Kütle spektrometresi ile In-jel Geliştirilmiş İndirgemeli β-Eleme Kapsamlı O-bağlı ve için Sulfo-Glikomik

Özet

O-bağlı glikanların çeşitliliğini kapsamlı bir şekilde araştırmak için, permetilasyon ve hızlı bir faz bölme yöntemi ile birlikte jel içi indirgeyici β-eliminasyon için yeni bir prosedür, SDS-PAGE tarafından çözülen glikoproteinlerden doğrudan salınan O-bağlı glikanların analizine uygulanır ve kütle spektrometresi ile müteakip glikomik analize uygundur.

Özet

Proteinlerin SDS-PAGE ile ayrılması ve ardından çözülmüş protein bantlarının jel içi proteolitik sindirimi, biyolojik örneklerin yüksek çözünürlüklü proteomik analizini üretmiştir. SDS-PAGE tarafından çözülen glikoproteinler tarafından taşınan glikanların derinlemesine analizine izin verecek benzer yaklaşımlar, tespit yöntemi olarak kütle spektrometresi (MS) kullanılırken geri kazanımı ve hassasiyeti en üst düzeye çıkarmak için özel hususlar gerektirir. Yüksek kaliteli veriler elde etmede üstesinden gelinmesi gereken önemli bir engel, MS analizine müdahale eden jel türevi kirleticilerin uzaklaştırılmasıdır. Burada sunulan numune iş akışı sağlam, verimlidir ve MS'den önce hat içi HPLC temizleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Hedef proteinleri içeren jel parçaları, polimerik akrilamid parçaları da dahil olmak üzere kirleticileri uzaklaştırmak için asetonitril, su ve etil asetat içinde yıkanır. O-bağlı glikanlar, jel içi indirgeyici β-eliminasyon yoluyla hedef proteinlerden salınır ve sağlam, basit temizleme prosedürleri ile geri kazanılır. Bu iş akışının bir avantajı, sülfatlanmış glikanları tespit etme ve karakterize etme hassasiyetini artırmasıdır. Bu prosedürler, MS analizinden önce hızlı bir faz bölümü ile sülfatlanmamış (sialillenmiş ve nötr) permetillenmiş glikanlardan sülfatlanmış permetillenmiş glikanların verimli bir şekilde ayrılmasını sağlar ve böylece SDS-PAGE tarafından çözülen glikoproteinlerin glikomik ve sülfiglikomik analizlerini geliştirir.

Giriş

Glikosilasyon organizma fizyoloji, doku patolojisi ve hücre tanıma ^1-3 katkıda bir esas teşkil eden protein translasyon sonrası değişiklik. Analitik Glycoscience büyük ilerlemelere rağmen, belirli bir protein glıkanların tam çeşitliliği tanımlamak özellikle temel biyolojik kaynaklardan izole edilmiş protein ile ilgili olarak, son derece zorlu bir iştir. Bununla birlikte, glikoprotein glıkanların mikroheterojenlik sıklıkla diğer proteinler ile fonksiyonel etkileşimlerin etkiler. Bu nedenle, glıkan çeşitlilik karakterizasyonu hücre ve doku glikosilasyon ^{4,5 'fizyolojik} önemini anlamak için gereklidir. Doku fizyoloji ve patofizyoloji, sağlam, hassas ve kapsamlı glycomic analitik teknikleri glikoprotein glycosylation'nin katkılarını anlamak için giderek daha önemli hale gelmiştir. Proteomik analizde, protein, teşhisi genellikle LC-MS ile elde edilir/ Triptik peptitler ⁶ MS analizi. Protein sindirimi gibi ^7-9, tripsin gibi proteazlar ile jel yumuşatıldıktan sonra, SDS-PAGE ile yeniden çözülmüş saflaştırılmış bir protein ya da proteinleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. SDS-PAGE ile protein karışımı Önzenginleştirme proteini numarası derinliğini ve doğruluğunu arttırır. Glikoprotein Glikosillenmenin glycomic analizi için benzer stratejilerin geliştirilmesi Glycoscience ön planda yer alır.

