Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

70.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51805

⸱

20 Ekim 2014

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

Bu makalede

Özet

Klatrin aracılı endositoz, hızlı ve oldukça dinamik bir süreç, sinyal reseptörleri de dahil olmak üzere birçok proteini içselleştirir. Burada açıklanan protokol, bireysel endositik olayların kinetiğini doğrudan görselleştirir. Bu, endositik makinenin çekirdek üyelerinin birbirleriyle nasıl koordine olduğunu ve protein yükünün bu süreci nasıl etkilediğini anlamak için gereklidir.

Özet

Birçok önemli sinyal reseptörü, iyi çalışılmış klatrin aracılı endositoz (CME) süreci yoluyla içselleştirilir. Endositozdaki küresel değişiklikleri ölçen geleneksel hücre biyolojik tahlilleri, CME'ye katılan 30'dan fazla bilinen bileşeni tanımlamıştır ve biyokimyasal çalışmalar, bu bileşenlerin çoğunun bir etkileşim haritasını oluşturmuştur. Bununla birlikte, CME'nin, düzenlemesi karmaşık ve hassas olan oldukça dinamik bir süreç olduğu giderek daha açık hale geliyor. Bu el yazmasında, klatrin aracılı endositik makinenin bileşenlerinin dinamiklerini, canlı hücrelerde gerçek zamanlı olarak, bu sürece aracılık eden bireysel olaylar düzeyinde doğrudan görselleştirmek için Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobunun kullanımını açıklıyoruz. Bu yaklaşım, fizyolojik düzenlemede görüldüğü gibi, endositozu küresel olarak bloke etmeden değiştirebilecek ince değişiklikleri aydınlatmak için gereklidir. Bu tekniği, ortaya çıkan bir ilgi alanını, farklı klatrin kaplı çukurların (CCP'ler) dinamiklerini modüle etmede kargo bileşiminin rolünü analiz etmek için kullanmaya odaklanacağız. Bu protokol, yaygın olarak bulunan çeşitli floresan probları ile uyumludur ve hücre yüzeyinden içselleştirilen birçok kargo molekülünün dinamiklerini görselleştirmek için uygulanabilir.

Giriş

Klatrin aracılı endositoz (STE) gibi bir işlem vezikülleri içine 1-3 kargo toplamak ve plazma membranını işlemek için klatrin aracılı endositik makine birçok bileşenden iyi zamanlanmış girişte bağlıdır. CME endositozun 1 doğmakta sitelerinde bir araya gelip zar deforme ve kargo-adaptör proteinler tarafından başlatılır. Bu proteinler, klatrin kaplı çukur (CCP) 4 meydana getiren bir kafes benzeri bir yapı halinde birleşmektedir örtü proteini klatrin, işe. CCP tamamen esas olarak büyük GTPaz, Dynamin etki ile küresel şekil, membran kesimleri, içine monte edildiğinde, serbest klatrin kaplı vezikülleri (CCVS 5,6) oluşturur. Bu içselleştirme bileşenleri CME sanmı için yeniden kullanılmasına izin, klatrin kat hızlı sökme tetikler.

CME katılan proteinlerin keşfi ve karakterizasyonu geleneksel Bioch köklü olmuşturemical, genetik ve mikroskopi teknikleri 4-6,8. Bu deneyler, bu endositik bileşenlerin rolleri ve etkileşim noktaları aydınlatmıştır. Ticareti makine temel bileşenleri tanımlamak için yararlı olmakla birlikte, bu deneyler, yüksek STE bileşenleri veya yük konsantrasyon dinamik davranışını yakalama sınırlıdır. CME tanımlanan adımda protein modüllerin setleri koreografisini meclisi tarafından tahrik edilir çünkü bu, kritik bir sınırlama olduğunu ve bireysel endositik olayların dinamikleri küçük değişiklikler endositoz ile ilgili geniş bir kümülatif sonuçlar doğurabilir beri. Bundan başka, son veriler, ayrı ayrı KDN bu sürecin fizyolojik düzenleme yüksek uzamsal ve zamansal olarak kısıtlı 9-14 düşündüren, bileşim içinde ve davranış bakımından farklılık olabileceğini göstermektedir. Bireysel endositik olayları görselleştirmek, bu nedenle, CME katılan bir çok gereksiz proteinler ve nasıl bu proteinler kontrol edilebilir b var neden anlamak esastıry fizyolojik sinyaller kargo içselleşmesini düzenler.

