Farelerde allojenik CD4 + T hücre Cevapları Eğitim için Kuyruk Cilt Nakli

Bu tür deri, kalp ve böbrekler gibi katı organ nakli artık dünya çapında tıbbi uygulamada ¹ standart bir işlemdir. Başarıyla nakledilen organlar vericinin MHC antijenleri tanıyan alıcı bağışıklık sisteminin aktivasyonu ile reddedilebilir. Bu nedenle nakledilen hasta immünosüpresif ilaçlar ² ile tedavi gerekir. Farelerde allojenik deri transplantasyonu 1955 yılında Medawar ve arkadaşları tarafından kurulan ve daha sonra MHC kompleksi (MHC) sınıf I ve II olarak tanımlanan hedeflenen moleküllerinin belirlenmesi için yararlı oldu. O zamandan beri, deri nakli modelinin sürekli değiştirilmiş ve T hücre alt rolü ve greft reddini ^2-4 bastırmada kimyasal ve biyolojik müdahale ilişkisini incelemek için adapte edilmiştir. Kulak ve gövde cilt hazırlamak için daha zordur ve kuyruk-cilt ⁵ daha hipoksi ve nekroz daha yatkındır; Bununla birlikte,Transplantasyon prosedürü; benzer. Buna ek olarak kuyruk deri nakillerinin izlenmesi nedeniyle cildin karakteristik saç dokusu kolaydır.

Bu makalede, CD4 ⁺ T hücre aracılı allograft reddi ve farelerde tolerans farklı yönlerini çalışmaya olanak MHC sınıf II uyumsuzluk tail-deri nakli için ayrıntılı bir işlem sağlar. (IA ^bm12 olarak da adlandırılır), MHC sınıf II molekülü IA ^b doğal üç nokta mutasyonu ^6-9 C57BL / 6 fare deri ⁸ allograftlara neden olmak için yeterlidir. IA ^bm12 molekülü çeşitli αβ-T hücresi reseptörü Vα2Vβ8 TcR-spesifik T hücreleri, bir TcR transgenik fare ¹⁰ oluşturmak için tespit edilmiştir, bunlar arasında C57BL / 6 fareden (TcR) zincirleri ile CD4 ⁺ T hücreleri aktive eder. Vα2Vβ8-TCR-özgü T hücrelerinin adoptif transfer C57B bağışıklık yetersizliği olan bir ret model kurmak için kullanılmıştırL / 6 RAG2 ^{- / -} IA ^bm12 deri ile nakledilen fareler.

Alıcı ve verici arasındaki genetik farklılıklar nakli kabul ve reddedilme sonucu etkileyebilir. Nakillerinin farklı türleri vardır: otogreftleri alıcı bireyin kendisinden nakli olan; syngrafts ve allogreftler sırasıyla genetik olarak özdeş ve akrabalık ilişkisi olmayan kişilerden nakilleri vardır. Farklı alojenik organ nakillerinin kabul hasta ve fare modellerinde ^11,3,4 kimyasal ve biyolojik müdahale ile gösterilmiştir. Temel bir yaklaşım olarak, anti-CD3 antikoru ile tedavi edilen C57BL / 6 fareleri IA ^bm12 tail-derinin (yayınlanmamış veriler) uzun süre hayatta kalması gösterdi. Hücreleri alıcı farelerde transplantasyon öncesi CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ T tükenmesi MHC sınıf I ve II uyumsuz greft ⁽¹² in rev.) kabul sonuçlandı. İlginç bir şekilde, deri graftları reddi CD4 ⁺ varlığına bağlıdır (12 Rev.) Bu modelde, düzenleyici T hücreleri ile antikor veya bastırılması ile birlikte uyaran molekülleri bloke farklı bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri hedef toleransı (yayınlanmamış veriler) neden olabilir. Gerçekten de, CD40 ve CD28, blokaj uzun süreli deri allograft toleransı ^13,14 yol açtı.