Glıkanların iki ana sınıfı, N-bağ ya da O-bağlantısı yoluyla ya proteini omurgalarına bağlanır. N-bağlantılı glikanları asparagin bağlıdırlar (Asn), Asn-X-Ser / Thr / Cys olarak tanımlanan bir sequon kapsamında bulunan tortular (X, prolin dışında herhangi bir amino asittir) ve peptit N ile enzimatik sindirme ile serbest bırakılabilir -glycanase (PNGaseF veya A), ya da çözelti içinde,-jel ya da açık-blot ^10-12. O-bağlantılı glıkanlar, esas olarak serin (Ser) veya treonin (Thr) kalıntılarına eklenir. Ancak, sadece bir enzim iden edilmiştirglikoproteinin, O-bağlantılı glikanları salabilen ve sadece basit O-bağlantılı glikanlar salan, son derece sınırlı bir glıkan özgüllüğe sahiptir giderilene. Chemical Release stratejileri glikoproteinlerden O-bağlantılı glıkanların kapsamlı serbest bırakılması için tercih edilen bir yöntem olmaya devam etmektedir. Indirgeyici ya da indirgeyici olmayan β-kaldırılması veya hidrazinolize İyi karakterize edilmiş kimyasal tahliye etme teknikleri ve glikoproteinlerin ^13,14, O-bağlantılı glikanları salınması için en yaygın olarak kullanılan tedavi alanında bulunmaktadır. İndirgeyici β-eliminasyon, SDS-PAGE ile ayrılmış glikoproteinlerden O-bağlantılı glikanlar serbest bırakmak için kullanılmış olmasına rağmen, daha önceki yaklaşımlar sonraki analiz ^15-17 HPLC ayırma gereklidir.

Çok Boyutlu MS (MS ⁿ⁾ analizi şu anda en çok biyolojik kaynaklardan beklenen miktarlarda izole glikoproteinlerden serbest glikanları karakterize yapısal verilerin zengin kaynağı sağlar. MS derinliğimerkezli bir yapısal karakterizasyon büyük ölçüde önce analizleri için salınan glikanlar permethylating ile kolaylaştırılır. Permethylation iyonizasyon artırır ve glıkan yapıları ^18,19 geniş bir aralığı boyunca mol sinyal tepkilerinin eşitlemeye çalışır. Buna ek olarak, permethylation açıkça böylece yapısal açıklanmasını ^20-23 arttırıcı özgü kitleler terminal ve yer değiştirmiş monosakkarit kısımları, etiketler. Örneğin, asidik glıkanlar MS non-permetilatlı türler olarak tespit etmek için, genellikle zordur. Asidik glıkanlar MS ile de negatif iyon modunda tespit edilebilir, ancak, aynı iyon modunda hem asidik hem de nötr glikanların, tespit etmek mümkün değildir. Glıkan permethylation önemli bir avantajı, permetilatlı bir glıkan en monosakarit ikame üzerindeki serbest hidroksil gruplarının (OH) her bunları tespit yapmak, bir metil grubu _(OCH3 ya da OMe), bu şekilde sialilatlı bir glıkan ücretlerini nötrleştirilir başlıklı hale olmasıdır nötr (asyalo) glıkanlar. Bununla birlikte, sulfoglycans sülfatlanmıştır kısımların hidroksil iyonizasyonunu ve hassasiyetini azaltır anyonik şarj, retansiyonu ile sonuçlanır permethylation dayanıklıdır. Bu bastırma anda sülfatlı glikanların ^24-26 yüksek bir bereket taşımak gibi müsinlerin gibi çok karmaşık glikoproteinler, kapsamlı glycomic analizini önler.

Arındırıcı sülfatlı Glikanların dair son raporlar ters-faz saflaştırmak için kromatografi ve MALDI analizden önce ayrı permetilatlı glikanlar, ücret kullanılmıştır. Bu yöntem, organik faz bölümleme daha az kesin olarak bulduk, elüsyon için farklı mobil fazlar kullanılarak sülfatlı ve sülfatlı olmayan glıkanların tamamen ayrılmasına dayanır. Bu nedenle, sulfoglycans saptanması ve zenginleştirilmesi için uygun olan yeni bir teknik burada sunulmuştur. Bu teknikler, su ardından sulu faz içinde sülfatlanmış glıkanların kantitatif iyileşme sağlar: DCM (diklorometan)rutin glıkan permethylation reaksiyonlar ²⁷ sonunda gerçekleştirilir ekstraksiyon. Ayrıca, MS ² parçalanma desen basitleştirirken Önemli olarak, permetilatlı sülfatlanmamış glıkanların karışımından permetilatlı sulfoglycans bu sağlam ayrılması eş zamanlı olarak yüklü türler için zenginleştirir. Geliştirilmiş-jel O-bağlantılı glıkan analizi için kapsamlı bir protokol de sunulmuştur. Geliştirilmiş protokol, glıkan iyileşmeye katkıda MS ile elde edilebilen ^N permetilatlı glikanların analiz yapısal bilgi arttırır, ve biyolojik kaynaklardan izole edilmiş temel glikoproteinlerine uygulanan sulfoglycomic analiz duyarlılığını arttırır.

