TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Klatrin aracılı endositoz (STE) gibi bir işlem vezikülleri içine ^1-3 kargo toplamak ve plazma membranını işlemek için klatrin aracılı endositik makine birçok bileşenden iyi zamanlanmış girişte bağlıdır. CME endositozun ¹ doğmakta sitelerinde bir araya gelip zar deforme ve kargo-adaptör proteinler tarafından başlatılır. Bu proteinler, klatrin kaplı çukur (CCP) ⁴ meydana getiren bir kafes benzeri bir yapı halinde birleşmektedir örtü proteini klatrin, işe. CCP tamamen esas olarak büyük GTPaz, Dynamin etki ile küresel şekil, membran kesimleri, içine monte edildiğinde, serbest klatrin kaplı vezikülleri (CCVS ^5,6) oluşturur. Bu içselleştirme bileşenleri CME sanmı için yeniden kullanılmasına izin, klatrin kat hızlı sökme tetikler.

CME katılan proteinlerin keşfi ve karakterizasyonu geleneksel Bioch köklü olmuşturemical, genetik ve mikroskopi teknikleri ^4-6,8. Bu deneyler, bu endositik bileşenlerin rolleri ve etkileşim noktaları aydınlatmıştır. Ticareti makine temel bileşenleri tanımlamak için yararlı olmakla birlikte, bu deneyler, yüksek STE bileşenleri veya yük konsantrasyon dinamik davranışını yakalama sınırlıdır. CME tanımlanan adımda protein modüllerin setleri koreografisini meclisi tarafından tahrik edilir çünkü bu, kritik bir sınırlama olduğunu ve bireysel endositik olayların dinamikleri küçük değişiklikler endositoz ile ilgili geniş bir kümülatif sonuçlar doğurabilir beri. Bundan başka, son veriler, ayrı ayrı KDN bu sürecin fizyolojik düzenleme yüksek uzamsal ve zamansal olarak kısıtlı ^9-14 düşündüren, bileşim içinde ve davranış bakımından farklılık olabileceğini göstermektedir. Bireysel endositik olayları görselleştirmek, bu nedenle, CME katılan bir çok gereksiz proteinler ve nasıl bu proteinler kontrol edilebilir b var neden anlamak esastıry fizyolojik sinyaller kargo içselleşmesini düzenler.

Burada canlı hücrelerin içindeki bireysel CCP dinamiklerinin düzeyinde CME gözlemlemek için Toplam İç Yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) kullanımını tarif etmektedir. TIRFM cam lamel ve hücrelerin ^15,16 sıvı ortam arasındaki kırılma indeksi arasındaki farka dayanır. Uyarım ışığı önemli açıdan daha hücrelere doğru yönlendirilir, bu dahili lamel yaklaşık 100 nm olarak uzanan bir aydınlatma alanını koruyan ince bir genliği azalan bir dalga oluşturulması, yansıtılır. Bu, bu dar alan içinde sadece floresan moleküller heyecanlı olmasını sağlar. Pratik olarak bu ya da plazma zarının yakın fluoresan moleküller uyarılmasını sağlar ve hücrenin iç kısımlarından floresans en aza indirir. Bu plazma zarı, co olayları görselleştirmek için önemli ölçüde daha yüksek sinyal-gürültü oranı ve z ekseni çözünürlüğü sağlarBu tür geleneksel epifluoresan veya konfokal floresan mikroskopisi gibi daha yaygın kullanılan modlara mpared. Biz de bir tanıtıcı ve pratik düzeyde tanımlamak, yaygın olarak kullanılan bir görüntü analizi platformunun kullanımı analiz ve basit morfolojik özellikleri ve bireysel kargo endositik olayların dinamiklerini ölçmek için.

Floresan 1. İfade Kültür Hücrelerinin CME Bileşenleri Takip

HEK293 hücreleri GPCR'dir biyoloji ve endositozı incelemek için yaygın olarak kullanılan, ve bu nedenle bu protokolde model olarak kullanılan faydalı model hücrelerdir. Aşırı ifadesi ve düşük bir sitotoksisite olmadan homojen bir ifade sağlayan herhangi bir transfeksiyon protokolünü kullanır.