Burada canlı hücrelerin içindeki bireysel CCP dinamiklerinin düzeyinde CME gözlemlemek için Toplam İç Yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) kullanımını tarif etmektedir. TIRFM cam lamel ve hücrelerin 15,16 sıvı ortam arasındaki kırılma indeksi arasındaki farka dayanır. Uyarım ışığı önemli açıdan daha hücrelere doğru yönlendirilir, bu dahili lamel yaklaşık 100 nm olarak uzanan bir aydınlatma alanını koruyan ince bir genliği azalan bir dalga oluşturulması, yansıtılır. Bu, bu dar alan içinde sadece floresan moleküller heyecanlı olmasını sağlar. Pratik olarak bu ya da plazma zarının yakın fluoresan moleküller uyarılmasını sağlar ve hücrenin iç kısımlarından floresans en aza indirir. Bu plazma zarı, co olayları görselleştirmek için önemli ölçüde daha yüksek sinyal-gürültü oranı ve z ekseni çözünürlüğü sağlarBu tür geleneksel epifluoresan veya konfokal floresan mikroskopisi gibi daha yaygın kullanılan modlara mpared. Biz de bir tanıtıcı ve pratik düzeyde tanımlamak, yaygın olarak kullanılan bir görüntü analizi platformunun kullanımı analiz ve basit morfolojik özellikleri ve bireysel kargo endositik olayların dinamiklerini ölçmek için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Floresan 1. İfade Kültür Hücrelerinin CME Bileşenleri Takip

HEK293 hücreleri GPCR'dir biyoloji ve endositozı incelemek için yaygın olarak kullanılan, ve bu nedenle bu protokolde model olarak kullanılan faydalı model hücrelerdir. Aşırı ifadesi ve düşük bir sitotoksisite olmadan homojen bir ifade sağlayan herhangi bir transfeksiyon protokolünü kullanır.