Bu protokol, tüm glikoprotein özleri O-bağlantılı glıkan analizi ya da SDS-PAGE ile çözülmüş, ilgilenilen belirli bir glikoproteini amaçlanmıştır üç deney prosedürleri oluşmaktadır; A) jel temizlik, B) jel indirgeyici β-eliminasyon, ve C) glukanıdır permethylation. Amaç, biyolojik açıdan ilgi (Şekil 1), başlıca kaynaklarından hasat glikoproteinler için kapsamlı bir O-bağlantılı glycomic verileri elde etmektir. SDS-PAGE ile ayrılmış Glikoproteinler boyama ve ilgili bantlar kesilir ve elde edilen jel bant küçük parçalar halinde dilimlenir tarafından görüntülenmiştir. Jel parçaları boyası ve jel kirletici maddelerin (Şekil 2A) ortadan kaldırılması için etil asetat yıkamaya tabi tutulur. Glikan serbest-jel indirgeyici β-eliminasyon (Şekil 2B) ile elde edilir ve salınan glikanlar permetilatlı edilir. Sulu organik ekstraksiyon takip permethylation kantitatif uzaklıkta, sülfatlı olmayan nötr glikanların (Şekil 2C) için anyonik sülfatlanmış glikanları böler. -Jel sulu-organik ekstre bağlanmış indirgeyici β-eliminasyon, SDS-PAGE ile ayrılmış glikoproteinin küçük miktarlarda serbest O-bağlantılı glıkanların ve sulfoglycans karakterizasyonu sağlar. Stratejik bakış hülâsa ​​olduğunuŞekil 1 ve ayrıntılarda kanşımının, Şekil 2'de gösterilmiştir. Buna ek olarak, boyası ile yıkandı, jel parçalarının bir kısmı, standart bir LC-MS / MS teknikleri proteomik protein numarası için kullanılabilir.

Protokol

NOT: Lab Güvenlik Endişeleri

Standart laboratuvar iyi uygulamalar doğrultusunda, aşağıdaki gözlemlemek. Uygun yerlerde bütün organik çözücüler saklayın. Kimyasal bileşimleri açık etiketleme ile kimyasal atık kaplarda tüm atık malzemelerini saklayın. Bu protokollerde kullanılan çeşitli reaktifler gibi potansiyel kanserojen veya, uçucu yanıcı gazlar oluşturur havalandırma ile bir davlumbaz tüm reaktifler anlaştım. Organik çözücüler ile çalışırken eldiven, laboratuvar önlüğü, ve göz koruması gibi kişisel koruyucu ekipman kullanın.

-Jel O-Glikomik 1. Prosedürü Şekil. Çevrede bulunan (A), proteinler, uygun boyama prosedürleri (Coomassie ya da gümüş) tarafından tespit edilen, SDS-PAGE ile çözülmüş ve çıkarılır. Kesilen jel adet dilimlenmişküçük küpler halinde, boyası, ve daha sonra MS analizi müdahale kirletici maddeleri azaltmak için etil asetat ile yıkanmıştır. Jel diliminin bir kısmı LC-MS / MS ile-jel triptik sindirime ve ardından proteomik karakterizasyon için rezerve edilebilir. (B) O-bağlantılı glıkanlar-jel indirgeyici β-eliminasyonu ile çözüldü glikoproteinlerin salınır. Başlıca adımlar tuz giderme ve metanol ile azeotrop borat gidermeyi içerir. Permetilatlı ve daha sonra, sulu ve organik faz halinde bölünmüştür (C) indirgeyici β-gidermede glikanları O-bağlıdır. Sulfoglycans kantitatif olarak, üst (sulu) faz içinde geri kazanıldığı alt (DCM), bir tabaka halinde nötr ve siyalilleştirilmiş glıkanlar bölümü ise.

-Jel Glikomik için Şekil 2. Detay akış şeması. Her experimenŞekil 1 'de gösterilen Tal adımı ayrı ayrı gösterilmektedir. (A) jel destaining ve EtOAc çıkarma, (B) jel indirgeyici O bağlantılı glıkan serbest bırakılması için β-eliminasyon, ve doğrudan (C) permethylation ve faz bölüm. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

