Anne Hücreleri ve dalgalanma Testleri Manyetik orting birleştiren Mitotic Hücre Yaşlanma sırasında Genom istikrarsızlık Analiz için Saccharomyces cerevisiae

Özet

Dalgalanması testleri ile ölçülen genç Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde mutasyon oranları farklı Replikatif yaştan annesi hücrelerinin mutasyon frekansları tahmin etmek için kullanılır. Manyetik ayırma ve akım sitometri sonra tahmin mutasyon sıklıkları sapmaları tespit etmek, gerçek mutasyon frekansları ve anne hücrelerin yaşını ölçmek için kullanılır.

Özet

Saccharomyces cerevisiae mekanizmaları ve genom istikrarsızlık sonuçlarını incelemek için mükemmel bir model sistem olmuştur. DNA onarımı ve DNA tamir faktörler tam olarak çeşitli türlerin boyunca korunduğu için, bu maya modelden elde edilen bilgiler, insanlar dahil olmak üzere bir çok organizmada, ile ilgilidir. Bununla birlikte S. cerevisiae henüz tam olmadığını yaş artan Replikatif (mitoz) ile mutasyonlar değişiklikleri biriken oranı teknik zorlamalar nedeniyle hitap kullanılan olmamıştır. Örneğin, mikromanipülasyon yoluyla maya Replikatif ömrü ölçümleri nadir mutasyonları tespit yasaklayan hücrelerinin çok küçük nüfus kapsayabilir. Kızı hücrelerinin ölümünü uyararak toplumlarda anne hücreleri zenginleştirmek üzere genetik yöntemler geliştirilmiştir, ancak nüfus büyüklükleri yine seçim sistemleri tehlikeye rastgele mutasyonların meydana geldiği ile frekansı ile sınırlıdır. Geçerli protokol manyetik Sorti yararlanıryüzey-etiketli maya anne hücreleri ng fenotipik seçimleri arasında nadir mutasyonları ölçmek için anne hücreleri yaşlanma yeterince büyük popülasyonları elde etmek. Dalgalanması testleri ile ölçülen mutasyon oranları, ve mutasyon frekansları ilk genç hücreler için kurulan ve çeşitli Replikatif yaş annesi hücrelerinde mutasyonların sıklığını tahmin etmek için kullanılır. Mutasyon frekanslar sıralanmış bir ana hücreler için belirlenir, ve ana hücrelerin yaş hücre bölünmesi esnasında, hücre yüzeyleri üzerinde oluşturulan tomurcuk izleri tespit eden bir flüoresan tepkime maddesi, ile boyama ile akış sitometrisi kullanılarak belirlenir. Deneysel olarak, belirli bir replikatif yaş ana hücrelerde gözlemlenen frekanslara hücre bölünmesini sayısına göre tahmin mutasyon frekansın karşılaştırılması daha sonra biriken değişim oranından yaşa bağlı değişiklik olup olmadığını belirleyebilir. Bu temel protokolün Varyasyonları özgü gen işlevlerinde değişikliklerin etkisini araştırmak için araçları sağlamak veyamutasyon birikimi belirli çevresel koşullar Replikatif yaşlanma sırasında mekanizmalar yatan genom istikrarsızlığı gidermek için.

Giriş

Bu tür maya Saccharomyces cerevisiae gibi mikroorganizmalar, mutasyon hızı incelemek için mükemmel bir model olan, ancak tam olarak bu modeller, hücrelerin mitotik yaşlanma sırasında mutasyonların birikimine araştırmak için kullanılan edilmemiştir. Nükleer genomu içerisinde, mutasyon birikimi gen fonksiyonlarının ¹ (veya varyasyonun) ilerleyen kaybıyla sonuçlanan yaşlanma katkıda sürülmüştür. Büyük ölçüde çünkü uyduruk genetik sistemlerin bu süreci etkileyen genetik ve çevresel faktörlerin belirlenmesi ve mikroorganizmalar nadir fenotipik değişiklikleri nicel kolaylığı hızlandırabilir yaşlanma sırasında mekanizmaları ve mutasyon birikimi sonuçlarını incelemek için bir mikrobiyal sistemi kullanmak için yeteneği. DNA onarım faktörler ve DNA hasar cevabı proteinler de farklı türlerin ² boyunca korunduğu, ve organizma yaşlanma temel benzerlikler S. gibi çeşitli organizmaların tespit edilmiştir cerevisiae birmuhtemelen bu hale d memeliler ^3, maya çalışmalardan elde edilen sonuçlar, birçok organizmada yaşlanma ile ilgili olacaktır.

S. yaşlanma Çalışmaları cerevisiae kronolojik yaşlanma veya hücre kopyelenebilir yaşlanmasını ölçen iki yaşlanma modelleri faydalanmak. Kronolojik yaşlanma nedeniyle besin tüketme ^3'e bölünmeyen durumu (sabit faz) olan maya hücre popülasyonlarında canlılığının ilerleyen kaybıyla karakterize edilir. Kronolojik yaşlanma modeli, büyük hücre popülasyonları kolayca mutant hücrelerin fenotipik seçim yapmak için bu modelde elde edildiğinden mutasyonlar, yaş arttıkça ⁴ birikir olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Bu durumda, mutasyon birikimi büyüme sinyal yolları ve oksidatif stres ⁵ tarafından etkilenmiş gibi görünüyor, ve bu faktörlerin her biri çok hücreli ökaryotlarda ³ yaşlanma anlaşılması için uygun olduğu. Replikatif yaşlanma modeli kullanan asimetrik DiViSiS. ile ilgili ardışık hücre nesiller ³ ile oluşur yaşlanmayı araştıran cerevisiae anne ve kızı hücreler. Maya Replikatif yaşlanma sık microfluidic cihazlar ^6,7 maya hücreleri küçük popülasyonlar video mikroskobu ile anne ve kızı hücreleri, ya da daha yakın zamanda, küçük popülasyonlarının mikromanipülasyon ile ölçülmüştür. Sınırlı popülasyon boyutları tam genom bilgileri tek hücre elde edilen ya da çok yüksek frekanslı genetik değişiklikler ⁸ ölçülür sürece mitotik yaşlanmada mutasyon birikimi araştırılması için, bu yaklaşımlar kötü uygun hale gelir. Tek tek hücrelerin tam genom sekanslama gibi sahalarda mutasyon birikimi araştırmak için büyük ölçüde veri setleri sağlar, ancak fenotipik seçim sistemleri, altta yatan mutasyonun birikimi incelemek için mutasyon oranlarını ölçmek için bir araç sağlayan büyük avantajlara sahiptir. Çalışmalar haploi fenotipik seçimleri yoluyla mutasyon frekansları ve oranlarını incelemek içinReplikatif yaşlanma sırasında d maya suşları henüz rapor edilmemiştir.