  1. Steril bir laminer akış kaputu tüm hücre kültürü taşıyınız. % 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile Dulbecco'nun Düzeltilmiş Esansiyel Ortamı (DMEM) içinde, 1 ml, 12 oyuklu bir plakanın 4 kuyu doldurun. HEK293 hücrelerinin konfluent T25 şişesi kaynaktan 4 kaynağının her birine, sırasıyla 01:50, 01:25, 01:16, 01:10 seyreltin.
    1. Seçenek olarak ise, üreticinin talimatlarına uygun olarak, istenilen büyüklükte bir çok-yuvalı plaka hücreleri tohum. Bir 12-yuvalı plaka içine, 2 x 10 4 hücrelerini - 0.4 Tohum. % 5 CO2 ve% 95 nem ile, steril bir 37 ° C, gece boyunca hücrelerin büyümesine.
      NOT: Bu büyüme r göz önüne alındığındaAteş koşulları ve hücre çizgileri bağlı olarak değişir, bu transfeksiyon için ideal bir ortak akışkanlığa ertesi gün ya da iki kez transfections gerçekleştirme olanağını sağlamak için çok sayıda kuyu tohum tercih olabilir.
  2. Ertesi sabah, bir kuyu ~ Transfeksiyonda% 70 konfluent (Şekil 1B bakınız) seçin. Hayır de bu safhasına ulaştığı takdirde, başka bir gün bekleyin.
    NOT:% 70 confluency HEK293 hücreleri için idealdir. Hücre ölümü ve toksisite daha seyrek sonuçları hücreleri transfecting. Zayıf ifade aşırı konfluent hücreler transfekte sonuçları.
  3. Üreticinin protokolünde tarif edildiği gibi (transfeksiyon kiti) AT 60 ul tampon, L'yi kodlayan plasmidin 400 ng GPCR'ler ve / veya klatrin makine bileşenlerini ve bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine Arttırıcının 2.4 ul etiketlendi. 2 sn Vortex yeterli karışmasını sağlamak ve altındaki sıvıyı toplamak için 2 saniye boyunca 2.000 xg'de mikrofüjde dönmeye.
  4. EkleÜreticinin protokolünde tarif edildiği gibi 6 ul Effectene. Bir mikrofüjde 2 saniye boyunca 2.000 xg'de 2 sn Vortex, ve spin altındaki sıvıyı toplamak için. Transfeksiyon kompleksi misellerin oluşumu için izin vermek için 20 dakika boyunca bekleyin.
  5. Kuyudan medya aspire transfekte edilecek. Yavaşça miseller kırma etkisini azaltmak amacıyla, yavaş yavaş transfeksiyon tepkin madde karışımı,% 10 FBS bulunan DMEM, 0.8 ml ilave edilir ve pipetleme karıştırın ve. Taraftan çok yavaş kuyuya medya ve transfeksiyon karışımı ekleyin. Iyi bir mikropipet kullanarak mikrosantrifüj tüpüne kalan transfeksiyon karışımı ekleyin.
    Not: İsteğe bağlı olarak, hücreler nazik transfeksiyon ve alt geçici ekspresyonu ile sonuçlanan ilave besin vermek üzere transfekte de% 10 FBS'li DMEM'e ilave bir 0.5 ml ilave edilir.
  6. 5 saat boyunca 37 ° C inkübatör hücreleri dönün.
  7. Transfeksiyon karışımı ihtiva eden aspire ortam. % 10 FCS içeren DMEM 1 ml ile değiştirin. İzinHücreler gece boyunca büyümeye.
  8. Ertesi gün, daha önce otoklav ile sterilize kaplanmamış lamelleri, hücreleri geçer.
    1. Her bir oyuğa, 1 mM EDTA ile fosfat tamponlu tuz (PBS) 0.5 ml ilave edilir. Seçenek olarak ise,% 0.05 tripsin-EDTA, 0.5 ml kullanılır. 1 dakika boyunca kuluçka makinesi içinde bırakın.
    2. 3 yuvarlak bir 6-yuvalı plakanın gözleri içerisine ayrı ayrı steril 25 mm kapak yerleştirin. Ortam, 2 ml Her bir oyuğa doldurun. Yavaşça lamel altındaki hücrelerin gelişimini önlemek için kuyunun dibine kadar lamel itin.
    3. El kuyunun dibinden hücrelerini kaldırmak için kuyu çalkalayın. % 10 FCS içeren DMEM içinde tekrar süspansiyon 1 mi ekleyin. 3 lamelleri arasında eşit bir 12-yuvalı plakanın 1 kuyusundan kaldırdı hücreleri dağıtın. Alternatif olarak, 3 cam dipli yemekleri hücreleri plaka.
  9. Hücreler, görüntüleme önce en az 48 saat boyunca lamelleri büyümeye izin verin. Hücreler yayılmış ve düz olduğundan emin olun.