Kuyruk deri nakli, diğer organların nakli ile karşılaştırıldığında gerçekleştirmek kolay ve izlenmesi kolaydır. Buna ek olarak, kuyruk deri nakli hazırlanması kolaydır ve diğer deri dokularının çok iskemiye daha az duyarlıdır. Enjekte anestezik aksine, transplantasyon sırasında anestezik gaz (izofluoran) kullanımı prosedürü ve alıcı iyileşme süresini kısaltır hem de. Eksik yara iyileşmesi ve aşı reddi yol açabilir kuyruk deri nakli, kıvrılmaları, doku yapıştırıcı uygulanması ile önlenir. Ayrıca, IA ^bm12 kuyruk deri nakli modeli sadece CD4 aktive

Bu protokol, kimyasal ve biyolojik müdahale için izin veren güvenilir, tekrar üretilebilir ve kolay bir şekilde kontrol fare modeli tarif edilmektedir. Bu model, kuyruk deri nakillerinin reddedilmesi ve tolerans indüksiyonu araştırılması için tasarlanmıştır.

Bu videoyu yayın ve protokolde, tüm hayvan prosedürleri Kanton Kurumu, Basel-Stadt, İsviçre tarafından onaylanan hayvan protokole uygun olarak yapılmıştır. Steril koşullarda mümkün tüm işlemleri gerçekleştirmek.

Cerrahi 1. Hazırlanması

1. Tüm cerrahi aletler otoklav ve kullanımdan önce pamuğu.
2. Sıcak ped ısıtın ve tablo (Malzeme / Yöntemleri Tablo) cerrahi aletler düzenlemek.
3. Parmak şerit bandaj açın. (Gazlı bez tamamen kapalı olduğundan emin olun) bir pamuklu çubukla yara pad üzerinde vazelin uygulayın.
4. Fareler tartılır ve analjezi buprenorfin 0.05 mg / kg vücut ağırlığı yönetmek. Not: Bu hemen nakli sonrası analjezi sağlayacaktır.

Nakli için Kuyruk-cilt 2. Hazırlanması

1. CO ₂ boğulma ve d başına donör fareler (örneğin, IA ^bm12) Euthanizeeksizyon öncesi dezenfeksiyon solüsyonu ile kuyrukları isinfect.
2. Temiz bir plastik gemide siyah şerit aşağı ile kuyruk yerleştirin ve orta hattı boyunca uzunlamasına kesilmiş, sadece deri tabakasını içeren yüzeysel bir kesi yapmak.
3. Kavrama forseps kullanarak kuyruk derisini çekin.
4. 10 ml HBSS ile dolu bir 10 cm hücre kültürü çanağı içinde kuyruk-cilt koyun.

3.. Cerrahi Prosedür

1. Şeffaf bir indüksiyon kutu içinde bir% 3 izofloran çözeltisinin inhalasyonu yolu ile alıcı fareler (örneğin, C57BL / 6) anestezisi. Not: fare cerrahi uçak anestezi ulaşmak için bu 3-5 dakika sürer. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın.
2. Sıcak pad üzerinde fare yerleştirin ve ayak kısma her hayvan refleks bir ağız maskesi ve eşek üzerinden% 1,5 isofluorane geçerlidir.
3. Alıcı farelerin dorsal sitesi (örneğin, C57BL / 6) tıraş ve kuru bir gazlı bez sw kullanarak kirlenmesine tüyleriab.
4. Aseptik çözelti ile tıraş transplantasyon bölgesine dezenfekte.
5. Dorsumun sağ / orta site forseps ile cilt sıkın ve yaklaşık 1 x 0.6 cm çapında yuvarlak kesi yapmak için kavisli makas kullanın.
6. Kanama oluşursa, o zaman steril pamuklu çubukla yarayı temizleyin.
7. Kesi boyutunu değerlendirmek ve neşter kullanarak kuyruk-cilt büyüklük tahmini bir nakli kesti.
8. Nakli yuvarlak köşeleri Trim.
9. Steril pamuklu çubukla üzerinde neşter, HBSS'nin kuru aşan üzerinde nakli yükleyin ve alıcı fare greft yatağına yerleştirin.
10. Donör ve alıcı cilt çakışmasını önlemek ve sadece kontak zonda doku yapıştırıcısı uygulayın.
11. Fare beline kırışıklıklar olmadan bir sıva uygulanır.
12. Fare sıva düzeltmek için yapışkan olmayan elastik bandaj uygulanır (3 mm değiştirdi).
13. Bandajın üst ventral sitesinde 3 mm ile ilgili makasla kesin. Not: Bu tr kaçınmaktırkurtarma aşamasında fare diş aritalandırma.
14. Anestetik-ağız maskesi çıkarın ve uyanık kadar ısıtma yastığı nakledilen fareler tutun.
15. Tamamen iyileşti sadece kendi kafeslerine nakledilen fareler dönün ve bandaj çok sıkı olmadığından emin olmak için onların hareketliliği değerlendirmek.
16. Sonraki ameliyatın geçmeden önce% 70 etanol ile tüm cerrahi aletler sterilize.