Mutasyon oranları yaygın dalgalanma testleri ⁹ kullanılarak ölçülür. Mutasyon frekans değerleri bir popülasyonda bir gen sekansı içerisinde bir mutasyon taşıyan hücrelerin toplam sayısını yansıtmaktadır. Bu bağımsız mutasyonların meydana geleceği hücreler ve sadece önceden mevcut olan mutasyonları taşıyan bu hücrelerin herhangi bir soyunu kapsar. Bunun aksine, dalgalanma testleri vasıtasıyla ölçülen bir mutasyon oranı, yeni nesil her bir hücre ile ortaya çıkan mutasyonlar bağımsız sayısını temsil eder. Bu testler tipik olarak, bir hedef dizisi daha önceden var olan mutasyonlar ile hücrelerin ilave yakın doyması kültürlerinin yetiştirilmesine ve seçici ortam üzerinde büyüme mutant hücreler tanımlama olasılığını azaltmak için, düşük hücre yoğunluklarında kültür aşılamak çok tekrarlanan içerir. Suret popülasyonunda tespit mutant hücrelerin sayısı daha sonra i sayısını tahmin etmek için çeşitli matematiksel modeller biri kullanılırbüyüme ⁹ sırasında ortaya ndependent mutasyonlar. Ortalama nüfus büyüklüğü bağımsız mutasyonların sayısını karşılaştırarak mutasyon oranı bir ölçü sağlar. S., Bu genlerin kaybı fonksiyon-mutasyonlar seçilebilir fenotiplerini üretmek beri cerevisiae, mutasyon frekansları ve oranları sık sık, URA3 ve CAN1 genleri kullanarak ölçülür. URA3 tarafından kodlanan protein molekülü toksik ¹⁰ içine 5-FOA dönüştürür yana bir URA3 fonksiyon kaybı, 5-fluoroorotik asit (5-FOA) dirençli hücre oluşturur. CAN1 şifrelediği protein, hücrelere ¹¹ içine arginin ve kanavanin taşıma yana CAN1 fonksiyon kaybı, hücreler canavanine, toksik bir arginin analogunun dirençli olmayı sağlar.

Hem genetik hem de fiziksel sıralama stratejileri başarıyla S. geniş popülasyonları elde etmek için istihdam edilmiştir cerevisiae anne hücreleri Replikatif yaşlanma soruşturmaları kolaylaştırmak için. Genetik stratejileri bir popülasyonda kızı hücre hayatta karşı seçim zeki yaklaşımları içermektedir. Annesi zenginleştirme programı (MEP) loxp siteleri ¹² içerecek şekilde tasarlanmıştır edilen iki temel genlerin kızı özgü bozulmasına yol açan, sadece kız hücrelerde Cre yeniden ifade beta-östradiol indüklenmesini içerir. MEP suşlar, uyarıcının yokluğunda normal olarak yetiştirilebilir, ancak anne kız hücreler hücreler, hücre siklüsü boyunca ¹² ilk ilerlemesi sırasında tipik olarak, M-fazında tutuklama olurken, indüksiyonundan sonra bölünmeye devam edecektir. Bu sistem, genel olarak yaşlanma sırasında mutasyon birikimi incelemek için kullanılmış olsa da, bu yaşlanma ana hücrelerinde ^13,14 heterozigosite kaybı, diploit maya suşlarında genom istikrarsızlık nispeten sık bir formu, hem de biyokimyasal değişiklikler incelemek için kullanılmıştır. Benzer şekilde, kızı-deşarj sistemi S. kızı özgü ifadesini içerir cereviSIAE URA3 geninin ^15. 5-FOA hangi URA3 ifade noktası yavru hücre ölür, ortamına ilave edilene kadar ana hücreler ¹⁵ büyümeye devam eder kızı-deşarj suşları, normal büyümeyi sürdürmüştür. Bu ana hücreler için kullanışlı ettirecek sistemleri, ancak seçim sistemi oluşturan gen fonksiyonlarının korunması bağlıdır. Seçim sistemi bir ya da daha çok bileşen olarak rastgele mutasyonların seçimi kaçış ve katlanarak çoğalmasına kız hücrelerde neden olabilir. MEP suşların gelişimi sırasında, uygun nüfus büyüklükleri seçimi ¹² kaçış olabilir mutant kızı hücrelerin görünümünü önlemek için kararlı idi. Ancak, nüfus büyüklüğü bu sınır Replikatif yaşlanma sırasında genom istikrarsızlık nadir formları algılama ödün. Nüfus büyüklüğüne Bu kısıtlama kısmen her genin iki kopyası çünkü çoğu, seçim sistemi katkıda diploid maya suşları kullanılarak üstesinden gelinebilirmutasyonlar büyük olasılıkla ¹² çekinik olacaktır. Bununla birlikte, Diploid suşların kullanımı kolay uygulanabilen, haploit maya hücrelerinde tespit edilebilir kıyasla tespit edilebilir mutasyon olayları türlerini kısıtlar.

Fiziksel sıralama stratejileri ana hücrelerinde büyük nüfuslu zenginleştirmek için etiketsiz kızı hücrelerden etiketli bir hücre yüzeyi ile anne hücrelerin izolasyonu bulunmaktadır. S. hücre yüzeyi proteinleri olduğu şeklindeki gözlem, (hücre duvarı) cerevisiae kızı hücreler yeni onlar ¹⁶ üretmek kızı hücrelerin etiketlenmesi olmadan anne hücreleri etiketlemek için istismar edilmiştir tomurcuklanma sırasında sentezlenir. Örneğin, biyotin ile etiketlenmiş yüzey üzerinde maya hücrelerinin bir ilk popülasyon yetiştirilebilir ve daha sonra, başlangıç ​​popülasyonu tarafından üretilen yavru hücre yüzeyinde biyotin içermez, çünkü ¹⁶ sıralama, anti-biyotin ve manyetik mikro-boncuklar kullanılarak kız hücrelerde izole . Seri büyüme veayırma ana hücrelerin giderek daha büyük popülasyonları elde edilmiş ve analiz edilmesini sağlar. Bu prosedür maya ^13,14,17,18 kopyelenebilir yaşlanma sırasında hücre fizyolojisi ve gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için başarıyla kullanılmaktadır. Mevcut yöntem, potansiyel olarak nadir mutasyonlar veya fenotipik tahlil seçimleri arasında genom istikrarsızlık diğer formları birikiminin ölçülmesi amacı ile ana hücreleri zenginleştirmek üzere bu biotin ile etiketlenmesinde ve manyetik ayırma tekniği uyarlar. Seri büyüme ve fiziksel ayrıştırma giderek daha büyük hücrelerinde de mutasyon birikimi analizi, hem de kendi kızı hücre popülasyonu sağlar. Nesil başına mutasyon oranlarının belirlenmesi öngörülen mutasyon frekans hücre bölünmeleri belli bir sayıda uğramıştır anne hücreleri için hesaplanacak izin verir. Tahmin frekans değerleri nedeniyle gözlenen Mutati hücre bölünmesinin ek mermi, önemli sapmalar beklenen artış dayalı olduğundantahmin edilen değerlerle karşılaştırıldığında frekanslar üzerinde biriken değişim oranından yaşa özel değişiklikler kanıtlarıdır. Bu protokolü kullanarak, akış sitometri analizi ile birleştiğinde anne hücreleri üzerinde hücre bölünmeleri sitelerine karşılık tomurcuk izleri floresan boyama hızla sıralı ve sıralanmamış nüfusun yaş dağılımını belirlemek için kullanılabilir. Bu tür reaktif oksijen türlerini tespit etmek için kullanılanlar gibi floresan ilave reaktifler, aynı zamanda Bu protokol uygulamasında kullanılabilir. Genel olarak, bu protokol yaşlanma ile ilgili genom istikrarsızlık etkileyen genetik ve çevresel faktörleri araştırmak için uygun bir model organizma yaşa bağlı hücre fizyolojik değişikliklere korelasyon potansiyeli ile genom istikrarsızlık yaşa bağlı değişikliklerin etkili analiz sağlar.