2.Görüntüleme ÇKP ve Kargo Dinamikleri kullanma TIRFM

  1. Imalatçının protokolüne göre, Alexa Fluor protein etiketleme kiti kullanılarak Alexa boya ile Birleşmiş M1 anti-Flag antikorları yer alır. Seçenek olarak ise, ön-birleştirilmiş antikorlar temin edilebilir.
  2. (Görüntü 37 ° C'de 10 dakika boyunca 50 mM HEPES, pH 7.4 ve% 10 FBS ile% 10 FBS ya da Opti-MEM ile önceden ısıtılır Leibovitz ortamı, 1 ml 1.000 seyreltme: 1 de antikorlar ile önceden inkübe hücrelerin orta), hücre yüzeyi üzerinde FLAG-etiketli GPCR'ler etiketlemek için. GFP gibi genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri, etiketleri olarak kullanılan if (ayrıntılar için bakınız tartışma) bu adımları atlayın.
  3. Canlı hücre görüntüleme odasına lamel aktarın. Alternatif olarak, cam tabanlı tabaklar, aspirat antikor etiketleme ortam için önceden ısıtılmış görüntüleme ortamının 700 ul ilave edin.
    1. Bir çift forseps kullanın ve bir kanca içine 25 gauge iğne ucu bükün.
    2. Dominant elin forseps bir çift tutun. Oth bükülmüş iğne tutuner. Aşağı doğru cam kanca eğrileri kadar iğne çevirin. Bu lamel üzerine kanca kadar yavaşça 6-plaka alt kısmında, aşağı iğne, kanca yanını sürükleyin. Bu hücreleri ayırmak gibi, lamel yüzeyini çizmeyin özen gösterin. Yavaşça kuyunun dibinden lamel yukarı kaldırın. Destek için kuyunun duvara lamel dengeleyin.
    3. Lamel kenarına yakın tutun ve görüntüleme odasına lamel, hücre tarafı yukarı taşımak ve odasını monte forseps kullanın. Önceden ısıtılmış görüntüleme ortamının 700 ul (ya da uygun bir miktar) ilave edin. Çatlama veya kırılma önlemek için baskı yapmadan dikkatli lamelleri tutun.
  4. Mikroskop üzerine bölmeyi aktarın ve bir sahne ısıtıcı veya çevrelenmiş bir kuluçka makinesi kullanılarak, 37 ° C'de hücre sıcaklığı tutmak.
  5. Bir 100X veya 60X TIRF yağ daldırma hedefi (yukarıda 1.45 NA veya) kullanarak odak noktası haline hücreleri getirin. Geleneksel epifluoresan veya con görüntü hücreleraydınlatma (yani TIRFM) odak modları uygun yapılan ifade eden hücreleri belirlemek için. Hücreler yapma TIRF aydınlatma ince derinliği neredeyse görünmez out-of-odak zor odak düzlemi ve hücreleri bulmak için.
    NOT: Bazı sistemler kritik açı yukarıdaki lazerin geliş açısını taşıyarak, geleneksel epifluoresan görüntü için TIRFM için aynı lazer kullanır. Önemli bir güvenlik önlemi olarak, her zaman lazer ışınının açısının farkında olması ve her zaman gözlemciden uzak yönlendirmek.
  6. Hücrede plazma zarının ana hatları kaybolur ve hücre merkez görünene kadar, bir ifade hücresinin alt yüzeyinden aşağı Odak. Bu, μ-opioid reseptörü (Şekil 2A) gibi bir plazma membran lokalize kargo protein ile belirgindir.
  7. TIRF görüntüleme geçin.
    1. Geleneksel epifluoresan görüntüleme için aynı lazerler kullanıyorsanız, geliş açısını artırmakHücrenin iç out-of-odak floresan kadar lazer kaybolur ve hücre etrafında plazma zarı hiçbir anahat görülmektedir. (Şekil 2A ve 2B Şekil 2C karşılaştır)
      Not: TIRFM, odak düzlemi hareket odaklanma ve / veya sönük tamamen dışarı gitmek için görüntü neden olur ve genel floresan seviyeleri, aydınlatma, küçük derinlik nedeniyle azalır. Bu nedenle, bir alternatif yöntem TIRFM aydınlatma geçmek için, sonra plazma zarına odağını sonra floresan kaybederler kadar gelişlerini artırmak ve / geleneksel konfokal epifluoresan hücrenin merkezindeki ilk odak etmektir.
    2. Bir kez TIRFM yılında, uyarma lazer hedefi üzerinden geri yansıtır ve objektif üzerinde görünür olmadığından emin olun. Lazer nokta görünür ise kontrol ederek bu onaylayın.
      NOT: Geleneksel epifloresans veya konfokal modlarında, lazer aydınlatma, amacı üzerinde görülebilirtavana gibi.
    3. Net bir görüntü elde etmek için odak rafine. Endositik makine ana bileşenleri, örneğin klatrin gibi, puncta görünür olacaktır. Ince odağı ayarlayın, böylece punktumlarda mümkün olduğunca yuvarlak gibidir.
      NOT: filopodia farklı görünür kadar membran lokalize kargo için, ince odağı ayarlayın.
    4. Bu aynalar ve TIRF açısı gibi tüm görüntüleme parametrelerini kaydetmek için bir toplama programı kullanın. Gerekli tüm dalga boyları için yapın.
  8. İstenen tüm endositik işaretlerini ifade eden hücreleri bulmak için lamel etrafında tarama: μ-opioid reseptörü ve Şekil 3A'da gösterilen örnekte adaptör β-arrestin. Ifade eden fakat aşırı ifade etmeyen hücreleri seçin. Ayrıntılar için tartışma bakın.
  9. Hücreleri belirlendikten sonra, 10 dakika boyunca her görüntü 3 saniye kazanır. Bu koşullar altında görüntülenmiş HEK293 hücrelerinde bir CCP ortalama ömrü aroA olduğu için bu, bir CCP ömrünü yakalamak için yeterlidirund 40 sn 10-11. Bu ÇKP'nin gözlemlemek için yaklaşık 12-14 kare verir. Örneğin Sinema 1 bkz. Görüntü ek hücreleri tüm adımları tekrarlayın.

