluoran) kullanımı prosedürü ve alıcı iyileşme süresini kısaltır hem de. Eksik yara iyileşmesi ve aşı reddi yol açabilir kuyruk deri nakli, kıvrılmaları, doku yapıştırıcı uygulanması ile önlenir. Ayrıca, IA bm12 kuyruk deri nakli modeli sadece CD4 aktive + (Aynı genetik arka plan), imünokompetan ve bağışıklık yetersizliği olan farelerde hem de T hücrelerinin sonuçlarının yorumlanmasını kolaylaştırmak.
Bu protokol, kimyasal ve biyolojik müdahale için izin veren güvenilir, tekrar üretilebilir ve kolay bir şekilde kontrol fare modeli tarif edilmektedir. Bu model, kuyruk deri nakillerinin reddedilmesi ve tolerans indüksiyonu araştırılması için tasarlanmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu videoyu yayın ve protokolde, tüm hayvan prosedürleri Kanton Kurumu, Basel-Stadt, İsviçre tarafından onaylanan hayvan protokole uygun olarak yapılmıştır. Steril koşullarda mümkün tüm işlemleri gerçekleştirmek.
Cerrahi 1. Hazırlanması
- Tüm cerrahi aletler otoklav ve kullanımdan önce pamuğu.
- Sıcak ped ısıtın ve tablo (Malzeme / Yöntemleri Tablo) cerrahi aletler düzenlemek.
- Parmak şerit bandaj açın. (Gazlı bez tamamen kapalı olduğundan emin olun) bir pamuklu çubukla yara pad üzerinde vazelin uygulayın.
- Fareler tartılır ve analjezi buprenorfin 0.05 mg / kg vücut ağırlığı yönetmek. Not: Bu hemen nakli sonrası analjezi sağlayacaktır.
Nakli için Kuyruk-cilt 2. Hazırlanması
- CO 2 boğulma ve d başına donör fareler (örneğin, IA bm12) Euthanizeeksizyon öncesi dezenfeksiyon solüsyonu ile kuyrukları isinfect.
- Temiz bir plastik gemide siyah şerit aşağı ile kuyruk yerleştirin ve orta hattı boyunca uzunlamasına kesilmiş, sadece deri tabakasını içeren yüzeysel bir kesi yapmak.
- Kavrama forseps kullanarak kuyruk derisini çekin.
- 10 ml HBSS ile dolu bir 10 cm hücre kültürü çanağı içinde kuyruk-cilt koyun.
3.. Cerrahi Prosedür
- Şeffaf bir indüksiyon kutu içinde bir% 3 izofloran çözeltisinin inhalasyonu yolu ile alıcı fareler (örneğin, C57BL / 6) anestezisi. Not: fare cerrahi uçak anestezi ulaşmak için bu 3-5 dakika sürer. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın.
- Sıcak pad üzerinde fare yerleştirin ve ayak kısma her hayvan refleks bir ağız maskesi ve eşek üzerinden% 1,5 isofluorane geçerlidir.
- Alıcı farelerin dorsal sitesi (örneğin, C57BL / 6) tıraş ve kuru bir gazlı bez sw kullanarak kirlenmesine tüyleriab.
- Aseptik çözelti ile tıraş transplantasyon bölgesine dezenfekte.
- Dorsumun sağ / orta site forseps ile cilt sıkın ve yaklaşık 1 x 0.6 cm çapında yuvarlak kesi yapmak için kavisli makas kullanın.
- Kanama oluşursa, o zaman steril pamuklu çubukla yarayı temizleyin.
- Kesi boyutunu değerlendirmek ve neşter kullanarak kuyruk-cilt büyüklük tahmini bir nakli kesti.
- Nakli yuvarlak köşeleri Trim.
- Steril pamuklu çubukla üzerinde neşter, HBSS'nin kuru aşan üzerinde nakli yükleyin ve alıcı fare greft yatağına yerleştirin.
- Donör ve alıcı cilt çakışmasını önlemek ve sadece kontak zonda doku yapıştırıcısı uygulayın.
- Fare beline kırışıklıklar olmadan bir sıva uygulanır.
- Fare sıva düzeltmek için yapışkan olmayan elastik bandaj uygulanır (3 mm değiştirdi).
- Bandajın üst ventral sitesinde 3 mm ile ilgili makasla kesin. Not: Bu tr kaçınmaktırkurtarma aşamasında fare diş aritalandırma.