Protokol

Medya ve Çözümleri 1. Hazırlık

1. Maya özü-pepton-glikoz (YPD) standart protokol için zengin bir ortam kullanarak hücreleri büyütün. % 2 Bacto-pepton,% 1 maya özütü, YPD ortamında% 2 glükoz çözeltisi hazırlayın ve ¹⁹ katı bir ortam için% 2 Bacto-agar ekleyin. Sterilize etmek otoklavlayın. Belirli bir büyüme durumu veya mutant maya suşu test etmek için, gerekirse, alternatif bir ortamı kullanın.
2. Kanavanin dirençli mutantların seçmek için 60 mg / L canavanine (SC-Arg + kanavanin) arginin eksik bir katı sentetik tam orta olun. Arginin (Bırakma karışımı) amino asitleri,% 2 glikoz,% 0.2 tamamlandı ek karışımı ya% 0.67 bakto-maya azot baz,% 2 Bacto-agar ¹⁹ olan bir çözelti hazırlayın. Otoklav ve 20 mg / ml stok çözeltisinden kanavanin ilave edilmeden önce soğukta ¹⁹ (4 ° C'de saklanır, filtre ile sterilize edilmiş).
   1. 5-fluoroorotik asit (5-FOA) içeren katı sentetik tam orta olun. 500 hazırlayınamino asitler olmadan% 1.34 bakto-maya azot baz,% 4 glükoz,% 0.4 tam ek karışımını ve% 0.2 5-FOA ve bir çözelti ¹⁹ ml filtre-sterilize edin. Otoklav daha sonra 500% 4 Bacto ağar çözeltisi ilave edildi, kısa bir süre, serin ve 500 mi filtre ile sterilize edilmiş besleyici çözelti ile karıştırın. Diğer mutasyon deneyleri için uygun alternatif medyayı kullanın.
3. Biotin ile etiketlenmesinde, 500 mi 1 x fosfat, 137 mM sodyum klorid, 2.7 mM potasyum klorid, 10.14 mM sodyum fosfat dibazik, ve 1.77 mM potasyum fosfat dibazik, pH içeren tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi 8 deposu 4 ° C olmak ve devam Kullanım sırasında buz.
4. Steril, ultra saf su taze 5 mM biyotin stok yapmak.
5. , Biyotin etiketleme söndürme 1x PBS 500 mi, 100 mM glisin yapmak. 4 ° C'de saklayın ve kullanım sırasında buz üzerinde tutmak.
6. Ikinci hücreler ve deney süresi sayısına bağlı olarak, 1 x PBS, 2 mM EDTA,% 0.5 Bovi içeren boncuk işaretleme tamponu, 1-2 L yapmayane serum albümin. Filtre sterilize ve de gaz tampon. 4 ° C'de saklayın ve kullanım sırasında buz üzerinde tutmak.
7. Hücre canlılığı ölçümlerde kullanmak için, oda sıcaklığında bir 1x PBS içinde% 0.4 tripan mavi bir çözelti, filtre sterilize ve mağaza hazırlayın.
8. Bir buğday tohumu aglutinin (WGA) ile floresan konjügat alikosu küçük hacimler (~ 100 | il), hücre yaş belirlenmesinde kullanım için sarılmış folyo (ya da opak) mikrosantrifüj tüpleri içinde, -20 ° C de saklamak için.

Mutasyon Oranı ve Sıklığı 2. belirlenmesi

1. Standart kültür koşulları altında yetiştirilen hücreler için dalgalanma testleri kullanılarak hücre üretimi başına temel bir mutasyon oranını kurmak. On erken sabit fazda (~ 10 ⁸ hücre / ml) 1000-5000 hücre / ml'lik bir başlangıç ​​yoğunluğunda 1 mi kültürleri çoğaltmak için yedi büyütün.
   1. 2000 ve koloni oluşturucu birimler / ml belirlemek için seçici olmayan ortam (YPD) üzerine 1-4 ul Aralığı: Her suret kültürü için, hücreler 1 seyreltin. Pelet ~ 2.400 x, kalan hücreler100 ul su içinde tekrar süspansiyon ve bir mikrosantrifüj içinde 1 dakika boyunca gr mutantlann tespit edilmesi için seçici bir ortam üzerine yaymak. Kolonilerin sayılması önce 30 ° C'de üç gün boyunca (hücre büyüme oranına göre gerektiğinde inkübasyon zamanı ayarlamak) için inkübe edin.
   2. Seçici bir ortam üzerinde elde edilen mutant koloni (r) sayısına göre araştırmada ortaya çıkan bağımsız mutasyon (m) sayısını belirler. ^9, aşağıdaki formülde r mutant kolonilerin ortalama sayısı ile ikame m bulmak için Lea-Coulson medyan tahminleyicisini. Denklemin sol tarafı neredeyse sıfır oluncaya kadar Sonra m değerlerini yerine.
      
   3. Mutasyon oranını belirlemek için, ilk olarak suret kültürleri ve hacminin ortalama koloni oluşturan birimler / ml çarparak seçici ortam üzerine yayıldı yaşayabilir hücrelerin ortalama sayısını hesaplamakseçici ortam üzerine yayıldı mi kültür ile aşılandı. Hücre üretimi başına mutasyon oranını elde etmek için canlı hücreler bu ortalama sayısına göre adım 2.1.2 m değeri bölün.
2. Aşama 2.1.3 tarif edildiği gibi ayrı ayrı bir deneyde, her kültür için suret seçici ortam üzerine yayıldı canlı hücre sayısını hesaplayın. Mutasyon frekansı elde etmek için seçici bir ortam üzerine yayıldı canlı hücre sayısına göre bir kültür elde edilen mutant koloni (r) sayısı bölün. Bazal mutasyon frekansı olarak aşama 2.1 'de replike kültürden tek tek mutasyonlan frekansların ortalama veya medyan kullanın.
3. Mutasyon birikimi yaşa özgü değişiklikler için test ederken ihtiyacınız olacak mutasyonların sıklığında herhangi bir değişiklik etiketleme adım sonuçları dikkate olmadığını belirlemek için biotin etiketleme hücrelerinin (3.2 ve 3.4 adımları) öncesi ve sonrası frekans ölçümlerini yapmak.