1. Steril bir laminer akış kaputu tüm hücre kültürü taşıyınız. % 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile Dulbecco'nun Düzeltilmiş Esansiyel Ortamı (DMEM) içinde, 1 ml, 12 oyuklu bir plakanın 4 kuyu doldurun. HEK293 hücrelerinin konfluent T25 şişesi kaynaktan 4 kaynağının her birine, sırasıyla 01:50, 01:25, 01:16, 01:10 seyreltin.
   1. Seçenek olarak ise, üreticinin talimatlarına uygun olarak, istenilen büyüklükte bir çok-yuvalı plaka hücreleri tohum. Bir 12-yuvalı plaka içine, 2 x 10 ⁴ hücrelerini - 0.4 Tohum. % 5 _CO2 ve% 95 nem ile, steril bir 37 ° C, gece boyunca hücrelerin büyümesine.
      NOT: Bu büyüme r göz önüne alındığındaAteş koşulları ve hücre çizgileri bağlı olarak değişir, bu transfeksiyon için ideal bir ortak akışkanlığa ertesi gün ya da iki kez transfections gerçekleştirme olanağını sağlamak için çok sayıda kuyu tohum tercih olabilir.
2. Ertesi sabah, bir kuyu ~ Transfeksiyonda% 70 konfluent (Şekil 1B bakınız) seçin. Hayır de bu safhasına ulaştığı takdirde, başka bir gün bekleyin.
   NOT:% 70 confluency HEK293 hücreleri için idealdir. Hücre ölümü ve toksisite daha seyrek sonuçları hücreleri transfecting. Zayıf ifade aşırı konfluent hücreler transfekte sonuçları.
3. Üreticinin protokolünde tarif edildiği gibi (transfeksiyon kiti) AT 60 ul tampon, L'yi kodlayan plasmidin 400 ng GPCR'ler ve / veya klatrin makine bileşenlerini ve bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine Arttırıcının 2.4 ul etiketlendi. 2 sn Vortex yeterli karışmasını sağlamak ve altındaki sıvıyı toplamak için 2 saniye boyunca 2.000 xg'de mikrofüjde dönmeye.
4. EkleÜreticinin protokolünde tarif edildiği gibi 6 ul Effectene. Bir mikrofüjde 2 saniye boyunca 2.000 xg'de 2 sn Vortex, ve spin altındaki sıvıyı toplamak için. Transfeksiyon kompleksi misellerin oluşumu için izin vermek için 20 dakika boyunca bekleyin.
5. Kuyudan medya aspire transfekte edilecek. Yavaşça miseller kırma etkisini azaltmak amacıyla, yavaş yavaş transfeksiyon tepkin madde karışımı,% 10 FBS bulunan DMEM, 0.8 ml ilave edilir ve pipetleme karıştırın ve. Taraftan çok yavaş kuyuya medya ve transfeksiyon karışımı ekleyin. Iyi bir mikropipet kullanarak mikrosantrifüj tüpüne kalan transfeksiyon karışımı ekleyin.
   Not: İsteğe bağlı olarak, hücreler nazik transfeksiyon ve alt geçici ekspresyonu ile sonuçlanan ilave besin vermek üzere transfekte de% 10 FBS'li DMEM'e ilave bir 0.5 ml ilave edilir.
6. 5 saat boyunca 37 ° C inkübatör hücreleri dönün.
7. Transfeksiyon karışımı ihtiva eden aspire ortam. % 10 FCS içeren DMEM 1 ml ile değiştirin. İzinHücreler gece boyunca büyümeye.
8. Ertesi gün, daha önce otoklav ile sterilize kaplanmamış lamelleri, hücreleri geçer.
   1. Her bir oyuğa, 1 mM EDTA ile fosfat tamponlu tuz (PBS) 0.5 ml ilave edilir. Seçenek olarak ise,% 0.05 tripsin-EDTA, 0.5 ml kullanılır. 1 dakika boyunca kuluçka makinesi içinde bırakın.
   2. 3 yuvarlak bir 6-yuvalı plakanın gözleri içerisine ayrı ayrı steril 25 mm kapak yerleştirin. Ortam, 2 ml Her bir oyuğa doldurun. Yavaşça lamel altındaki hücrelerin gelişimini önlemek için kuyunun dibine kadar lamel itin.
   3. El kuyunun dibinden hücrelerini kaldırmak için kuyu çalkalayın. % 10 FCS içeren DMEM içinde tekrar süspansiyon 1 mi ekleyin. 3 lamelleri arasında eşit bir 12-yuvalı plakanın 1 kuyusundan kaldırdı hücreleri dağıtın. Alternatif olarak, 3 cam dipli yemekleri hücreleri plaka.
9. Hücreler, görüntüleme önce en az 48 saat boyunca lamelleri büyümeye izin verin. Hücreler yayılmış ve düz olduğundan emin olun.