Manuel Doğrulaması endositik Dynamics 3. Analizi

CCP ömürlerinin manuel doğrulama ölçüde tespit edilebilir CCP sayısı ile sınırlı olmasına rağmen, yine de görüntü ve saptama eserler küresel değişimler tarafından engellenmeksizin algılama doğru bir yolu kalır. Ayrıntılar için tartışma bakın.

  1. ImageJ dosyasını açın. Görüntüler serpiştirmeli kanalları ile tiff dosyaları tek bir yığın olarak depolanır. Hyperstacks görüntüleri dönüştürün. Hyperstacks> hyperstack Stack> Görüntü git. (Görüntüleme β-arrestin ve μ-opioid reseptör, 2 girerseniz yani) edinilen kanal numarasını girin, (TIRFM bir tek düzlem olan) Z yığını için 1 girin ve filmin kare sayısı (yani 10 dk 1 çerçeve her 3 sn i de filmpop-up pencerede ler 200).
  2. Hyperstack biçimi iki kaydırma çubukları ile bir pencere verir. Zaman içinde hareket etmek kanalları ve alttan taşımak için üst çubuğunu kullanın. Ömürleri tahlil edilecek proteinin kanalına gidin.
  3. Tüm süreler görünmez önceden var CCP'lerin dahil azaltmak için 10 veya film 15 kare taşı. Rastgele seçilen bir nokta etrafında bir İB kutusunu çizin.
  4. Bir nokta görünür kare sayısını.
    Not: endositik olayların 10,11,16-19 üç morfolojik kategorilerinin örnekleri için Şekil 3B ve 3C.

Amaç Tanıma tarafından endositik Dynamics 4. Analizi

Amaç tanıma bir hücrede görüntülü CCP hemen hemen tüm ortaya çıkmasına imkan verir, ancak nedeniyle hatalı yapıların sahte tespiti için hata eğilimli olabilir. Avantaj ve e dezavantajlarını tartı Ayrıntılar için tartışma bakınACH yöntemi. Özel olarak oluşturulmuş bir algoritma dahil olmak üzere çeşitli programlar, objektif KDN'ler tespit etmek için kullanılabilmektedir. Bu protokol Imaris, bir görüntü analizi yazılımı (Malzeme) kullanılarak CCP objektif tanıma açıklar.