3. biotin ile etiketlenmesinde

1. Streak S. cerevisiae YPD ortamı üzerine, -80 ° C'de, bir gliserol stokundan ve 1-3 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
2. Steril bir pipet kullanarak, su tutma 1 ml (veya daha fazla) çizgi plaka transfer hücreleri akılda çizgisinin bir kalın yetiştirilen kısmının 1-1.5 cm yaklaşık 10 ⁸ hücreleri verecektir. Hemasitometre kullanarak tam hücre yoğunluğu belirlemek.
3. Suşu (veya tedavi durumu) toplama noktası başına mutasyon sıklığı belirlenecek olan veya seçici ortam üzerinde örnekleme başına en az 5-10 mutant koloniler elde etmek için yeterli bir nüfus büyüklüğüne göre 10 ⁸ hücreleri etiketlemek (adım 2.2 mutasyon frekansa göre). Suş / durumuna göre temel ölçümler için ek bir 10 ⁸ hücreleri içerir.
4. Üreticisinden, 5 mM biotin reaktif stoğunu kullanmak ve hafifçe inkübasyon sırasında kaya dışında standart prosedüre göre biotin etiketi. Tüm santrifüj adımları 3000 x g hızında, 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj s,4 ° C'den yüksek sıcaklıklarda eğirme ince artan hücre kaybına yol açabilir. Son yıkamadan sonra, su içinde 10 ⁸ etiketli hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar hücrelerin süspansiyonu.
5. Tripan mavi boya kullanılarak hücrelerin yaşayabilirliği kontrol edin. 23 ul su ve 1 x PBS içinde% 0.4 tripan mavisi ile 67 ul hücre 10 ul seyreltin. Hemasitometre kullanılarak canlı (boyasız) ve ölü (boyanmış) hücrelerini puanlama önce oda sıcaklığında en az 40 dakika bekletilir.
6. Genom istikrarsızlık, hücre yaş, ve diğer ilgili özellikleri için başlangıç ​​değerleri ölçün (bölümler 5, 6 görmek ve 7).
7. Bir Erlenmeyer şişesine (yaklaşık 5 x 10 ⁶ hücre / ml) içinde 10 ⁸ hücre başına YPD ortamında 20 ml biyotin-etiketli hücreler aktarın. 10 ⁸ hücre / ml (4-5 hücre kuşakları) yaklaşık bir yoğunluğa kültür (ler), 20 ° C'de 16-18 saat büyümeye ama Hücreler durağan aşamaya ulaşmak için izin yoktur. 30 ° C'de büyüme için kısa bir kuluçkalama süresi kullanın. , Biyotin-etiketli c tutunboyunca 4 ° C'de arşın ile birkaç saat önce orta ilave edilmeden önce, büyüme süresi ve toplama zamanlamasını optimize etmek için gerekli olursa.

4. Boncuk Etiketleme ve Manyetik Ayırma

1. Büyüme aşamasından sonra, bir hemositometre kullanılarak, hücre kültürünün yoğunluğunu belirlemek için bir kısım seyreltin. 3000 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj ile pelet hücreleri. Süpernatantı dökün.
2. Daha sonra, boncuk işaretleme tamponu, 30 ml pelet askıya vorteks santrifüj ve 4.1 bölüm olarak süpernatant dökülerek hücreleri yıkayın. Tekrar yıkayın.
3. Tamamen vorteks ile 10 ⁸ toplam hücre başına 50 ul boncuk-etiketleme tampon hücreleri tekrar süspansiyon. Karıştırmak için kısaca 10 ⁸ toplam hücre ve vorteks başına 2 ul manyetik boncuk ekleyin. Bir online protokol modifiye (karıştırmak için periyodik tersini, 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </ A>).
4. Boncuk etiketleme tamponu, 30 ml hücreleri üç kez yıkayın.
5. Hücreler yeniden süspanse sadece kadar orta ayarda 10 ⁸ toplam hücre başına 0.5 ml boncuk-etiketleme tampon ve kısaca vorteks pelet ekleyin. Kalan hücre kümeleri kaldırmak için bir 50 ml tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden dökün. Gerekirse, önce kolonu üzerinde yükleme 1-2 saat boyunca buz üzerinde hücreleri bırakın.
6. Manyetik sütun, bağlanan yıkama ve manyetik boncuk etiketli ana hücrelerin elüt edilmesi için üreticinin tavsiye ettiği protokol takip edin. Işaretli hücrelerin artış elde edilmesi için, 2 x 10 ⁹ toplam hücre başına en az bir sütun kullanılır.
   1. Onlar akışını engellemek gibi, sütunları yüklerken oluşabilecek kabarcıklarını çıkarın. Çıkarın ve bir online protokolü modifiye boncuklar (arasında sıkışma hücreleri önlemek için yıkamalar arasında ayırıcı üzerinde sütun yerine http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
   2. Arzu edildiği takdirde, ana hücreler tarafından üretilen genç hücrelerin analiz bağlanabilen ve yıkama aşamaları arasından akar kaydedin. Adım 4.7 açıklandığı gibi hücrelerin konsantre.
   3. Bir seferde birden fazla örnekleri işlemek için çoklu-sütun ayırıcılar kullanın. Aynı toplama tüpünün içine aynı numunenin birden çok sütun elute kullanma süresinin azaltılması ve hücre kaybını azaltmak için.
7. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile elüt ana hücreler konsantre edilir. Aspire 1 ama tüm 10 ⁸ orijinal biyotin-etiketli hücre başına tampon ml. Vortex kısaca tampon kalan hücreleri askıya.
8. Bir kısım hücreler seyreltin ve hücre yoğunluğu ve bir hemositometre kullanılarak hücre canlılığı, tripan mavisi belirlemek için boyanmayan (adım 3.5). Geri kazanılan toplam hücre sayısını hesaplayın.
   1. Hücrelerin sayısı beklenenden önemli ölçüde daha yüksek olması durumunda, genç hücreler kirlenmesine bertaraf edilmesini denemek için bir sütunu içinden elüsyon örnek geçmektedir.Hücrelerin sayısı beklenenden önemli ölçüde daha düşük olması halinde, ana hücrelerin verimini iyileştirmek için diğer bir kolon boyunca numune boyunca kaydedilen akış geçmektedir.
9. Alternatif bölümleri 5 ve 6'da tarif edildiği gibi olmadan yine kendi replikatif yaş (adım 3.7) artırmak ve boncuk etiketlenmesi ve (adım 4.1-4.8.1) sıralayarak takip YPD çorbasının hücrelerin büyümesi, daha fazla analiz için hücreleri kullanarak biyotin etiketleme tekrarlamanız gerekir.