2.Görüntüleme ÇKP ve Kargo Dinamikleri kullanma TIRFM

1. Imalatçının protokolüne göre, Alexa Fluor protein etiketleme kiti kullanılarak Alexa boya ile Birleşmiş M1 anti-Flag antikorları yer alır. Seçenek olarak ise, ön-birleştirilmiş antikorlar temin edilebilir.
2. (Görüntü 37 ° C'de 10 dakika boyunca 50 mM HEPES, pH 7.4 ve% 10 FBS ile% 10 FBS ya da Opti-MEM ile önceden ısıtılır Leibovitz ortamı, 1 ml 1.000 seyreltme: 1 de antikorlar ile önceden inkübe hücrelerin orta), hücre yüzeyi üzerinde FLAG-etiketli GPCR'ler etiketlemek için. GFP gibi genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri, etiketleri olarak kullanılan if (ayrıntılar için bakınız tartışma) bu adımları atlayın.
3. Canlı hücre görüntüleme odasına lamel aktarın. Alternatif olarak, cam tabanlı tabaklar, aspirat antikor etiketleme ortam için önceden ısıtılmış görüntüleme ortamının 700 ul ilave edin.
   1. Bir çift forseps kullanın ve bir kanca içine 25 gauge iğne ucu bükün.
   2. Dominant elin forseps bir çift tutun. Oth bükülmüş iğne tutuner. Aşağı doğru cam kanca eğrileri kadar iğne çevirin. Bu lamel üzerine kanca kadar yavaşça 6-plaka alt kısmında, aşağı iğne, kanca yanını sürükleyin. Bu hücreleri ayırmak gibi, lamel yüzeyini çizmeyin özen gösterin. Yavaşça kuyunun dibinden lamel yukarı kaldırın. Destek için kuyunun duvara lamel dengeleyin.
   3. Lamel kenarına yakın tutun ve görüntüleme odasına lamel, hücre tarafı yukarı taşımak ve odasını monte forseps kullanın. Önceden ısıtılmış görüntüleme ortamının 700 ul (ya da uygun bir miktar) ilave edin. Çatlama veya kırılma önlemek için baskı yapmadan dikkatli lamelleri tutun.
4. Mikroskop üzerine bölmeyi aktarın ve bir sahne ısıtıcı veya çevrelenmiş bir kuluçka makinesi kullanılarak, 37 ° C'de hücre sıcaklığı tutmak.
5. Bir 100X veya 60X TIRF yağ daldırma hedefi (yukarıda 1.45 NA veya) kullanarak odak noktası haline hücreleri getirin. Geleneksel epifluoresan veya con görüntü hücreleraydınlatma (yani TIRFM) odak modları uygun yapılan ifade eden hücreleri belirlemek için. Hücreler yapma TIRF aydınlatma ince derinliği neredeyse görünmez out-of-odak zor odak düzlemi ve hücreleri bulmak için.
   NOT: Bazı sistemler kritik açı yukarıdaki lazerin geliş açısını taşıyarak, geleneksel epifluoresan görüntü için TIRFM için aynı lazer kullanır. Önemli bir güvenlik önlemi olarak, her zaman lazer ışınının açısının farkında olması ve her zaman gözlemciden uzak yönlendirmek.
6. Hücrede plazma zarının ana hatları kaybolur ve hücre merkez görünene kadar, bir ifade hücresinin alt yüzeyinden aşağı Odak. Bu, μ-opioid reseptörü (Şekil 2A) gibi bir plazma membran lokalize kargo protein ile belirgindir.
7. TIRF görüntüleme geçin.
   1. Geleneksel epifluoresan görüntüleme için aynı lazerler kullanıyorsanız, geliş açısını artırmakHücrenin iç out-of-odak floresan kadar lazer kaybolur ve hücre etrafında plazma zarı hiçbir anahat görülmektedir. (Şekil 2A ve 2B Şekil 2C karşılaştır)
      Not: TIRFM, odak düzlemi hareket odaklanma ve / veya sönük tamamen dışarı gitmek için görüntü neden olur ve genel floresan seviyeleri, aydınlatma, küçük derinlik nedeniyle azalır. Bu nedenle, bir alternatif yöntem TIRFM aydınlatma geçmek için, sonra plazma zarına odağını sonra floresan kaybederler kadar gelişlerini artırmak ve / geleneksel konfokal epifluoresan hücrenin merkezindeki ilk odak etmektir.
   2. Bir kez TIRFM yılında, uyarma lazer hedefi üzerinden geri yansıtır ve objektif üzerinde görünür olmadığından emin olun. Lazer nokta görünür ise kontrol ederek bu onaylayın.
      NOT: Geleneksel epifloresans veya konfokal modlarında, lazer aydınlatma, amacı üzerinde görülebilirtavana gibi.
   3. Net bir görüntü elde etmek için odak rafine. Endositik makine ana bileşenleri, örneğin klatrin gibi, puncta görünür olacaktır. Ince odağı ayarlayın, böylece punktumlarda mümkün olduğunca yuvarlak gibidir.
      NOT: filopodia farklı görünür kadar membran lokalize kargo için, ince odağı ayarlayın.
   4. Bu aynalar ve TIRF açısı gibi tüm görüntüleme parametrelerini kaydetmek için bir toplama programı kullanın. Gerekli tüm dalga boyları için yapın.
8. İstenen tüm endositik işaretlerini ifade eden hücreleri bulmak için lamel etrafında tarama: μ-opioid reseptörü ve Şekil 3A'da gösterilen örnekte adaptör β-arrestin. Ifade eden fakat aşırı ifade etmeyen hücreleri seçin. Ayrıntılar için tartışma bakın.
9. Hücreleri belirlendikten sonra, 10 dakika boyunca her görüntü 3 saniye kazanır. Bu koşullar altında görüntülenmiş HEK293 hücrelerinde bir CCP ortalama ömrü aroA olduğu için bu, bir CCP ömrünü yakalamak için yeterlidirund 40 sn ^10-11. Bu ÇKP'nin gözlemlemek için yaklaşık 12-14 kare verir. Örneğin Sinema 1 bkz. Görüntü ek hücreleri tüm adımları tekrarlayın.