  1. Başlamak için, görüntü analiz yazılımı ham görüntü dosyasını açın. Varsayılan olarak, birleştirilmiş bir renkli görüntü belirir. Bir kanalın parlaklığını ayarlamak için "Ekran Ayarı" penceresini kullanın. Görüntülenen rengini değiştirmek için bir kanal adını tıklayın. Onun görüntülenmesini önlemek için kanalın yanındaki kutunun işaretini kaldırın (Şekil 4A bakınız).
  2. Turuncu noktalar ile ikonuna tıklayarak "Noktalar" oluşturun. Şekil 4B bakın. Hücrenin etrafında İlgi (ROI) bir bölge seçin. Bkz Şekil 4C. Yanlış parlak önde gelen kenarlarını ve plaketleri algılar alanları hariç tutmak için bir yatırım getirisi kullanın. Ayrı, farklı ekspresyon düzeyleri ile birden hücreleri analiz.
  3. Yazarlara bir Spot çapını ölçünalgoritması için de ilk tahminler. "Dilim" moduna geçmek ve onun çapını ölçmek için bir nokta kutup uçlarında tıklayın. Şekil 4E bakın. Oluşumundan sonra ve kesiminie önce kendi istikrar yüksekliğinde bir ÇKP göstergesidir bakmak 4 veya 5 adet yuvarlak Lekeler için bunu yapın. Bir mikron yakın onda kadar ortalama bir çapı hesaplamak için bu ölçümlerin.
  4. Noktalar algılar. "Aşan" moduna geri dönün. Tespiti için uygun kanalı seçin. Genellikle 0.3 veya 0.4 mikron ortalama ölçülmüş çapını girin. Leke ölçmek için mavi ileri oka tıklayın. Şekil 4E bakın. Spot çapı göz ardı edilirse, floresan sahte noktaları Lekeler olarak tespit edilecektir. Çapı çok büyükse, gerçek Noktalar göz ardı edilecektir. Ne zaman emin, biraz daha düşük tahmin ve daha sonra yanlış algılamaların filtre.
  5. Kalite tarafından Noktalar Filtre. Geri olmadan mümkün olduğunca çok sayıda noktalar yakalamak için filtreyi ayarlayınzemin. Kalite filtre varsayılan 20 olarak seçilir. Şekil 4F bakın.
    1. Uygun bir eşik ayarlamak için bir kılavuz olarak "Kalite" eğrisini kullanın. Eğrisinin bu ilk dalış için sol fare tuşu ile filtrenin alt eşiğini taşıyın. Bu pozisyon genellikle sadece görünür Spotlar algılama inceltir gibi bu filtre için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Şekil 4F bakın.
    2. Algılanan Noktalar küre veya merkez piksel gibi film görünür. "Renkler" sekmesini kullanarak, kolay bunları görmek yapmak için bir zıt renk lekelerin rengini ayarlayın. Her karede Noktalar yorumlayan Filmde ilerlemek. Amaç kendi yaşamların bütünlüğü için mümkün olduğunca çok Noktalar tespit etmektir.
    3. Sönük Spotlar ortadan kaldırın veya elle onların yaşamların kurs boyunca iyi tespit değil gibi, daha sonra sürekli parça içine bağlamak.
    4. Bir "Yoğunluk" fil ile parlak plaklar kaldırter, gerekirse. Yeni bir filtre eklemek için yeşil artı işaretine tıklayın. Şekil 4F bakın. Veya belirli bir floresan sinyalleri Noktaları filtrelemek için Yoğunluk filtre oluşturun. Eşiğini ayarlamak için (4,5 tartışılan Kalite Curve benzer) oluşturulan Yoğunluk eğrisi kullanın. Parlak Spotlar temsil eğrinin aşırı sol ucunu kaldırmak için sol fare düğmesini kullanın.
      NOT: Büyük plak yapıları hücrede parlak unsurları arasında genellikle, onlar kolayca bu filtre ile dışlanır.
    5. CCPs Spots olarak algılanır ve parlak plaklar artık tespit sağlamak için film boyunca ilerleyin. Şekil 3D CCP'lerin algılama (beyaz küre ile gösterilen) bir hücreyi kaliteli filtre ile optimize edilmiş ve plaklar kalitesi ile dışlandı gösterir filtre.
    6. Kaliteli filtre ile parlak hücre kenarları azaltın. Parlak nesneler hala bir sonraki adımda, elle kaldırılması gerekebilir. Mavi ile devamok.
    7. Düzenleme Spotlar ekranda anormal Noktalar çıkarın. Modunu "Seç" geçin. Yerinde tıklayın. Bu sarıya dönecektir. "Sil" tıklayın. Algoritması oluşturmaya devam etmek için mavi oka tıklayın. Şekil 4G bakın.