Replika Çağı 5. Belirlenmesi

1. Bu bölümde yer alan tüm adımlar için oda sıcaklığında 5000 x g'de 2 dakika boyunca hücreler dönerler. 1.5 ml santrifüj tüpüne elde edilen hücreler (~ 10 ⁸ hücre / ml) 25 ul koyun ve PBS 1x 1 ml ile iki kez yıkayın. Süpernatant aspire.
   1. WGA-konjugat bir kısım çözülme, girdap mix ve protein agrega ortadan kaldırmak için kısaca dönmeye. Th yüzeyinde tomurcuk izleri etiketlemek için PBS 1x 180 ul ve bir fluoresan moleküle konjuge WGA 20 ul süspanseE hücreleri. Folyo ile 1.5 ml'lik bir santrifüj tüpü Kapak ve yumuşak bir 30 dakika boyunca 30 ° C'de çalkalanarak inkübe edin.
   2. 1 mi 1X PBS ile üç kez yıkayın.
2. Floresan mikroskopi, etiket slaytlar ve bir anti-solmaya ajanı kullanılarak standart protokol başına monte edin. Tamamen görüntüleme sırasında hücre hareketi önlemek için coverslip sızdırmazlık önce karanlıkta (birkaç güne kadar) slaytlar tedavi. Hücre yaşı temsili bir ölçümünün elde edilmesi için, numune başına en az 50 hücrelerinde tomurcuk yara sayısı. Yukarı gerekirse, tomurcuk izleri görüntüleme için aylık 1 için Mağaza slaytlar.
   1. Alternatif olarak, aşama 5.1.2 sonra PBS 1x 1 ml suspensiyon halindeki hücreler üzerinde akış sitometresi gerçekleştirerek, WGA-birleşikten flüoresan sinyal yoğunluğunu belirler. WGA-Alexa 488. için 505 nm uzun geçiş filtresi ile 405 nm uyarma lazer ve 530/30 nm emisyon filtresi kullanın, her toplama noktası için bir boyanmamış denetimi ekleyin.
3. Üzerinde mikroskopisiyle sayılır genç hücrelerde ve yaşlanmış hücrelerde grafikte tomurcuk izlerix-ekseni üzerinde aynı hücre popülasyonlarından WGA-konjügat floresans normalize geometrik ortalama karşı Y ekseni (geometrik ortalama lekeli / boyasız geometrik ortalama). Bu ilişki için doğrusal bir eğilim çizgisinin denklemi edinin. Takip eden deneyler için, denklemde x için bir hücre popülasyonunun WGA-konjügat floresan yoğunluğunun normalize geometrik ortalama ile değiştirin ve bir numunenin ortalama hücre yaşını belirlemek için y çözer.

6. Mutasyon Frekans

1. Adım 2.1.1 anlatıldığı gibi yayılmış YPD orta ve seçici bir ortam üzerine adım 4,7 tampon içinde yeniden süspanse anne hücreleri sıralanır. 1 dakika boyunca 5.000 xg'de seçici orta ve spin hücreleri için yeniden süspanse ana hücrelerinde 1 ml kullanın.
   NOT: hücreler büyük toplumlarda cansız ve yaşlanmış hücreler artan sayıda telafi etmek için yaş arttıkça YPD ortamında üzerine seyreltilmiş hücrelerin daha büyük hacimli yayıldı.
   1. YPD orta ve seçici orta inkübesırasıyla, 3 ve 4 gün boyunca 30 ° C 'de 6.1 dur. Çok eski hücreler veya yavaş büyüyen suşlar için bir hafta inkübasyon süresi bitti artırın. Adım 2.2 açıklandığı gibi mutasyon sıklığı hesaplayın.

7. Verilen Replikatif Çağ için Öngörülen Mutasyon Frekansı Hesaplanması

1. İlgili sıralama için kriteri ana hücrelerin ortalama yaş başlangıç ​​hücre popülasyonunun ortalama yaşı çıkarılarak deney boyunca biyotin etiketli hücrelerin replikatif yaş ortalama artışa hesaplayın. Adım 5.2 hesaplanan hücre yaşlarını kullanın ya 5.2.2 adım.
2. Adım 7.1 hesaplanan ortalama hücre yaş artışı adım 2.1.3 elde mutasyon oranını çarpın. İlgili Replikatif yaş hücreler için öngörülen mutasyon sıklığını belirlemek adım 2.2 hesaplanan ilk nüfus için temel mutasyon sıklığı için bu değeri ekleyin.

Sonuçlar

Şekil 1 'de bir akış diyagramıdır mutasyon oranları, frekans ve hücre yaş ölçüldüğü noktaları dahil olmak üzere işlemin genel adımlarını göstermektedir. Bu etiketleme ve manyetik ayrılabilmesi için uygun bir popülasyon boyutu seçmek için gerekli olduğundan doğru sıklığını ve genç hücre popülasyonlarının mutasyon (ya da genom istikrarsızlık diğer form) oranının belirlenmesinde, önemli bir ilk adımdır. Hızı değerleri dalgalanma testleri ⁹ kullanılarak kurulabilir. 5-FOA direnç kazandıran, URA3 geni kanavanin direnci kazandıran ya da mutasyonların CAN1 geninde mutasyon seçilen BY4741 genetik temelinde ²⁰ maya suşları için örnek Sonuçlar Şekil 2 'de gösterilmiştir. Hücreler Örnek boyunca 20 ° C'de büyütüldü Örnek deneyler için frekans oranı deneyleri, 20 ° C ve 30 ° C'de ilave edildi. Bu sıcaklıklar, ilk hücre popülasyonları yetiştirildi için kullanıldı30 ° C de daha sonraki deneyler için sıralama için temsili 20 ° C'de büyütüldü. Bağımsız çalışmalarda hızı değerleri kromozom V normal konumda CAN1 genine sahip bir suşu için biotin etiketleme sonra ilk hücre nüfus ve hücreler için karşılaştırılabilir, sol kol telomer yaklaşık 32 kilo baz çifti ( www.yeastgenome.com ) ( Şekil 2A, lavanta sütunlar). CAN1 bir mutasyon oranı kromozom V normal konumundan CAN1 geninin bir silme ve yaklaşık 25 kilobaz çiftinden telomer kromozomal VIII sağ kol üzerinde CAN1 bir parçaya sahip bir ikinci maya soyunun ilk popülasyonunda önemli ölçüde daha yüksekti ²¹ (Şekil 2B). CAN1 gen mutasyonu frekansları aynı zamanda, ya bir büyüme sıcaklığında başlangıç ​​hücre popülasyonları ve biyotin ile etiketlenmiş hücreler için karşılaştırılabilir olmuştur (kurguGüre 2A, mavi sütunlar). Bununla birlikte, mutasyon frekansları 20 ° C'de elde edilen 30 ° C de mutasyon değerlerinden daha yüksek olduğu bulunmuştur. Bu sıcaklık etkisi CAN1 geni ile sınırlı olup olmadığını test etmek için, kromozom VIII yerleştirilmiş CAN1 olan maya suşu kullanılarak, 5-FOA direnç seçilerek, URA3 mutasyonlar ölçüldü. Bu gerginlik aynı zamanda kromozom V normal sitesinden URA3 bir silme ve kromozom VIII telomer ²¹ yaklaşık 40 kilo baz çiftleri sağ kolu üzerine URA3 bir ekleme sahiptir. Mutasyon frekansı Bu kromozomal yerdeki (Şekil 2C) de URA3 boyunca 20 ° C 'de daha yüksekti. Genel olarak, bu büyüme sıcaklığı mutasyonlarının etkileyebileceğini gösterir, ancak biotin ile etiketlenmesinde mutasyon sıklığı etki gözükmemektedir. Bu nedenle, mutasyon oranları ve ilk nüfus frekansları aynı büyüme tempe tespit gerekirbüyüme ve sıralama mermi için kullanılacaktır süreyle. Bu mutasyonlar önce ya da genom yeniden düzenleme diğer türleri araştırmak için protokolü kullanarak genom istikrarsızlık etkilememektedir biotin ile etiketlenmesinde doğrulamak için tavsiye edilir.