Manuel Doğrulaması endositik Dynamics 3. Analizi

CCP ömürlerinin manuel doğrulama ölçüde tespit edilebilir CCP sayısı ile sınırlı olmasına rağmen, yine de görüntü ve saptama eserler küresel değişimler tarafından engellenmeksizin algılama doğru bir yolu kalır. Ayrıntılar için tartışma bakın.

1. ImageJ dosyasını açın. Görüntüler serpiştirmeli kanalları ile tiff dosyaları tek bir yığın olarak depolanır. Hyperstacks görüntüleri dönüştürün. Hyperstacks> hyperstack Stack> Görüntü git. (Görüntüleme β-arrestin ve μ-opioid reseptör, 2 girerseniz yani) edinilen kanal numarasını girin, (TIRFM bir tek düzlem olan) Z yığını için 1 girin ve filmin kare sayısı (yani 10 dk 1 çerçeve her 3 sn i de filmpop-up pencerede ler 200).
2. Hyperstack biçimi iki kaydırma çubukları ile bir pencere verir. Zaman içinde hareket etmek kanalları ve alttan taşımak için üst çubuğunu kullanın. Ömürleri tahlil edilecek proteinin kanalına gidin.
3. Tüm süreler görünmez önceden var CCP'lerin dahil azaltmak için 10 veya film 15 kare taşı. Rastgele seçilen bir nokta etrafında bir İB kutusunu çizin.
4. Bir nokta görünür kare sayısını.
   Not: endositik olayların ^10,11,16-19 üç morfolojik kategorilerinin örnekleri için Şekil 3B ve 3C.