1. Jel Eksizyon ve Jel-türetilmiş Kontaminantların Kaldırma

1. Işlemine başlamadan önce, Malzeme Listesi'nde yer kimyasallar ve reaktifler hazırlamak.
2. Standart Tris-Glisin tampon sistemleri kullanarak, SDS-PAGE jeli üzerinde protein giderin. Leke CBB veya Gümüş Boyası ile ya proteinleri çözüldü. Genel olarak, gümüş lekeli jeller, O-bağlantılı glıkanların geri Coomassie ulaşılan kurtarma yaklaşık% 80-90 jelleri lekelendi.
3. Elektroforezisten sonra, bir cam levha ve tüketim t jel yerleştirintemiz bir neşter veya ustura kullanılarak ilgi o bölge.
4. O-glıkanların verimini artırmak bir cam levha üzerine, ilgi konusu jel bant transferi ve yaklaşık olarak 2 mm küpler halinde kesilerek çıkarılmış jel parçasını kesmek için. Glıkan iyileşme azalır çünkü Jel parçacıkları 1 mm'den küçük küpler kaçının. Paslanmaz çelik microspatula ile Üstü yivli bir cam tüp (13 x 100 mm) içine küçük jel parçaları aktarın.
5. Örnek tüpü 25 mM amonyum bikarbonat (AMBIC, ₃ NH ₄ HCO) 1 ml, Teflon kaplı vidalı üst kapağı ile cam tüp kap ekleyin ve yavaşça 10 dakika bekledikten önce tüp hafifçe karıştırın. Jel parçaları müthiş önlemek için güçlü bir ajitasyon istihdam etmeyin.
6. Dikkatle Pasteur cam pipet veya ekstra-uzun plastik ucu ile donatılmış bir pipet kullanarak cam tüp AMBIC çıkarın. Çökertilmesi ve AMBIC çözüm çıkarırken küçük jel parçaları transfer kaçının.
7. Asetonitril (ACN) 1 ml ekleyincam tüp, kap, ve yavaşça 10 dakika standı icar önce tüp hafifçe karıştırın. Jel parçaları tamamen solvent ile kaplıdır emin olun. Gerekirse, tüp duvar kapalı ve pipet ile çözücü içine jel parçaları itin.
8. Cam tüpten ACN Pipet ve parlak mavi renk kaybolana kadar tekrarlayın 1,5-1,7 adımları. Gerekirse, beş ardışık AMBIC / ACN yıkama az tekrarlayın. Gümüş lekeli jeller için, bir destain kiti kullanın. Jel parça ACN muntazam beyaz süre döndüğünde bir sonraki adıma geçin.
9. , Cam tüp herhangi bir sıvıyı pipetle tüp Özetlemek, AMBIC 1 ml ekleyin ve 5 dakika bekletin.
10. AMBIC çıkarın ve cam boru, etil asetat (EtOAc), 2 ml ilave ediniz. Alternatif ucu-üzerinde-uç çalkalama ya da gece boyunca 4 ° C'de Teflon kaplı bir kapakla ve yer ile Özeti tüpü 30 dakika her biri için, oda sıcaklığında üç kez EtOAc ile yıkanarak gerçekleştirin. Daha EtOAc yıkaması, kirleticilerin daha etkili kaldırılması.
11. KaldırSon EtOAc yıkama ve _H2O, 2 ml ile üç yıkama her birini yerine EtOAc'nin komple kaldırma sağlam indirgeyici β-eliminasyon reaksiyonu sağlayacaktır.
12. _H2O Pipet ve ACN'den 1 ml ile bir kez yıkanarak jel dihidrat.
    Not: Kurutma işleminden sonra, susuz jeller-jel β-ortadan kaldırılması için hazırdır. Susuz Jel parçaları, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
13. Bağımsız olarak jele tatbik edildiği geçici bellek ya da çözelti, herhangi bir aşamada yıkama işlemini durdurmak ve gece boyunca 4 ° C'de jel parçaları saklamak (AMBIC, ACN, _H2O). Önümüzdeki 2 gün içinde her zaman örnek hazırlama yeniden başlatın.
14. Standart proteomik yaklaşımlar ile protein kimliği destained ve susuz jel parçaları bir kısmını kullanın.

Indirgeyici β-Eliminasyon 2. In-jel O-glukanıdır Yayın

1. Kullanılana kadar 4 ° C'de% 50 NaOH veya katı NaOH ve mağaza ile 1 M sodyum hidroksit (NaOH) içindeki bir stok çözelti hazırlayın.
   % 50 NaOH (ya da katı NaOH 4 g) ihtiva eden 5.2 ml alın ve 1 M NaOH solüsyonu yapmak üzere, 100 ml hacim ayarlayın. İndirgeyici β-eliminasyon reaksiyonları etkinlik kaybı olmaksızın 6 aya kadar 4 ° C'de saklanabilir 100 mM NaOH, ile, 1 M NaOH stok çözeltisi ile seyreltilir.