4. Post-operatif Bakım

1. Içme suyu (4 mg / ml) için parasetamol içeren şurubu ilave edin ve 7 gün boyunca uygulanması.
2. Kurtarılamaz kez hayvan odasına fare dönün.
3. Yakından bandaj yerde (1 hafta) olduğu zamandır depresyon veya diğer davranış değişiklikleri (yeme ya da hareketsizlik), anormal görünüm (tımar eksikliği) veya postürü (pilo-ereksiyon ya da kambur duruş) dahil olmak üzere klinik belirtileri için fare monitör.

5.. Bandaj Temizleme (6-7 Gün Post-transplantasyon)

1. Anesşeffaf bir indüksiyon kutusu (yukarıya bakın) ve% 3 İzofloran çözeltisinin inhalasyonu yolu ile thetize farenin.
2. Arter makasla bandaj ve alçı kesme ve dikkatlice çıkarın. Not: transplant site germe kaçının.
3. Klinik bulguları nakledilen farelerin (4.3 bakınız) Monitör ve deri grefti (Tablo 1) reddi için puan. Not: Graft puan sistemi, dorsal cilde göre kuyruk-cilt üzerinde farklı saç dokular yararlanır. Nakli ve reddedilme görünüm 3. sınıflarda kategorilere ayrılır. C57BL / 6 imünokompetan farelerin allojenik deri (MHC II uyumsuz, örneğin, IA ^bm12) greftler genellikle 12-15 gün transplantasyon sonrası (kendi veri ve ^15-20) içinde reddedilir.

Bir birinci yaklaşımda, C57BL / 6 fareleri IA bm12 allogreft ve IA b syngrafts ile transplante edildi. Bandaj çıkarılmasından sonra C57BL / 6 fareler (Şekil 1A) 'de temas bölgesinin kapanmaması yara iyileşmesinin belirgin belirtileri greft. Bandaj çıkarılmasından sonra CD4 + T hücresi aracılı iltihaplanma, nekrotik alanlarında görünümü (kırmızı lekeler) ve transplantasyon (Şekil 1B-C, dolu semboller) sonra 13 gün içinde C57BL / 6 farelerinde IA bm12 allograftlara neden syngrafts iken kadar 100 gün (Şekil 1B-C, açık semboller) için tolere edildi. Bu veriler, immunokompetan C57BL / 6 farelerinde IA bm12 akut greft reddinin ilerlemesini göstermektedir.

Çeşitli çalışmalar, MHC sınıf II uyumsuz kuyruk deri reddi allojenik CD4 + T hücreleri (12 Rev) varlığına bağlı olduğunu göstermektedir. Gerçekten de, T hücresi eksik CD3ε - / - </ Sup> fareler ve T-ve B-hücrelerinin eksik RAG2 - / - fareler tam yara iyileşmesini gösterdi ve C57BL / 6 fareler (Şekil 2) 13 gün içinde greft reddetti ise IA bm12, 100 gün (Şekil 2) kadar greft tolere . IA bm12 uyumsuz kuyruk deri kabul şiddetli hastalık patolojilerinde olmayan bir fare modelinde allojenik CD4 + T hücreleri ve bunların efektör fonksiyonlarının çalışma sağlar.