Amaç Tanıma tarafından endositik Dynamics 4. Analizi

Amaç tanıma bir hücrede görüntülü CCP hemen hemen tüm ortaya çıkmasına imkan verir, ancak nedeniyle hatalı yapıların sahte tespiti için hata eğilimli olabilir. Avantaj ve e dezavantajlarını tartı Ayrıntılar için tartışma bakınACH yöntemi. Özel olarak oluşturulmuş bir algoritma dahil olmak üzere çeşitli programlar, objektif KDN'ler tespit etmek için kullanılabilmektedir. Bu protokol Imaris, bir görüntü analizi yazılımı (Malzeme) kullanılarak CCP objektif tanıma açıklar.

1. Başlamak için, görüntü analiz yazılımı ham görüntü dosyasını açın. Varsayılan olarak, birleştirilmiş bir renkli görüntü belirir. Bir kanalın parlaklığını ayarlamak için "Ekran Ayarı" penceresini kullanın. Görüntülenen rengini değiştirmek için bir kanal adını tıklayın. Onun görüntülenmesini önlemek için kanalın yanındaki kutunun işaretini kaldırın (Şekil 4A bakınız).
2. Turuncu noktalar ile ikonuna tıklayarak "Noktalar" oluşturun. Şekil 4B bakın. Hücrenin etrafında İlgi (ROI) bir bölge seçin. Bkz Şekil 4C. Yanlış parlak önde gelen kenarlarını ve plaketleri algılar alanları hariç tutmak için bir yatırım getirisi kullanın. Ayrı, farklı ekspresyon düzeyleri ile birden hücreleri analiz.
3. Yazarlara bir Spot çapını ölçünalgoritması için de ilk tahminler. "Dilim" moduna geçmek ve onun çapını ölçmek için bir nokta kutup uçlarında tıklayın. Şekil 4E bakın. Oluşumundan sonra ve kesiminie önce kendi istikrar yüksekliğinde bir ÇKP göstergesidir bakmak 4 veya 5 adet yuvarlak Lekeler için bunu yapın. Bir mikron yakın onda kadar ortalama bir çapı hesaplamak için bu ölçümlerin.
4. Noktalar algılar. "Aşan" moduna geri dönün. Tespiti için uygun kanalı seçin. Genellikle 0.3 veya 0.4 mikron ortalama ölçülmüş çapını girin. Leke ölçmek için mavi ileri oka tıklayın. Şekil 4E bakın. Spot çapı göz ardı edilirse, floresan sahte noktaları Lekeler olarak tespit edilecektir. Çapı çok büyükse, gerçek Noktalar göz ardı edilecektir. Ne zaman emin, biraz daha düşük tahmin ve daha sonra yanlış algılamaların filtre.
5. Kalite tarafından Noktalar Filtre. Geri olmadan mümkün olduğunca çok sayıda noktalar yakalamak için filtreyi ayarlayınzemin. Kalite filtre varsayılan ²⁰ olarak seçilir. Şekil 4F bakın.
   1. Uygun bir eşik ayarlamak için bir kılavuz olarak "Kalite" eğrisini kullanın. Eğrisinin bu ilk dalış için sol fare tuşu ile filtrenin alt eşiğini taşıyın. Bu pozisyon genellikle sadece görünür Spotlar algılama inceltir gibi bu filtre için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Şekil 4F bakın.
   2. Algılanan Noktalar küre veya merkez piksel gibi film görünür. "Renkler" sekmesini kullanarak, kolay bunları görmek yapmak için bir zıt renk lekelerin rengini ayarlayın. Her karede Noktalar yorumlayan Filmde ilerlemek. Amaç kendi yaşamların bütünlüğü için mümkün olduğunca çok Noktalar tespit etmektir.
   3. Sönük Spotlar ortadan kaldırın veya elle onların yaşamların kurs boyunca iyi tespit değil gibi, daha sonra sürekli parça içine bağlamak.