  6. Tedbir izler. "Brown hareketi." ÇKP herhangi yönettiği hareketi, plazma zarından sadece minimal sürükleyen sergilemek olmamalı şarkıları ayarlayın. Bu algoritma bu hareket için en uygun. Şekil 4H bakın.
    1. 0.7 mikron gibi küçük bir değere Max Uzaklık ayarlayın. Şekil 4H bakın.
      NOT: Küçük bir mesafe ayarlama bitişik Spot bağlantısını en aza indirir ve hala ÇKP veya hücre hareketi ile bir hücre nokta sürekli izleme sağlar.
    2. Bu arda eksik olan tek kare varsa devam etmek için bir parça verir 1. Max Gap Boyut ayarlayın. Parçaları hesaplamak için mavi oka tıklayın. Şekil 4H bakın.
      NOT: Gen fazla 3 nedenleri farklı pistlerde ap boyutları yanlış birbirine bağlantılı olması.
    3. Inceleyen Anahtarı parça "Dragon Tail." Ilerleyin algılama kalitesini gözlemleyerek film boyunca. Bitişik noktalar bağlanmıştır ise, 0,7 um altında En mesafe azalır. Noktalar çok kolaylıkla kırılmış yapılıyorsa, Max Gap Boyutu artırmak. Parçaları oluşturmak için mavi oka tıklayın. Bu filtre parçaları ekranına götürür. Şekil 4H bakın.
  7. Filtre Parçalar ve İhracat Verileri. Ek parlak plaklar kaldırmak için "Şiddeti" filtre kullanın. TIRF alanına girmek endozomları kaldırmak için bir "Deplasman" filtre kullanın. Uzun Noktalar hem de daha uzun deplasmanları olacak gibi, dikkatli olun. Protokolü tamamlamak için yeşil çift oku tıklatın. Şekil 4I bakın.
    1. Filtrelerle olamazdı Tracks yanlış pozitif algılamalarını kaldırmak için, kalem simgesiyle, Düzen Parçalar sekmesini kullanın. Durdurulan kontrol edininuities veya yanlış bağlantıları. Iki parça bağlamak için, sonra da Düzen Parçalar kutusuna "Bağlan" üzerine tıklayın, Ctrl-Sol-Click kullanarak onları seçin. Ayrı noktalar halinde parçalarını kesmek için, bir parça seçin ve "Bağlantıyı kes" çarptı. Ile birden Spotlar seçin Ctrl + Sol-tıklayın ve yeni bir Parça oluşturmak için "Bağlan" butonuna tıklayınız. Yöntem 4.5.7 anlatılan Düzenleme noktaları için aynıdır. Şekil 4J bakın.
    2. Veri aktarmak için, istatistik sekmesine gidin. Seçilen istatistik ihracat tek disket ikonuna tıklayın. Tüm istatistikleri ihracat disket bir dizi gibi görünüyor simgesine tıklayın. "Parça Süre" istatistiği endositik parça uzunluğunu içerir. Şekil 4K bakın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kullanarak canlı hücre TIRF Mikroskopi biz μ-opioid reseptörün (MOR) endositik dinamikleri kaydettik, G-protein kenetli reseptör (GPCR) ve endositik adaptör protein β-arrestin. Β-arrestin yapı geçici olarak Şekil 1 'de belirtilen protokol kullanılarak, sabit bir şekilde ifade eden MOR hücre hattına transfekte edilmiştir ve 96 saat sonra görüntülenmiştir. Stabil hücre boyunda m ya da N-terminal bir pH-duyarlı GFP ile etiketlenir. Bu floresan protein yalnızca nötr dışı sıvıda fluoresces. Ayrıca, sadece bi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, gerçek zamanlı olarak canlı hücreler bireysel CCP düzeyinde klatrin aracılı endositoz (STE) görselleştirmek için TIRFM kullanımını tarif eder. CME birçok mekansal ve zamansal ayrı münferit olayların kümülatif etkinin aracılığı hızlı ve son derece dinamik bir olaydır. Bu içselleştirme biyokimyasal ölçümleri olarak şu anda kullanılan çoğu deneyleri, yüzey biyotinilasyonunu veya bağlayıcı ligandı, akış sitometri veya içselleştirilmiş proteinler, ya da proteinlerin elektron mikroskobik lokalizasyonu miktarını ölçen ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, yardımları için Dr. C. Szalinski, H. Teng ve M. Bruchez'e, teknik yardım ve tavsiye için Imaris, R. Vistein ve D. Shiwarski'ye ve reaktifler ve yardımcı tartışmalar için Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin ve Dr. W Almers'e teşekkür eder. T32 hibesi tarafından sağlanan finansman, SLB ve NIH DA024698 ve DA036086 MAP'a NS007433.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEM/L-glutamin ve sodyum piruvat ile Yüksek GlikozFisher Scientific 