Beklendiği gibi, Şekil 2A'da gösterilen mutasyon oranı değerleri, karşılık gelen frekans ölçümleri göre birkaç-kat daha düşüktür. Mutasyon oranı büyüme dönemi sonunda Mutasyon frekansı tedbirler ise, popülasyondaki mutant hücrelerin toplam sayısı, hücre bölünmesi, her tur yeni mutasyonları ile hücrelerin görünüşünün ölçer, bu farklılık meydana gelir. Bu çalışmalarda oranları ve% 95 güven aralıkları tekrarlanabilir sonuçlar çoğaltır az sayıda bu protokol için önerilen bir deneme başına yedi suret kültürleri kullanılarak elde edilebileceğini göstermektedir.

Başlangıç ​​frekansı ve hızı değerleri belirlendikten sonra, nüfus büyüklüğü ch olmalıdırYeterli hücreler güvenilir mutasyon frekansları belirlemek için sıralama sanmı sonra mevcut olmasını sağlar osen. Frekansları ve oranlar Şekil 2A'da gösterilenlere benzer olduğunda, yaşlanma sırasında analiz edilmesi için zaman noktası başına, 10 ⁸ hücrelerden oluşan bir popülasyonu etiketlenmesine uygundur. Bu karar aynı zamanda sıralama, her turdan sonra kurtarıldı ne kadar verimli etiketli anne hücreleri bağlıdır. Etiketli anne hücreleri kurtarma verimliliği hızla ve basitçe her bir tür için sütunları yıkandı hücre sayısını belirlemek için ve hücre morfolojisini incelemek Hemasitometre kullanılarak değerlendirilebilir. Iki ana örnek veri kazanım verimi (Şekil 3A) ile izah edilir: hücre sayıları, ilk geri sıralamak sonra beklenenden daha yüksek görünebilir ve hücrelerin küçük bir ilerleyici kaybı devam sıralama ile beklenmektedir. Birinci tipe sonra bazı deneylerde hücreler beklenenden daha fazla sayıda olabilir çözünürlüklüİlk nüfus hücreleri üzerinde tomurcukları etiketleme ult. Biotin etiketini hücrelerin sayısını belirlerken bir çubukla bir maya hücresi, tipik olarak, tek bir hücre olarak atılır olacaktır. İlk nüfus mevcut tomurcukların Etiketleme olsa, izin vereceğini bu tomurcukları gelişir hücreler ayrıca sıralama sırasında sütunlar üzerine saklanacaktır. Geri kazanım veriminin belirlenmesi Bu oluşum etkisi başlangıç ​​hücre popülasyonunda aşılı hücre fraksiyonuna bağlıdır. Yüksek hücre sayısı için ikinci bir potansiyel neden sonra sıralama bir sıralama sırasında hücre bölünmesini tamamladıktan olabilir bu zaman noktasında daha büyük aşılı hücre olması eğiliminde olduğunu. Bunun bir sonucu olarak, hala ana hücrelerinde bağlı büyük tomurcukları ancak kriteri elüt hücreler incelendiğinde daha sonra da farklı hücreleri belirtilebilir. Bazı hücrelerin kaybı büyüme ve sıralama her turda ile gözlemlenirken, protokol s her turdan sonra hücrelerin% 80-90 güvenilir birikimine neden olabilirorting. Bu etiketli hücrelerin% 80 veya daha fazla bir gereksiz yere büyük ilk hücre popülasyonu etiket ihtiyacını önlemek için izole edilmesini sağlamak için prosedürü uygulamaya çabaya değer. Ilk sıralamadan sonra iyileşme bazı değişkenlikler orada olsa ilk sort (30 dakika YPD ortamda 1 mM hidrojen peroksit) sonra hafif stres ile hücrelerin tedavisi, büyüme ve sıralama devam mermi ile hücrelerin etkili kurtarma engel olmadı stres (Şekil 3A).

Hücre morfolojisi ve yaşayabilirliği tetkik edilmesi, ayrıca ana hücreler başarılı doğrulanması için izolasyon ve seçici olmayan ortam üzerinde hücrelerin yayılma zaman koloni oluşturan birimlerin yoğunluğunu belirlemek için kullanılan seyreltme / hacimlerinin ayarlanması için hem de yararlıdır. Anne hücreleri kızı hücreleri (Şekil 3B) göre, giderek daha büyük ve onlar yaşlandıkça daha düzensiz şekilli olurlar. Annesi hücre örnekleri nedenle öncelikle büyük, IRR oluşmalıdırDeney sıralama her turda yoluyla ilerledikçe egularly hücreleri şeklinde. Düzenli şekilli çok sayıda küçük oval biçimli hücrelerin mevcudiyeti, bu ana hücreler, uygun yavru hücrelere ayrılmakla değildir gösterebilir. İlk 5-10 hücre nesiller boyunca fazla bir değişiklik olmayabilir ama anne hücrelerin canlılığı de giderek büyüyen ve sıralama her turda ile düşmelidir. Koloni oluşturma kapasitesine sahip hücre sayısı nedeniyle yaşlanmış hücrelerin oluşmasına, hücre bütünlüğü doğrudan boyanması bir çeşit uygun olarak tespit edilen hücrelerin sayısı çok daha büyük ölçüde azaltabilir. Doğrudan bir boyama yöntemi ile birinci canlılığı (yaklaşık% 80 ya da daha az) azalmaya başlar, bu koloni yaşayabilir hücrelerin yeteneği daha belirgin bir azalma beklentisiyle birim yoğunlukları oluşturucu ölçmek için kullanılan seyreltiler ve seviyesini ayarlamak gerekebilir Form koloni (iki kat kat azaltmak için).

sıralanmış nüfus ve kontrol nüfus kopyelenebilir yaşları ana hücrelerinde mutasyon frekans veri biriken mutasyonlar oranında yaşa özgü değişiklikler için analiz edilebilir önce tespit edilmesi gerekmektedir. Bu tomurcuk yara saptama reajanı (Şekil 5) bir sinyal ölçmek için ana hücreler üzerindeki tomurcuk izleri elle sayım (Şekil 4) ya da akış sitometrisi yoluyla yoluyla gerçekleştirilebilir. Tomurcuk izleri nispeten düşük arka plan sinyali WGA-floresan konjugatlarının (Şekil 4C) kullanılarak etiketlenebilir. Şekil 4A, sıralama işleminin örneklerle akışından en hücreler sıfır ya da bir çubuk yara sahip olduğunu göstermektedir. Sütun elüt hücreler çoğunlukla yaşlı ana hücreleri (Şekil 4B ve 5) 'dir. Tipik olarak,> akıtılan hücrelerin% 90 Şekil 5 sonuç sitometri akışı daha kolay görülebilir anne hücreleri vardır. Görece az sayıda tomurcuk izleri ile Cells (<6) obtained biyotin çok yavaş bölünen anne hücrelerin tersine, büyüme ilgili turunda hücre bölünmesi birkaç tur geçirdiğini değil etiketli zararlı hücreleri temsil edebilecek sıralama fazla iki tur sonra. Hücre yaş varyasyon popülasyondaki tüm hücreler eşit büyümekte ise sıralama sonraki tur artabilir.