   4. Bir "Yoğunluk" fil ile parlak plaklar kaldırter, gerekirse. Yeni bir filtre eklemek için yeşil artı işaretine tıklayın. Şekil 4F bakın. Veya belirli bir floresan sinyalleri Noktaları filtrelemek için Yoğunluk filtre oluşturun. Eşiğini ayarlamak için (4,5 tartışılan Kalite Curve benzer) oluşturulan Yoğunluk eğrisi kullanın. Parlak Spotlar temsil eğrinin aşırı sol ucunu kaldırmak için sol fare düğmesini kullanın.
      NOT: Büyük plak yapıları hücrede parlak unsurları arasında genellikle, onlar kolayca bu filtre ile dışlanır.
   5. CCPs Spots olarak algılanır ve parlak plaklar artık tespit sağlamak için film boyunca ilerleyin. Şekil 3D CCP'lerin algılama (beyaz küre ile gösterilen) bir hücreyi kaliteli filtre ile optimize edilmiş ve plaklar kalitesi ile dışlandı gösterir filtre.
   6. Kaliteli filtre ile parlak hücre kenarları azaltın. Parlak nesneler hala bir sonraki adımda, elle kaldırılması gerekebilir. Mavi ile devamok.
   7. Düzenleme Spotlar ekranda anormal Noktalar çıkarın. Modunu "Seç" geçin. Yerinde tıklayın. Bu sarıya dönecektir. "Sil" tıklayın. Algoritması oluşturmaya devam etmek için mavi oka tıklayın. Şekil 4G bakın.
6. Tedbir izler. "Brown hareketi." ÇKP herhangi yönettiği hareketi, plazma zarından sadece minimal sürükleyen sergilemek olmamalı şarkıları ayarlayın. Bu algoritma bu hareket için en uygun. Şekil 4H bakın.
   1. 0.7 mikron gibi küçük bir değere Max Uzaklık ayarlayın. Şekil 4H bakın.
      NOT: Küçük bir mesafe ayarlama bitişik Spot bağlantısını en aza indirir ve hala ÇKP veya hücre hareketi ile bir hücre nokta sürekli izleme sağlar.
   2. Bu arda eksik olan tek kare varsa devam etmek için bir parça verir 1. Max Gap Boyut ayarlayın. Parçaları hesaplamak için mavi oka tıklayın. Şekil 4H bakın.
      NOT: Gen fazla 3 nedenleri farklı pistlerde ap boyutları yanlış birbirine bağlantılı olması.
   3. Inceleyen Anahtarı parça "Dragon Tail." Ilerleyin algılama kalitesini gözlemleyerek film boyunca. Bitişik noktalar bağlanmıştır ise, 0,7 um altında En mesafe azalır. Noktalar çok kolaylıkla kırılmış yapılıyorsa, Max Gap Boyutu artırmak. Parçaları oluşturmak için mavi oka tıklayın. Bu filtre parçaları ekranına götürür. Şekil 4H bakın.
7. Filtre Parçalar ve İhracat Verileri. Ek parlak plaklar kaldırmak için "Şiddeti" filtre kullanın. TIRF alanına girmek endozomları kaldırmak için bir "Deplasman" filtre kullanın. Uzun Noktalar hem de daha uzun deplasmanları olacak gibi, dikkatli olun. Protokolü tamamlamak için yeşil çift oku tıklatın. Şekil 4I bakın.
   1. Filtrelerle olamazdı Tracks yanlış pozitif algılamalarını kaldırmak için, kalem simgesiyle, Düzen Parçalar sekmesini kullanın. Durdurulan kontrol edininuities veya yanlış bağlantıları. Iki parça bağlamak için, sonra da Düzen Parçalar kutusuna "Bağlan" üzerine tıklayın, Ctrl-Sol-Click kullanarak onları seçin. Ayrı noktalar halinde parçalarını kesmek için, bir parça seçin ve "Bağlantıyı kes" çarptı. Ile birden Spotlar seçin Ctrl + Sol-tıklayın ve yeni bir Parça oluşturmak için "Bağlan" butonuna tıklayınız. Yöntem 4.5.7 anlatılan Düzenleme noktaları için aynıdır. Şekil 4J bakın.
   2. Veri aktarmak için, istatistik sekmesine gidin. Seçilen istatistik ihracat tek disket ikonuna tıklayın. Tüm istatistikleri ihracat disket bir dizi gibi görünüyor simgesine tıklayın. "Parça Süre" istatistiği endositik parça uzunluğunu içerir. Şekil 4K bakın.

