Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

Özet

Bu video protokolünde, modifiye edilmiş iki fotonlu bir mikroskopta orbital izleme yöntemini kullanarak, canlı hücreler içindeki floresan olarak işaretlenmiş lizozomları - yüksek hızda ve üç boyutta - izliyoruz.

Özet

Bu Video protokolün amacı, bir modifiye iki-foton mikroskop ¹ kullanarak üç boyutlu floresan yörünge parçacık izleme deneyi gerçekleştirmek ve analiz nasıl tartışmaktır. Geleneksel yaklaşımlar (raster tarama veya kare bir yığın tabanlı geniş alan) aksine, 3D yörünge izleme lokalize ve yüksek uzaysal (10 nm doğruluk) ve temporal çözünürlük (50 Hz frekans tepkisi) 3D deplasman ile takip sağlar mikron ² yüzlerce uzunluğu-ölçeklerde hareketli bir floresan parçacık. Bu yöntem takip edilecek nesnenin etrafında dairesel bir yörünge gerçekleştirmek için bir iki-fotonlu lazer tarama mikroskobu donanım kontrol eden bir geri besleme algoritmasına dayanır: geri besleme mekanizması yer değiştirme kontrol ederek merkezinde floresan nesne koruyacaktır tarama ışın ^3-5. Bu tekniğin avantajlarını göstermek için, biz al içinde hızlı bir hareket organelini, lizozom, takipiving hücre ^6,7. Hücreler, standart protokollere göre kaplama, ve bir ticari olarak lizozom boya ile boyandı. Biz yaşayan hücrelerin içinde bir 3D yörünge izleme deneyi gerçekleştirmek için, kısaca donanım yapılandırması ve daha detaylı kontrol yazılımı tartışmak. Ayrıntılı olarak tarama mikroskobu kontrol ve parçacık etrafında kapalı bir yörüngede kirişin hareketi mümkün kılmak için gerekli parametreleri tartışırlar. Bu yöntem etkili bir şekilde canlı hücre içinde 3D mikrotübüller boyunca bir etiketli lizozom hızlı hareketi izlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteren sonucuna varmaktadırlar. Lizozomlar tipik olarak mikrotübül ağı ⁸ boyunca yönlendirilmiş hareketini görüntüleyen, 0.4-0.5 mm / sn aralığında hızlarla hareket edebilir.

Giriş

Yaklaşımlar çok sayıda, bir mikroskop kullanılarak üç boyutlu olarak floresan parçacıkların izlemek için bugüne kadar geliştirilmiştir. En ideal yaklaşımlar, tipik olarak, eksenel yönde izleme elde etmek için mikroskop emisyon optik özel modifikasyonları ile birlikte, iki boyutlu izlemek için uygun, hızlı kameraların kullanımına dayanmaktadır. Bu işlem, uygun bir zaman çözünürlüğü (10 Hz), tipik olarak zaman alıcı ve verir, ancak geleneksel bir partiküldür izlenen halinde, Z yığınlarının bir zaman dizisi gerçekleştirerek, floresan partikül izleyebilir (konfokal ya da iki ya da foton) lazer tarama mikroskobu Etkin bir geri besleme mekanizması ² ile küçük bi....

Protokol

1. Numune Hazırlama

1. % 10 fetal sığır serumu ve penisilin streptomisin 50 ng / ml, 100 IU / ml ile takviye edilen DMEM kullanılarak doku kültürü şişelerinde CHOK1 hücreleri korumak. 37 ° C sıcaklıkta 5% _CO2 nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin.
2. Hasat daha sonra 0.16 mm kadar bir kalınlığı olan bir yüzey 14 mm çaplı mikro çukuruna CHOK1 hücreleri ve plaka. 60-70% konfluansa çevresinde görüntüleme için en uygun yoğunluk için, tohum hücreleri.
3. 37 ° C'de gece boyunca inkübe hücreleri,% 5 _CO2. Yeşil ve tübülin izci yeşil 150 nM Lysotracker DND26 50 nM ihtiva eden bir çözelti içinde hücreleri HBSS (Hank Tamp....

Sonuçlar

Bu protokole göre hızlı 3D tek parçacık izleme floresan etiketli lizozomların değiştirmesini izlemek için değiştirilmiş iki-fotonlu mikroskop kullanılarak canlı hücreler içinde gerçekleştirilebilir. Yapılan deney endozom olgunlaştırma işlemi ⁹ sonra hücre içinde hareket eden, izole edilmiş bir lizozom izleme oluşur. Lizozomlar floresan yeşil boya kullanılarak boyandı ve 2-foton uyarma istismar 930 nm'de heyecanlandırdı. Bizim veriler 32 milisaniye (Şekil 1a) bir zamansal çözünürlüğe sahip

Tartışma

Yüksek zamansal çözünürlüğe sahip üç boyutlu floresan parçacıkların yörüngeleri elde son yıllarda floresan mikroskopi teknikleri ve instrumentations, muazzam gelişmelere rağmen alanında bir meydan okuma kalmıştır. Yüksek zamansal çözünürlüğü, iki boyutta izleme parçacıkları elde edilmişse, eksenel yöne uzantısı genellikle, sistemin ¹⁰ bir frekans yanıtı şiddetli bir azalma getirir.

Bu video protokolde iki foton mikroskop kullanılarak yüksek temporal çözünürlük (bu deneyde 32 msn) .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Lysotracker DND 26	Yaşam Teknolojileri	L-7526
Tübülin izci Yeşil	Yaşam Teknolojileri	T34075
Mitotracker KIRMIZI	Yaşam Teknolojileri	M7512
Tutarlı Bumelon-ultra II TI	Tutarlı
Glan Taylor Kalsit Polarize Melles	Griot	03PTA001
Galvanometre-motor aynası	Cambridge Technologies	M 6350
Dikroik ayna	Chroma Technologies	700 DCSPXR
Motorlu sahne	ASI	MS2000
Piezo	PI	P721-LLQ
Fotoçoğaltıcı tüp	Hamamatsu	H7422P-40
Veri toplama kartı	IO tech	PCI 1128-4000
Görüntüler için görüntüleme yazılımı	LFD	Global-SimFCS