100 mM NaOH içinde 2 M sodyum borohidrid _(NaBH4) konur. 100 mM NaOH, 0.5 ml, _NaBH4 38 mg eritin. Genel olarak, her bir örnek için borohidrür çözeltisi 0.5-1.0 ml kullanmak. Aşama 1 'de hazırlanan kurutuldu jel parçalarının miktarına reaksiyon çözeltisinin hacmi 1-2 kesilmiş jel parçalarının (adım 1.3) için borohidrür çözeltisi 0.5 mi kullanmak için beklemek değişir.

Hidratı giderilmiş jel parçaları, 100 mM NaOH, 500 ul ilave edin ve glıkan geri kazanımını artırmak bazik koşullar için jel dengeye getirilmesi amacıyla, buz üzerinde 3-5 dakika boyunca bekletin.

1 M NaBH nihai konsantrasyonlarda elde edilen, 100 mM NaOH içinde 2 M, _NaBH4 500 ul ekle

İnkübasyonun ilk saat esnasında, hafifçe tüpün her 15 dakikada karıştırılır. Bu jel parçaları parçalanabilir, çünkü güçlü ajitasyon kaçının. Iyi dengelenmiş bir inkübatör / fırın ya da bir ısıtma bloğu içinde, reaksiyonun gerçekleştirilmesi. Jel parçacıkları, reaksiyon çözeltisi ile kaplanmıştır emin olun.

Kuluçka veya ısıtma bloğundan numune tüpü kaldırma ve buz üzerine yerleştirerek reaksiyonu durdurun.
Not: β-eliminasyon reaksiyonu 18 saat ilerlemesine izin verdikten sonra, tuz giderme işlemi, aynı gün içinde gerçekleştirilmelidir.

Katyon değişimli kromatografi ile 3. Tuzdan arındırma

1. Buz üzerinde numune tüpü muhafaza aşırı ısı oluşumunu önlemek için de, yavaş yavaş baz nötralize etmek için% 10 asetik asit (AcOH) damla damla ilave edildi. Yavaşça AcOH'nin eklemeler arasında numune tüpü vorteks. Yavaş yavaş asit eklemek için dikkatli olun ve Additi gibi damla damlaasit kabarcıkların bir "volkan" üretecek. Gerekirse, kabarcıklar ortadan kaldırmak ve sonra akışının önlenmesi için tüp santrifüjleyin.
   1. Reaksiyon karışımı içinde sodyum büyük miktarda ortadan kaldırmak için, küçük bir katyon-değiştirme sütunundan (Dowex veya Ag-50W-X8 reçine H ⁺ biçimi) içinden, reaksiyon karışımına geçmesi.
   2. 1 M NaOH ile katyon değiştirme reçinesi yıkayın 1 M HCI reçine, analitik sınıftadır olsa bile, MS analizi müdahale işleme kirleticileri çıkarmak amacıyla kullanılmadan önce.
   3. 1 M NaOH içinde reçine daldırın ve kaptan kaba aktarma ile uzaklaştırın. Daha sonra 1 M HCI ekleme, su çıkarmak, de-iyonize edilmiş su ilave edilir.
2. Reçine Yukarıdaki çözelti renksiz olana kadar bu adımları tekrarlayın. 4 ° C'de% 5 AcOH deiyonize su ve mağaza ile temizlenmiş reçine yıkayın.
3. Küçük bir cam kolon, çizik ve pipet konik yaklaşık 1 cm uzunluğunda böylece seramik kesici kullanılarak Pasteur cam pipet ucu kırmak için. Cam yünü, bir fiş ayrı kadar dalga ve reçine, yatak için bir destek oluşturan ucuna doğru itin. Bir cam test tüpü üzerinde bir kelepçe veya clothespin ve yer ile pipet sütun sabitleyin.
4. 1 ml metanol (MeOH) ve 3 ml% 5 AcOH ile boş pipet yıkayın. Girdap H ^+, Dowex ya AG50 katyon değiştirme reçine cıvık çamuru% 5 AcOH içinde depolanır ve bir Pasteur pipeti sütununda bir 1 ml yatak hacmi elde etmek için bulamacın yeterli aktarın.
5. % 5 AcOH beş hacim kullanılarak sütun durulayın. Reçine parçacıkları bir görünüm için içinden akar ve reçine algılanırsa, sütun kullanmayın edin.
6. Yeni bir vidalı kapaklı cam borunun (16 x 125 mm) ve yük numune üzerinde sütun. Yoluyla akışı toplamak ve aynı tüp içine,% 5 AcOH en az 3 hacim glikanları elüte.
7. Parafilm ile tüp örtün ve bir iğne ile küçük bir delik açmak. -80 ° C'de ya da kuru buz üzerinde numune tüpü yerleştirin. Dondurulmuş sonra liyofilizasyon ile örnek kurutun. -20 ° 'de kurutuldu, malzemenin saklayınKullanılana kadar ° C.