- / - Ve Rag2 - kurulmuş CD3ε toleransını kırmak için / - fareleri, CD4 + T hücrelerinin adoptif transfer edilmiştir: 2 x 10 4 poliklonal C57BL / 6 T hücreleri, CD4 + (14 gün içinde IA bm12 greft reddini indüklemek için yeterli idi veriler gösterilmemiştir). - / - 50,000 ve 100,000 C57BL / 6 CD4 + T hücre transfer CD3ε olarak aşı reddi sürecini hızlandırmak yoktu ve Rag2 - / - fareler. Bu veriler allogen rolünün altınıakut aşı reddi deri modelinde EIC CD4 + T hücreleri.

Bu kuyruk deri transplantasyon modeli avantajı, CD4 + T hücrelerinin bir işlevsel analiz, kolayca antijene özgü CD4 + T hücrelerinin adoptif nakli ile yapılabilir olmasıdır. Transgenik fare ABM 9 non-spesifik CD4 + T hücrelerinin etkisi olmadan, aktivasyon ve nüfusun fenotipik davranışını tanımlamak için ideal bir araç olarak kabul edilir. 13 gün boyunca (Şekil 3A-B) içinde farenin - / - 2 x 10 4 antijene özgü ABM hücrelerin aktarımı Rag2 IA bm12 greft reddini indüklemek için yeterli idi. Buna ek olarak, ABM hücreleri izole etmek kolaydır ve Vα2Vβ8-TcR zincirleri (Şekil 3C) ekspresyonunu kullanılarak takip edilebilir. - / - Fareler incelenmiştir IA bm12 sitokin ABM hücre çoğalması ve üretim Rag2 nakli. ABM hücreleri extensi çoğaldıeFluor670 dilüsyon deneyi (Şekil 3D) ile belirlenmiştir ve ABM hücreleri% 30 PMA-stimülasyonu (Şekil 3E) üzerine, IFN-γ üretilen vely olarak.

Birlikte ele alındığında bu veriler, nispeten az sayıda allojenik CD4 + T hücreleri en az ciddi patolojilerde alojenik T hücre analizi için bu en ideal işleme, IA bm12 deri nakillerinin reddedilmesini sağlamak için gerekli olduğunu göstermektedir.

Allojenik ve Singeneik kuyruk cilt ile farelerin Şekil 1.. Transplantasyonu. (A) C57BL / 6 fareleri, allojeneik (IA bm12) ve genetik olarak özdeş (IA b) kuyruk derisi (n = grup başına 5) ile transplante edildi. Resimlerde 7. günde sargı çıkarılmasından sonra (sağ) allograft (sol) ve syngrafts açıklamaktadır. (B) Puanlama ve (C)Cildin sağkalım 7. günden itibaren ret veya nihai izleme (gün 100) günü kadar greft. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

. Şekil 2, Allogreftler farelerde T hücrelerinin yokluğunda tolere edilir Rag2 olan hayatta -. / - IA bm12 - C57BL / 6 fare nakledilen deri greftleri, CD3ε - / - ve Rag2 - / - fareler (n = 4-6 grup başına) ve reddedilen ve kabul edilen greft illüstrasyon. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

. Şekil 3. Anti-IA bm12 spesifik CD4 + T hücrelerinin çoğalmasını ve greft reddi sırasında IFN-γ üreten (A) Puanlama ve IA bm12 kuyruk cilt Rag2 greft (B) sağkalım -. / - Fareler (n = 5) adoptively 2 x 10 4, antijene özel ABM hücreleri ile transfer edilir. ABM çoğalan hücrelerin transgenik ABM farelerin lenf düğümlerinden izole edilmiş ABM hücreleri (C) Vα2Vβ8 boyama. (D) eFluor670 seyreltme ve (E), IFN-γ üretim PMA- . evlatlık ABM hücre transferi (n = 5 farenin) gün sonra 9 fareler - / - IA bm12 cilt aşılı Rag2 lenf düğümleri izole ABM hücreleri uyarılır için tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek.

Tablo 1. Greft puan sistemi. Nakli ve reddedilme görünümü Cate olduğunukuyruk ve dorsal cilt üzerinde farklı saç dokuları yararlanarak, 3 sınıflarda gorized.

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.