- Anestetik-ağız maskesi çıkarın ve uyanık kadar ısıtma yastığı nakledilen fareler tutun.
- Tamamen iyileşti sadece kendi kafeslerine nakledilen fareler dönün ve bandaj çok sıkı olmadığından emin olmak için onların hareketliliği değerlendirmek.
- Sonraki ameliyatın geçmeden önce% 70 etanol ile tüm cerrahi aletler sterilize.
4. Post-operatif Bakım
- Içme suyu (4 mg / ml) için parasetamol içeren şurubu ilave edin ve 7 gün boyunca uygulanması.
- Kurtarılamaz kez hayvan odasına fare dönün.
- Yakından bandaj yerde (1 hafta) olduğu zamandır depresyon veya diğer davranış değişiklikleri (yeme ya da hareketsizlik), anormal görünüm (tımar eksikliği) veya postürü (pilo-ereksiyon ya da kambur duruş) dahil olmak üzere klinik belirtileri için fare monitör.
5.. Bandaj Temizleme (6-7 Gün Post-transplantasyon)
- Anesşeffaf bir indüksiyon kutusu (yukarıya bakın) ve% 3 İzofloran çözeltisinin inhalasyonu yolu ile thetize farenin.
- Arter makasla bandaj ve alçı kesme ve dikkatlice çıkarın. Not: transplant site germe kaçının.
- Klinik bulguları nakledilen farelerin (4.3 bakınız) Monitör ve deri grefti (Tablo 1) reddi için puan. Not: Graft puan sistemi, dorsal cilde göre kuyruk-cilt üzerinde farklı saç dokular yararlanır. Nakli ve reddedilme görünüm 3. sınıflarda kategorilere ayrılır. C57BL / 6 imünokompetan farelerin allojenik deri (MHC II uyumsuz, örneğin, IA bm12) greftler genellikle 12-15 gün transplantasyon sonrası (kendi veri ve 15-20) içinde reddedilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bir birinci yaklaşımda, C57BL / 6 fareleri IA bm12 allogreft ve IA b syngrafts ile transplante edildi. Bandaj çıkarılmasından sonra C57BL / 6 fareler (Şekil 1A) 'de temas bölgesinin kapanmaması yara iyileşmesinin belirgin belirtileri greft. Bandaj çıkarılmasından sonra CD4 + T hücresi aracılı iltihaplanma, nekrotik alanlarında görünümü (kırmızı lekeler) ve transplantasyon (Şekil 1B-C, dolu semboller) sonra 13 gün içinde C57BL / 6 farelerinde IA ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Deri nakli reddi ve T hücrelerine bağımlı tolerans araştırılması için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Deri nakli modeli kurulduğundan beri, çeşitli uyarlamalar ve değişiklikler uygulandı. Açıklanan prosedürde, IA bm12 kuyruk deri nakli anestezi gazı (izofloran) kullanılarak gerçekleştirilir. Gaz anestezi kullanımı nakledilen fareler üzerindeki stres azalır yürütme ve fareler kurtarma, zamanını azaltır. Prosedür kulak veya dorsal cilt dokusunun daha kıvrılabilecek kuyruk-cilt, düzeltmek için doku yapış...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, SNF hibeleri PPOOA-_119204 ve PPOOP3_144918 tarafından SWR'ye desteklenmiştir. Fareler ve teknik uzmanlıkları için E. Palmer ve B.T.H. Hausmann'a teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Betadine standart çözüm | Mundipharma | ||
| Pamuklu çubuk | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast parmak şeritleri | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Histoakril doku yapıştırıcısı | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic, 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, Fosfat Tamponlu Salin, pH 7.4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Steril gazlı bez, 5 x 5 cm, 8 kat | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Dar model forseps | FST | 11003-12 | |
| İnce iris makas kavisli | FST | 14095-11 | |
| İnce iris makas | FST | 14094-11 | |
| Mayonez makas | FST | 14010-15 | |
| Arter makası bilyalı ucu 11,5 cm | FST | 14080-11 | |
| Doku forsepsleri | FST | 11021-14 | |
| Cerrahi bıçak No. 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Karbon çeliği |
| Cerrahi bıçak sapları | Swann-Morton LTD | ||
| Şırınga, 1 ml | ARTSANA | Tek Kullanımlık | |
| Temjezik, buprenorfin | ESSEX Chemie AG | 0,3 mg/ml | |
| Doku Kültürü kapları 10 cm, 60,1 cm2 | TPP | ||
| Vaseline | Vifor SA | ||
| Sıcak ped | Solis | Type 223 |
Kaynaklar
- Mahillo, B., Carmona, M., Álvarez, M., White, S., Noel, L., Matesanz, R. Global Data in Organ Donation and Transplantation. transplantation. 92 (10), 1069-1074 (2011).