Doğrusal bir ilişki WGA-floresan sinyal yoğunluğu ve hücre başına tomurcuk izleri sayısı arasında ise, daha geniş bir hücre popülasyonu hücre yaş değerlendirmek için daha hızlı bir şekilde de kullanılabilir. Bu analiz için her WGA-floresan sinyal yoğunluklarının normalleştirme. Yaşlı hücrelerde arttığı eşiğe hesaba katmak için uygun boyanmamış hücre popülasyonu (kızı ya da anne) için elde edilen sinyal ile boyanmış hücrelerin edici sinyali ayırmak suretiyle gerçekleştirilir Şekiller 4 ve Aynı temsilci hücre popülasyonlarının 5 gösteri analizi.Manuel sayma sırasıyla bir kız evlat hücresine (Şekil 4A) ve ana hücre popülasyonlarında (Şekil 4B) süreyle, 0.95 ve 11,4 arasında ortalama yaşları replikatif kurulmuştur. Bu iki nüfus ve üç ek nüfus için normalize WGA-sinyalleri (3.0, 6.9, ve 14.4 ortalama yaş) her popülasyon (Şekil 5B) bud izleri ortalama sayısına karşı çizilmiştir. Bu doğrusal ilişki, daha sonra, hücre yaşı hızlı ve doğru bir saptanmasına olanak sağlamaktadır, akış sitometrisi yoluyla elde normalize WGA-sinyalden ortalama hücre yaşı belirlemek için gelecekteki deneyler aynı zorlanma ve tepkin maddeler ile kullanılabilir. Kontrol nüfus hala denemeleri arasında benzer boyama verimliliği doğrulamak için dahil edilmelidir.

Mutasyonların birikimi üzerine yaşın etkisi verimli, mutasyon oranı değerlerini elde hücreleri, sıralama ve hücre yaşları gerçekleştirilir belirlenmesi öncesinde adımlar kez ele alınabilir. Nuzaman noktalarında ıs hangi belirlenebilir frekans biyotin etiketli hücre popülasyonunun büyüklüğü ve güvenilir sonuçlar elde etmek için seçici bir ortam üzerine yayıldı gereken hücrelerin sayısına bağlıdır. Yaşla birlikte mutasyon hızı değişiklikleri, daha sonra anne hücreleri yaşlanma için gözlenen mutasyon frekansları yalnızca hücre bölünmesi ek mermi dayanan beklenen farklılık olursa. Tahmin edilen mutasyon sıklığı için gözlenen mutasyon sıklığının karşılaştırılması biriken değişim oranından yaşa bağlı farklılıklar belirleyebilir. Protokol bölüm 7'de tarif edildiği gibi, tahmin edilen frekans başlangıç ​​hücre popülasyonu için başlangıç ​​mutasyon oranı ve başlangıç ​​popülasyonu için mutasyon sıklığı eklenen ana hücrelerin replikatif yaş artış üründen elde edilebilir. CAN1 mutasyon sıklığı artışlar kromozom V normal konumda CAN1 bir suş içerisinde artan ortalama hücre yaşı gözlemlenmiştir(Şekil 6A) ve kromozom VIII (Şekil 6B) sağ kolunda CAN1 ile bir suş içerisinde. Şekil 6A anne hücreleri için gözlenen mutasyon frekansları ya da sadece tahmin altındaki frekanslarda benzer olduğundan, veri mutasyon oranının yaşa özgü değişim için herhangi bir kanıt yok. Buna karşılık, kromozom VIII CAN1 ile ana soyunun hücreleri için mutasyon frekansları tahmin frekanslar (Şekil 6B) göre daha yüksekti. Grafikteki tahmin edilen frekans nedeniyle gözlemlenen bir mutasyon sıklığı büyük bir artış için bir günlük ölçek y ekseni için kullanılacak çünkü çok arttırdığı unutmayın. Bu nedenle, Şekil 6B'de sonucu biriken mutasyonlar oranındaki bir artış yaşa özgü destekleyici kanıtlar sağlarlar. Şekil 6A ve 6B'de veri setleri için sonuçları arasındaki fark nedeniyle sorumluluk yönün olasıdır CAN1 genomik yerleri kiralamak. Gözlemler bu tür hücreler yaş olarak mutasyon oranlarını etkileyen mekanizmaları incelemek ve Replikatif yaş mutasyon birikimini açıklamak için modeller geliştirmek için hipotezler geliştirmek için bir başlangıç ​​noktası sağlar.

Şekil 1. Akış maya Replikatif yaşlanma sırasında mutasyon birikimini incelenmesi için genel yöntemin diyagramı. Siyah metin ve oklar prosedüründe önemli adımlar göstermektedir. Kavisli ok yeniden büyümesi ve aynı hücrelerin bir sıralama tur daha büyük kademeli hücreleri elde etmek için kullanılmasını gösterir. Mor oklar ve metin belirtilen ölçümler yapılır hangi adımları gösterir. Frekans - frekans.

/ upload 51850 / 51850fig2highres.jpg "width =" 400 "/>
Genç hücre popülasyonlarının mutasyon sıklığı ve hızı 2. belirlenmesi Şekil. (A), mutant kolonileri frekanslar / oranı hesaplamak için seçici bir ortam üzerine yayıldı canlı hücrelerin toplam sayısıyla karşılaştırıldığında CAN1 geninde zarar fonksiyon-mutasyonlar için seçmek ve SC-arg + kanavanin besiyerinde hücrelerin yayılma yolu ile seçildi. Biotin ile etiketlenmesinde (İP) ya da biotin ile etiketlenmesinde (PB) sonra ilk topluluklar alınan hücreler doymaya yakın 5000 hücre / ml'lik bir başlangıç ​​yoğunluğundan YPD ortamı kullanılarak büyütülmüştür. Lavanta sütun hızı ölçümleri gösterir ve mavi sütunlar belirtilen sıcaklıklarda (20 ° C ve 30 ° C) ile yapılan frekans değerleri göstermektedir. Yedi suret kültürleri takımları her deneme için büyütülmüştür ve 2-5 bağımsız deney yapıldı. Bağımsız denemeler için hesaplanan fert oranı değerleri gösterilir ve bu çalışmalar için hata çubukları% 95 güven aralıkları belirlemek temsilbir online hesap makinesi ile ²² d. Frekanslar ortalamalar ve standart sapmalar temsil eder. Kullanarak bölümü için 5-FOA üzerinde mutant kolonileri için seçimi aşağıdaki elde edilen bir kromozom VIII sağ kolunda CAN1 ile bir suşu kullanılarak. (C) Mutasyon frekansları anlatıldığı gibi (B) CAN1 mutasyon oranları elde ve temsil kromozom VIII sağ kolunda yer alan URA3 geni ile bir gerginlik. Yöntem, aksi parça A olarak, ve araç ve üç ya da dört bağımsız deneyler için standart sapmalar gösterilmektedir.