4. Borat Kaldırma

1. MeOH içinde% 10 AcOH hazırlayın. Buzlu asetik asit, 10 ml alın ve metanol ile, 100 ml hacim ayarlayın. 6 aya kadar Teflon-kaplı bir kapakla bir cam şişe içerisinde, bu reaktif saklayın.
2. Kurutulmuş, liyofilize örnek tüpü ve girdaba MeOH içinde% 10 AcOH 300 ul ekle. Bir _N2 akımı altında buharlaştırma ile elde edilen trimetil borat çıkarın.
   Not: asidik koşullar altında, metanol ile borat tuzları karıştırma, uçucu bir bileşik olup, trimetil borat üretir.
3. 37 ° C de _N2 akımı altında kurutulur. Aşama 4.2 de tarif edildiği gibi kurutma işleminden sonra, MeOH içerisinde AcOH ayrı bir bölüntüsünün ilave edin. Nitrojen altında, 5 dakika _(N2) altında, 37 ° C'de akışı için sıvıyı kurutun.
   1. Tekrar yeniden süspansiyon, kurutma en az 3 kez. Kullanılana kadar -20 ° C de kurumuş maddenin saklayın.

5. C18 Temizlik-up

1. Bir C18 kartuşu kolonu dengeyeACN üç hacim ve% 5 AcOH beş hacim ile (boyut 1 mi, 100 mg reçine). Hafif pozitif hava basıncı uygulanması ile dengeye çözümlerin geçişini hızlandırmak.
2. Tuzdan arındırılmış ve borat-ücretsiz numune tüpüne% 5 AcOH'nin 500 ul ekleyin ve girdap tarafından çözülür.
3. Dengelenmiş C18 kolonu üzerine yeniden süspansiyon haline getirildi örnek yükleyin ve bir cam vidalı somunlu bir tüpe (13 x 100 mm) içine doğru akışını toplamak. Zehir, O-glıkanlar, aynı tüp içine,% 5 AcOH 3 ml.
4. , Tüp parafilm küçük bir iğne ile küçük delikler yapmak veya tüp kapağı gevşek kapalı PTFE-kaplı tapa kullanın ve -80 ° C'de veya kuru buz üzerinde örnek dondurmak. Liyofilizasyon ile ayrılması için kullanılabilir. Kullanılana kadar -20 ° C'de kurutuldu örnek saklayın.

Permethylation 6. Taban hazırlanması

NOT: sağlam permethylation ulaşmak NaOH bulamaç taze hazırlamak için. Permethylation reaksiyonları için kullanılan bütün cam yaygın temizlenmelidir.

1. , Permethylation için temel reaktif hazırlamak temiz bir cam vidalı kapaklı bir tüp (13 x 100 mm),% 50 NaOH, 400 ul ekleyin. Susuz MeOH ve girdap 800 ul ekleyin.
2. Ve beyaz bir çökelti oluşturmak üzere susuz dimetil sülfoksit (DMSO) ve vorteks 4 ml ilave edilir.
3. Çökeltiyi pellet haline getirmek üzere, 1 dakika boyunca 600 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant Pipet ve atın. Pelet susuz DMSO içerisinde fazladan bir 4 ml ilave edilir. Vortex.
4. Adımı yineleyin 6.2 ve üç kez ya da hiç beyaz çökelti oluşana kadar 6.3 minimum.
5. 3 mi susuz DMSO içinde topak taban çözülür ve yavaşça temiz bir Pasteur pipeti ile yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
6. Depolanan olamaz gibi aşağıdaki permethylation reaksiyon için hemen tabanını kullanın.