- Halleck, F., et al. New perspectives of immunosuppression. Transplantation proceedings. 45 (3), 1224-1231 (2013).
- Wood, K. J., Bushell, A., Jones, N. D. Immunologic unresponsiveness to alloantigen in vivo. a role for regulatory T cells. Immunological reviews. 241 (1), 119-132 (2011).
- Sykes, M. Immune tolerance: mechanisms and application in clinical transplantation. Journal of Internal Medicine. 262 (3), 288-310 (2007).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current protocols in immunology. , (2009).
- McKenzie, I. F., Morgan, G. M., Sandrin, M. S., Michaelides, M. M., Melvold, R. W., Kohn, H. I. B6.C-H-2bm12. A new H-2 mutation in the I region in the mouse. The Journal of experimental medicine. 150 (6), 1323-1338 (1979).
- McIntyre, K. R., Seidman, J. G. Nucleotide sequence of mutant I-A beta bm12 gene is evidence for genetic exchange between mouse immune response genes. Nature. 308 (5959), 551-553 (1984).
- Stuart, P. M., Beck-Maier, B., Melvold, R. W. Provocation of skin graft rejection across murine class II differences by non--bone-marrow-derived cells. Transplantation. 37 (4), 393-396 (1984).
- Hausmann, B., Palmer, E. Positive selection through a motif in the alphabeta T cell receptor. Science. 281 (5378), 835-838 (1998).
- Bill, J., Ronchese, F., Germain, R. N., Palmer, E. The contribution of mutant amino acids to alloantigenicity. The Journal of experimental medicine. 170 (3), (1989).
- Monaco, A. P. Immunosuppression and tolerance for clinical organ allografts. Current Opinion in Immunology. 1 (6), 1174-1177 (1989).
- Rosenberg, A. S., Singer, A. Cellular basis of skin allograft rejection: an in vivo model of immune-mediated tissue destruction. Annual Review of Immunology. 10, 333-358 (1992).
- Kingsley, C. I., Nadig, S. N., Wood, K. J. Transplantation tolerance: lessons from experimental rodent models. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 20 (10), 828-841 (2007).
- Larsen, C. P., et al. Long-term acceptance of skin and cardiac allografts after blocking CD40 and CD28 pathways. Nature. 381 (6581), 434-438 (1996).
- Tomura, M., Nakatani, I., Murachi, M., Tai, X. G., Toyo-oka, K., Fujiwara, H. Suppression of allograft responses induced by interleukin-6, which selectively modulates interferon-gamma but not interleukin-2 production. Transplantation. 64 (5), 757-763 (1997).
- Ring, G. H., et al. Interferon-gamma is necessary for initiating the acute rejection of major histocompatibility complex class II-disparate skin allografts. Transplantation. 67 (10), 1362-1365 (1999).
- Rosenberg, A. S., Finbloom, D. S., Maniero, T. G., Vander Meide, P. H., Singer, A. Specific prolongation of MHC class II disparate skin allografts by in vivo administration of anti-IFN-gamma monoclonal antibody. Journal of immunology. 144 (12), 4648-4650 (1950).
- Goes, N., Sims, T., Urmson, J., Vincent, D., Ramassar, V., Halloran, P. F. Disturbed MHC regulation in the IFN-gamma knockout mouse. Evidence for three states of MHC expression with distinct roles for IFN-gamma. Journal of immunology. 155 (10), 4559-4566 (1995).
- Surquin, M., et al. IL-4 deficiency prevents eosinophilic rejection and uncovers a role for neutrophils in the rejection of MHC class II disparate skin grafts. Transplantation. 80 (10), 1485-1492 (2005).
- Gaylo, A. E., Laux, K. S., Batzel, E. J., Berg, M. E., Field, K. A. Delayed rejection of MHC class II-disparate skin allografts in mice treated with farnesyltransferase inhibitors. Transplant immunology. 20 (3), 163-170 (2009).
- Bose, A., Inoue, Y., Kokko, K. E., Lakkis, F. G. Cutting edge: perforin down-regulates CD4 and CD8 T cell-mediated immune responses to a transplanted organ. Journal of immunology. 170 (4), 1611-1614 (2003).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
