Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Özet

Lenf nodu stromal hücrelerinin izolasyonu, fibroblastik retiküler hücreler, lenfatik ve kan endotel hücreleri elde etmek için enzimatik sindirim ve mekanik ayrıştırmayı içeren çok aşamalı bir prosedürdür. Tarif edilen prosedürde, canlı lenf nodu stromal hücrelerinin yüzey işaretleyici bozulmasını en aza indirmek için kısa bir sindirim otomatik mekanik ayrıştırma ile birleştirilir.

Özet

Lenf nodlarını içeren sekonder lenfoid organlar, lenfositlerin homeostazı, aktivasyonu ve farklılaşması için yapısal bir ortam sağlayan stromal hücrelerden oluşur. Adezyon molekülü CD31 ve glikoprotein podoplanin (gp38), T zonu retiküler hücreleri veya fibroblastik retiküler hücreler, lenfatik endotel hücreleri, kan endotel hücreleri ve çift negatif hücre popülasyonu içinde FRC benzeri perisitlerin ekspresyonu ile çeşitli stromal hücre alt kümeleri tanımlanmıştır. Tüm popülasyonlar için, farklı bölmelerin ayrılması ve astarlanması, farklı hücre tiplerinin çekilmesi ve bunlarla etkileşimi, drenaj akışkanlarının filtrasyonu ve lenfatik damarların kasılması dahil olmak üzere farklı işlevler tanımlanmıştır. Son yıllarda, farklı gruplar, konakçı için potansiyel olarak tehlikeli olan sitotoksik T hücresi yanıtlarını düzenlemede ve düzenlemede stromal hücrelerin ek bir rolünü tanımlamışlardır.

Lenf düğümleri, birçok farklı hücre tipine sahip karmaşık yapılardır ve bu nedenle istenen hücre popülasyonlarının izolasyonu için uygun bir prosedür gerektirir. Şu anda, lenf nodu stromal hücrelerinin izolasyonu için protokoller, değişen inkübasyon süreleri ile enzimatik sindirime dayanmaktadır; Bununla birlikte, stromal hücreler ve yüzey molekülleri bu enzimlere duyarlıdır, bu da yüzey işaretleyici ekspresyonunun kaybına ve hücre ölümüne neden olur. Burada, yüzey molekülü ekspresyonlarını koruyarak canlı tek hücrelerin süspansiyonu, lenf nodu stromal hücrelerinin süspansiyonu elde etmek için otomatik mekanik bozulma ile birleştirilmiş kısa bir enzimatik sindirim protokolü önerilmektedir.

Giriş

Lenf düğümleri, yabancı ve öz-antijenlere karşı adaptif immün yanıtları başlatılan ve koordine özelleşmiş bölmeleri bulunmaktadır. Burada sunulan prosedür lenf düğümü, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek ve çeşitli moleküllerinin yüzey ekspresyonunu korumak uygun bir lenf düğümü stromal hücrelerin erişmek için kullanılan otomatik mekanik pipetleme ile birlikte kısa bir enzimatik sindirim açıklanmaktadır.

Lenf nodu stromal hücre üç önemli fonksiyonları lenf nodu iskele oluşturacak ve yerine: ilk onlar vücut sıvıları antijenleri, patojenleri ve onların patojen ilişkili moleküler pattern (PAMP) yanı sıra, sitokinler ve tehlike ilişkili mol....

Protokol

Bu görüntü yayını ve protokol, tüm hayvan prosedürleri Kanton Kurumu, Basel-Stadt, İsviçre tarafından onaylanan hayvan protokole uygun olarak yapılmıştır.

1. Lenf düğümleri Hazırlama ve Sindirim

1. Isıtma plakası ile bir manyetik karıştırıcı üzerinde 37 ° C bir cam kapta Ön-ısıtma su.
2. Aşağıdaki gibi temel Orta hazırlayın: DMEM ortamı (piruvat olmadan),% 2 FCS ile takviye edilmiş, 1.2 mM _CaCl2 ve pen / strep (penisilin 100 birim, streptomisin, 100 ug).
3. Kullanmadan önce tüm diseksiyon aletleri sterilize edin.
4. CO ₂ boğulma başına lenf nodu donör fareler Euthanize ve aseptik lenf düğ....

Sonuçlar

Mevcut protokol nedeniyle bir çok kanallı otomatik pipet ile mekanik çözümlemesiyle kısa bir sindirim süre (45 dk maksimum) ile Bağlantı ve ark., ^6, 2007 tarafından yayınlanan bir modifiye sindirim protokoldür. Buna ek olarak, işlem, daha standart, farklı lenf düğümü stromal hücrelerin yüzey markerlerinin bozulmasını en aza indiren ve aynı anda birden fazla numunenin kullanılması mümkün olur.

Collagenasein IV ve Kollagenaz D Fletchers protokolünde ¹³ Bağlantıla.......

Tartışma

Lenf nodu stromal hücrelerin çalışması nedeniyle son zamanlarda yayımlanmış iki sindirim protokolleri ^6,13 gelişimine bir araştırma odağı haline geldi. Her iki protokol tek bir lenf düğümü stromal hücreler elde etmek için yeterli, ancak sindirim enzimlerinin kullanılması ve sindirim zaman içinde farklılık gösterir. Stromal hücreler ve onların yüzey belirteçleri enzimatik sindirim ve mekanik strese karşı hassas olduğu için, optimize edilmiş bir protokol gereklidir.

Taze kesilmiş le.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM	LifeTechnologies-Gibco	41965-039
FCS			Nihai konsantrasyon% 2
CaCl2	Sigma	499609	Nihai konsantrasyon 1.2 mM
Kollajenaz IV	Worthington Biochemical Corporation		> mg kuru ağırlık başına 160 birim, 1 mg / ml nihai konsantrasyonda kullanın
Kollajenaz D	Roche 11088882001		3.5 mg / ml
DNAse I	Roche 'de kullanın;	40 &	mikroda 11284932001 kullanım; g/ml
Karıştırma mıknatısları	FAUST		5 mm uzunluğunda-2 mm ø
Polistiren yuvarlak tabanlı tüpler 5 ml	Falcon-BD Bioscience
Isıtma fonksiyonlu manyetik karıştırıcı	IKA-RCT standardı	9720250
Petri kapları 100 mm, steril	TPP	6223201
25 G iğneler	Terumo
anti fare CD45 Ab	Biolegend		Klon 30-F11
anti fare CD11c Ab	Biolegend		Klonu N418
anti fare Podoplanin Ab	Biolegend		Klonu 8.1.1
anti fare CD31 Ab	Biolegend		Klonu MEC13.3
Eppendorf Xplorer plus, Çok Kanallı	Eppendorf	4861 000.821/830	1.250 & mikro; hacim
anti fare CD140a	Biolegend		Klonu APA5
anti fare CD80	Biolegend		Klonu 16-10A1
anti fare CD40	Biolegend		Klonu 1C10
anti fare I-Ab	Biolegend		Klonu AF6-120.1
anti fare CD274 (PD-L1)	Biolegend		Klonu 10F.9G2
CANLI/ÖLÜ Düzeltilebilir Yakın IR Ölü Hücre boyama kiti	Invitrogen	L10119