Çıkış glıkanların 7. Permethylation

1. C18 arıtıldı numunesi ve girdap veya süspansiyon haline getirmek için sonikasyon susuz DMSO içerisinde 200 ul ekle.
2. Resusp 300 ul ekleörnek uçlu taban bulamaç hemen iyodometan 100 ul (Mel) ekleyin. Teflon astarlı kapakla boru mühürleyin ve kuvvetli bir şekilde girdap 5 dakika için karıştırın.
3. , Permethylation reaksiyonu durdurmak buz ve vorteks% 5 AcOH'nin 2 ml ekleyin. Pipet çözüm yukarı ve aşağı 5 kat buharlaşma ile Mel kalan hacmini azaltmak için.
   NOT: AcOH solüsyonu nötralize ve Mel çıkarılması faz-bölme sırasında su fazına sülfatlanmış glıkanların ekstraksiyon verimini artırır.
4. Diklorometan (DCM) ve vorteks 2 ml ilave edilir. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj sulu ve organik fazlar ayrıldı.
5. Yeni bir cam boru (13 x 100 mm) içine üst tabaka (permetilatlı sülfatlanmış glıkanların çoğunluğu içeren sulu faz) aktarın.
6. Organik faz ve vorteks _H2O 2 ml ilave edilir. 600 x 1 dakika süreyle santrifüj, sulu ve organik fazların ayrılması ve köknar ile ikinci bir sulu faz birleştirmekst sulu faz (aşama 7.5).
7. Adımı tekrar 7.6 ile 7.5 üç defa daha, fakat daha sonraki bölümlerinde ortaya çıkan sulu faz kaydetmek için bir ihtiyaç vardır.
8. Alt tabaka (organik faz) mümkün olduğu kadar nihai üst tabaka (sulu faz) çıkarın ve temiz bir Pasteur pipeti kullanılarak, ayrı yeni bir cam tüp içine alt katman (organik faz) aktarın.
9. 42 ° C de _N2 akımı altında, organik faz kurutun.
10. Kullanılana kadar -20 ° C'de Parafilm ile tüp ve mağaza örtün.

Sulu Faz permetilatlı Sülfatlanmış O-glıkanların 8. C18 Temizleme

1. ACN üç hacim ve% 5 AcOH beş hacim bir C18 kartuşu kolonu dengeye getirin.
2. Toplanmış ve adımlar kolona 7.5 ve 7.6 kombine sulu fazlar yükleyin.
3. Duyunun tuzunun giderilmesi amacıyla _H2O ile 10 ml sütun yıkayın.
4. Zehir permetilatlı sülfatlanmış 2 ml yeni bir cam tüp içine, O-glıkanlar% 50 ACN. Daha büyük oligosakaritlerde permetilatlı sülfatlanmış O-glıkanların geri kazanımını artırmak için% 85 ACN ile ek bir elüsyon kullanın.
5. 42 ° C'de, azot akımı altında kuru yıkama sıvıları.
6. MS analizi öncesinde 6 ay -20 ° C de kurumuş maddenin saklayın.

Permetilatlı O-glıkanların 9. Kütle Spektrometre

1. 210 ° C sıcaklıkta kılcal 0,40-0,60 ul / dakikalık bir şırınga akış oranında bir nanoelectrospray kaynağı kullanılarak uygun bir kütle spektrometresi içine doğrudan infüzyon ile permetilatlı O-glikanlar analiz edin. MS / MS ve bir iyon tuzağı enstrüman MS ⁿ CID tarafından parçalanma,% 30-40 çarpışma enerjisini geçerlidir.
2. Negatif iyon kipi için, yeniden yapılandırmak permetilatlı sülfatlı, O-glıkanlar, metanol / 2-propanol / 1-propanol, 50 ul / 13 mM sulu amonyum asetat (16: 3: 3: 2 hacim itibarı ile). Pozitif iyon modu için, 1 mM sodyum hidro 50 ul / nötr siyalilleştirilmiş O-glikanlar permetilatlı tekrar oluşturmakmetanol / su içinde xide (1: 1).
3. Bireysel O-glıkan yapılara ^13,19 karakterize etmek MSn analiz için Xcalibur yazılım paketi sürüm 2.0 toplam iyon eşleme (TİM) ve nötr kayıp tarama (NL tarama) işlevini kullanın.

Sonuçlar

In-jel İndirgemeli β-Eleme Etil Asetat Tedavisinin Etkisi önce

-Jel indirgeyici β-eleme kullanarak müsin sığır serbest permetilatlı O-bağlantılı glıkan numune temsili kütle spektrumu, Şekil 3 de gösterilmiştir. Jel parçalarının EtOAc yıkama etkin bir sonraki MS analizi ²⁷ müdahale SDS içinde ve poliakril kirletici maddeleri ortadan kaldırır.