Kullanarak canlı hücre TIRF Mikroskopi biz μ-opioid reseptörün (MOR) endositik dinamikleri kaydettik, G-protein kenetli reseptör (GPCR) ve endositik adaptör protein β-arrestin. Β-arrestin yapı geçici olarak Şekil 1 'de belirtilen protokol kullanılarak, sabit bir şekilde ifade eden MOR hücre hattına transfekte edilmiştir ve 96 saat sonra görüntülenmiştir. Stabil hücre boyunda m ya da N-terminal bir pH-duyarlı GFP ile etiketlenir. Bu floresan protein yalnızca nötr dışı sıvıda fluoresces. Ayrıca, sadece bir kez MOR bir agonist tarafından aktive endocytoses, aksi takdirde düzgün plazma zarından şekilde dağıtılmış olarak kalır. Loş bir floresan ile dolu bir hücrede konfokal modunda sonuçlarında kapak camına oturan yapışık plazma zarı üzerinde duruluyor. Bu, plazma membranı, hücredeki etrafında floresan bir halka olarak görülen hücrenin merkezine odaklanan farklıdır. Sol karşılaştırınŞekil 2A'da ve sağ paneller. Yanlış bir açı ile ya da geleneksel epifluoresan TIRF geçiş Şekil 2B'de gösterildiği gibi, aynı hücrelerde anlaşılacaktır odak floresans üzerinden olur. TIRF açısı doğru olduğunda plazma zarı çok berrak ve parlak ve odak floresan dışarı artık görüntüyü bozar. Şekil 2A ve 2B Şekil 2C Karşılaştırması.

MOR ölçüde TIRF alanındadır yapışık plazma zarı üzerinde, çünkü görüntü net ve keskin. Bunun aksine, β-arrestin yapılmamış endositik puncta için alınmamaları zaman sitosolik havuzunda kalır ve TIRF alanında değildir çünkü bulanık ve odak dışındadır görüntülenir. MOR bir agonist tarafından aktive edildiğinde, β-arrestin plazma membranına kabul ve her iki β-arrestin ve reseptör CCP (Şekil 3A ve Film 1'e dağıtmak olduğu Kırmızı, bindirme yeşil, MOR içinde β-arrestin) sarıdır.

Şekil 3B gösterildiği gibi, bu kümelerin ömürleri tamamlanan endositoz için üç parametre kullanılarak elle belirlenebilir. KDN'ler belirten noktalar (aynı zamanda Şekil 3C bakınız), açık ve kapalı "blink" ya da daha büyük bir yapı "çimdik" tamamen yok olabilir ya. İkincisi iki koşul mekansal çok birbirine yakın ayrı olaylar olarak çözülecek olayları temsil eder. Şekil 4'te de belirtildiği gibi, IMARIS Noktası algılama algoritması, KDN'ler ölçmek için de yararlıdır. Şekil 3D KDN dinamik olmayan plak yapılarının uzaklaştırmak için süzüldükten sonra, IMARIS kullanılarak tespit gösterir. Üst üste beyaz küreler tespit noktaları göstermektedir. Onların tüm yaşamlar için tespit edilemedi sönük noktalar da "Kalite" filtre ile alınmadı.