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS), kalsiyum yok, magnezyum yokGibco, Life Technologiestarafından 21600-010
EDTA İçermeyen AsitAmresco0322-500G
Fetal Sığır SerumuGibco, Life Technologiestarafından 10437-028
Leibovitz'in L-15 Medium, fenol kırmızısı Gibco yok, Life Technologies21083-027
Opti-MEMGibco, Life Technologies
HEPESCellPURE by Fisher ScientificBP2937-100
EffecteneQiagen301425Transfeksiyon reaktifi
25 mm kapak camıFisher Scientific12-545-86
Corning hücre kültürü ile muamele edilmiş şişeler, 25 cm2Fisher Scientific10-126-28
Hücre kültürü 6 oyuklu plakaGreiner Bio-One, VWR82050-896
Monoklonal ANTI-FLAG M1Sigma AldrichF3040-5MG
[D-Ala2< / sup>, N-Me-Phe4< / sup>, Gly5< / sup>-ol] -Enkefalin asetat tuzu (DAMGO)Sigma AldrichE7384-5MG
Alexa Fluor 647 Protein Etiketleme KitiYaşam TeknolojileriA20173
ImageJNIHhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris Görüntü analiz yazılımıBitPLanehttp://www.bitplane.com/imaris/imaris, otomatik analiz için
Nikon Eclipse Ti ters mikroskop ve filtre küpleri ve filtreler dahil olmak üzere gerekli aksesuarlarNikon
Nikon TIRF kolu için gerekli adaptörler Nikon Eclipse TiNikonGeliş açısını ayarlamak için
iXon+ EMCCD kamera ve adaptörlerAndor
SH3024301tarafından

Kaynaklar

  1. McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
  3. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
  4. Ungewickell, E., Branton, D. Assembly units of clathrin coats. Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).
  5. Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
  6. Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
  7. Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
  8. Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
  9. Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
  10. Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
  11. Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
  12. Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
  13. Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
  14. Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
  15. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
  16. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
  17. Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
  18. Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
  19. Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
  20. Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
  21. Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  23. Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
  24. Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
  25. Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
  26. Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
  27. Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
  28. Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. Redistribution of caveolae during mitosis. J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).
  29. Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
  30. Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Klatrin Kapl ukurlarFloresan MikroskobuG r nt AnaliziCanl H cre G r nt lemeEndositik DinamiklerKargo Kompozisyonu
TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.