Tartışma

Jel içi indirgeyici β-eliminasyonunun sulu-organik ekstraksiyon ile birleştirilmesi, SDS-PAGE ile diğer proteinlerden çözülen küçük miktarlarda müsin tipi glikoproteinlerden hasat edilen sülfatlanmış ve sülfatlanmamış O-bağlı glikanları karakterize etmek için elde edilebilecek yapısal verilerin hassasiyetini ve derinliğini arttırır. Bu çalışmada sunulan teknik yaklaşımların temel ilerlemeleri şunlardır: (a) jel türevli kirleticilerin basit yıkama adımlarıyla kolayca uzaklaştırılması; (b) hızlı bir su-DCM bölünmesini taki...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Su, deiyonize su	Sigma-Aldrich	270733-4L	CHROMASOLV, HPLC
Asetik asit için, Buzul	Fisher	A38-500	Sertifikalı ACS & ge; %99,7 w/w
Metanol	Sigma-Aldrich	34860-4L-R	CHROMASOLV, HPLC, ve ge için; % 99,9
Amonyum bikarbonat	Fluka	09830-500G	BioUltra, > % 99,5 (T), Adım 1
Asetonitril	Sigma-Aldrich	34998-4L	CHROMASOLV Plus, HPLC için, & %99,9, Aşama 1
Etil asetat	Fluka	34972-1L-R	LC-MS CHROMASOLV, Adım 1
Sodyum borohidrür	Aldrich	213462-25G	ReagentPlus, %99, Adım 2
İyodometan	Sigma-Aldrich	289566-100G	ReagentPlus, %99,5,  Adım 6.  4 & derecede saklayın; Kullanana kadar C.  Kullanmadan önce oda sıcaklığında bekletin.
Sodyum hidroksit çözeltisi, %50 w/w	Fisher	SS254-1	Sertifikalı, Adım 6
Dimetil sülfoksit, susuz	Sigma-Aldrich	276855-1L	Susuz, ≥ %99,9, Adım 6
Metanol, susuz	Sigma-Aldrich	322415-100ML	Susuz, %99,8, Adım 6
Diklorometan	Sigma-Aldrich	34856-4L	CHROMASOL®, HPLC için, ≥ % 99.8, stabilizatör olarak amilen içerir, Adım 7
Dowex 50WX8 hidrojen formuhidrojen formu 100-200 & nbsp; örgü	Sigma-Aldrich	217506-500G	Adım 3
AG 50W-X8 Reçine	Bio-Rad	142-1441	Adım 3
BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Katı Faz Ekstraksiyon Kolonu, PP, Oktadesil (C18) Ters Faz	JT Baker	JT-7020-01	Adım 5 ve 8
%7,5 Mini-PROTEAN TGX Prekast Jel	Bio-Rad	Step 1
Coomassie Boyası	Bio-rad	161-0786	G-250, Adım 1
Kütle spektrometresi için gümüş leke kiti	Pierce	24600	Adım 1
Oligosakkaritler kiti (Maltotrioz, dp3: R474140)	Supelco	47265
Oligosakkaritler Kiti (Maltotetraoz, dp4: R474135)	Supelko	47265
Tek Kullanımlık Pastör Pipetleri, Cam, Kısa Uçlu	VWR	14673-010	Kullanmadan önce yıkayın
PYREX 13 x 100 mm Tek Kullanımlık Yuvarlak Alt Dişli Kültür Tüpleri	Corning	99447-13	Kullanmadan önce yıkayın
PYREX 16 x 125 mm Tek Kullanımlık Yuvarlak Alt Dişli Kültür Tüpleri	Corning	99447-16	Kullanmadan önce yıkayın
PTFE Yüzlü Kauçuk Astarlı Fenolik Kapaklar/Kapaklar	Kimble	45066C-13	Kullanmadan önce yıkayın
PTFE Yüzlü Kauçuk Astarlı Fenolik Kapaklar/Kapaklar	Kimble	45066C-15	Kullanmadan önce yıkayın
Hamilton HPLC şırınga	HAMILTON	81265	hacim 500  μ l, iğne boyutu 22 G
Hamilton HPLC şırınga	HAMILTON	81165	hacim 250  μ l, iğne boyutu 22 G
Hamilton HPLC şırınga	HAMILTON	81065	hacim 100   μ l, iğne boyutu 22s G
Hamilton HPLC şırınga	HAMILTON	80965	hacim 50   μ l, iğne boyutu 22s G
Hamilton Kalibre Şırıngalar	HAMILTON	80300	hacim 10  μ l, iğne boyutu 26s G
Petri Bulaşık Camı 100 mm x 15mm	GSC INTERNATIONAL INC	1500-4	Kullanmadan önce yıkayın, Adım 1
Bard-Parker Cerrahi Bıçaklar	Fisher	371310	Adım 1
Reacti-Therm Isıtma/Karıştırma Modülü	Pierce	18870	Adım 1, 4 ve 7
Isıtma Blokları	Fisher	125D	Adım 2
Pyrex cam elyaf cam yünü borosilikat gözenek boyutu 8  μ m	Aldrich	CLS3950	Adım 3
Sigortalı Silika KesiciBoru kesici	alltech	3194	Adım 3
Çok tüplü girdaplar	VWR	444-7063	Adım 6
Liyofilizatör 25EL Freezemobile	Virtis	25EL
Santrifüj	VWR	Klinik 50
LTQ Orbitrap Keşfi	Thermo Fisher Bilimsel