Şekil 2: TIRFM alanını bulma. (A) confocal görüntülü plazma zarı. Sol panel hücrenin merkezine odaklanarak confocal hücreleri göstermektedir. Plazma membranı, hücredeki çevresinde bir "halka" olarak görülmektedir. Bazal plazma zarı aşağı odaklanarak, lamel bitişik hücre loş bir floresan ile doldurulur neden olur. Plazma zarı "halka" ince TIRF alanında görünür olmamalıdır. (B) numune boyunca geleneksel epifloresans aydınlatma üreten bir sığ TIRF açısı ile bazal plazma zarı. Bu, mevcut hücrenin üstünden tüm hücre ve odak floresans üzerinden daha aydınlatır. (C) TIRF plazma membranını. Filopodia odaklanarak bu uçağı bulmak için yardımcı olur. O olduğunu farkpürüzsüz bir tek düzlem. Ölçek çubukları 10 mikron. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: görselleştirme ve TIRF endositik olayları nicel. (A) önce ve endositoz teşvik eden bir agonisti eklendikten sonra μ-opioid reseptörün (MOR) ve β-arrestin eksprese eden bir hücre. Agonist endositik puncta her iki proteinin yeniden dağıtımına neden olur. Ölçek çubuğu 10 mikron. (B) arrestin dinamikleri, daha önce açıklanan morfolojileri ile tutarlı görselleştirerek tarafından görülen endositik olaylar, üç tip. "Sabit", hızla kaybolur bir sabit bir sinyal. Bu ÇKP aşılı ve TIRF alanını terk ettiğini belirten, ana türüdür. , Yanıp bir sinyal "Blink" düşük bir sinyal nedeniyle aynı noktada ikinci bir ÇKP düzeneğine aynı noktada görüntülenir. İki CCPs birbirine çok yakın farklı noktalar olarak çözülmesi gereken zaman, bir boru şeklinde projeksiyon bir nokta kapalı geliyor, "kapalı" Çimdikle ve bir endocytosed edilir. Kutusu, 2 x 2 mm. (C) tek olay çözünürlükte MOR klatrin aracılı endositoz görselleştirme. MOR endositik olayların büyük bir bölümünü temsil iki örnek gösterilir. Çerçeveler her 3 sn vardır. Kutusu. 2 x 2 mikron Imaris kullanarak bireysel endositik olayların (D) Algılama. Beyaz küreler Spots olarak algılanabilir KDN'ler göstermektedir. Nokta tespiti "Kalite" filtre kullanılarak optimize edildi. Onların yaşamların bütünlüğü için tespit edilemedi sönük noktalar da kaliteli filtre ile alınmadı. Farkedilmez olarak gösterilmektedir büyük plak yapıları bir "Şiddeti" filtresi kullanılarak ihmal edildi.ig3large.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: Imaris kullanarak endositik Olaylar Dynamics Amaç Tanıma. (A) Adım 4.1 açıklandığı gibi görüntü ekranı ayarlamak için kullanılan Ekran Ayarı penceresi. (B) "Spotlar" algoritması oluşturucu Açılış. Oluşturucu aşağıda penceresinde görüntülenir. (C) Noktalar algoritması üreticisinin ilk adım. Gerekirse "(Zaman) üzerinden takip Spots." Giriş ", İlgi Segment sadece bir bölge" kontrol edin. (D) ROI seçimi ekranı. Ayrıntılar için Adım 4.2 bakınız. (E) bir ölçülen Spot çapı tanımlamak için gerekli çoklu pencere. Paneller temsil: Navi kullanarak Dilim moduna Aşan geçişölçülen çap, tipik haliyle ölçülmüş çapı girmek için en sağ tarafta, üzerine, gösterilen bir noktaya, polar uçları üzerine doğrudan üstünde gasyon bar. Bkz Adımlar 4.3-4.4. (F) 4.5-4.5.3 açıklanan nokta Kalite Filtre. 4.5.7 açıklanan (G) Düzenle noktalar penceresi. (H) Tedbir parça ve görüntüleme parça camlar, 4.6 tarif. (I) Filtre Parçalar pencere 4.7 tarif. (J) Edit 4.7.1 tarif pencere izler. 4.7.2 açıklanan (K) Kaydet data ekranı. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Film 1 .

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.