Sıralama her turdan sonra akıtılan hücrelerinin sayısını hesaplarken tarafından belirlenen verimliliği sıralama 3. Örnek Şekil. (A), biyotin etiketleme birine hazırlandıktan sonra her bir başlangıç ​​popülasyonunda hücre toplam sayısı, ve T Manyetik hücre sıralama her turdan elüt örneklerde mevcut hücre otal etiketlenebilir hücre fraksiyonu elde etmek için bu, başlangıç ​​değerleri bölündü. Toplam hücre sayısı, bir hemositometre kullanılarak, elde edilen hücre sayısı tespit edilmiştir. Turuncu sütun ortalama ve standart bir protokol izlenerek, üç bağımsız deneyler için standart sapmasını temsil eder. Mavi sütunlar hücreler hemen birincil, sonra 30 dakika boyunca 1 mM hidrojen peroksit ile muamele edildi, iki bağımsız deneme için ortalama ve standart sapmasını temsil eder. (B), boyut ve biotin ile etiketlenmesinde (post-biyotin) ve anne sonra hücreler hücrelerin morfolojisi Standart parlak bir alan mikroskobu ve 20X objektif kullanılarak gösterilen manyetik bir sıralama üçüncü turda (bir çeşit 3 anne hücreleri) sonra kurtarıldı. Geçmişlerindeki Beyaz çizgiler standart menositometrede görünür küçük kareler bağlı hatlardır.k "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Manuel tomurcuk skar sayımını kullanarak Replikatif yaş Şekil 4. belirlenmesi. Mikroskopisi 488 nm ve algılama 458/543 nm bant geçişi ile ve 505 nm uzun geçişte (uyarım bir WGA-floresan konjuge ile etiketlenmiş ayrı hücreler üzerinde tomurcuk izleri saymak için kullanılan filtre kombinasyonu). manyetik sıralama (n = 62) üçüncü turda aşağıdaki (A) (kızı hücreleri yoluyla akışı hücrelerin elle tomurcuk skar sayar). (B) akıtılan hücrelerin elle tomurcuk skar sayım (anne hücreleri) aşağıdaki Manyetik sıralama (n = 54) üçüncü tur. (C) Anne hücreleri korudu zekâ boyandıktan sonra 3X zoom ile bir 63X immersiyon yağı objektif kullanılarak fotoğraflandı manyetik bir sıralama üçüncü turu sonrasındaha WGA-floresan konjuge. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Akış sitometresi kullanılarak, tekrar eden yaşı Şekil 5. belirlenmesi. Bir WGA-floresan konjügatı ile boyanmış 10,000 hücre numuneleri, 488 nm ve saptama bir 530/30 ile bant geçiren ve 505 uzun geçirme filtresi seti de uyarma kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. (A Bir kızı hücre popülasyonu veya manyetik sıralama üç tur sonra eluatına (anne hücreleri) için spesifik WGA-floresan yoğunlukları ile hücrelerin sayıları tasvir) Histograms. Nüfus Şekil 4'te analiz karşılık gelmektedir. Mavi dikey çizgiler DAU çoğunluğu için karşılık gelen konumunu belirtmekana hücre histogram ghter hücreleri. (B) 'de gösterilen her biri bir nüfus ve hücreler üç ek popülasyon (yaş ortalaması 3.0, 6.9 ve 14.4) arasında bir floresan sinyali için normalize geometrik ortalama geometrik ortalama oranı olarak hesaplanmıştır Boyanan hücreler ve uygun boyanmamış hücre popülasyonunun geometrik ortalama. Bu değerler (ve Şekil 4, veriler gösterilmemiştir), her bir toplam nüfus için tomurcuk izleri ortalama sayısına göre çizilir. Bu karşılaştırmanın eğilim hattı için R ² değeri grafikte verilmektedir.

Şekil 2 için tarif edildiği gibi usin replikatif yaşlanma sırasında Tahmin edilen ve görülen mutasyon frekansları arasında Şekil 6. karşılaştırması. CAN1 genindeki mutasyonlar ile hücreler seçildikromozom V (A) üzerine normal bir yerde veya kromozom VIII (B) sağ kolunda CAN1 ile g suşları. Hücreler, önceden biotin ile etiketlenmesinde geçmekte ve daha sonra 20 ° C'de, 30 ° C'de bir katı ortamı üzerinde yetiştirilmiştir. Gözlemlenen frekans değerleri portakal kolonlar (Bulunan) ve kahverengi kolonlar (Ön) ile gösterilmiştir yaşlı hücreleri için öngörülen frekansları ile gösterilir. Her grafiğin için ilk sütun dört bağımsız çalışmalarda (PB) için biotin etiketleme sonra ilk mutasyon sıklığının ortalama ve standart sapma gösterir. Sütunların altında sayılar her nüfus (Cep Yaş) bud izleri ortalama sayısını gösterir. Şekil 2A (IP sütunlar) ve 2B 'de gösterilen başlangıç ​​hızı değerlerinin her birini kullanarak protokol bölüm 7'de tarif edildiği gibi bağımsız tahmin değerleri tespit edilmiştir. Bu değerler daha sonra, bağımsız ortalaması alınmıştır. Gözlenen değerler üç deneme araçlarıdır. Hata çubukları standart sapmayı belirtir.

Tartışma

Bu protokol, kaynak için birden çok yöntem ve verimli bir şekilde bir araya mitotik hücre yaşlanmada genom istikrarsızlık çalışma uygulanacak olan S. cerevisiae, Saccharomyces model sistemi kullanılabilir yaklaşımlar. Deneylerinin çok çeşitli fenotipik seçim ile genom istikrarsızlık farklı formları ölçmek için mutasyonlar ya da kromozom yeniden düzenleme biçimlerine birikimi mümkün yaşa özel değişiklikleri incelemek için manyetik sıralama ile birleştirilebilir. Bütün-genom dizileme yaklaşımlar yaş ile bir genom içinde meydana gelen değişikliklerin genel türleri hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir ederken, mutasyon hızı ölçümleri elde etmek için fenotipik seçim sistemlerini kullanmak ve tercihen genetik değişikliklerin belirli türleri izole etmek yeteneği mekanik eğitimi için önemli avantajları yaşlanma ile ilgili genom istikrarsızlık yönleri. Hücre yaş belirlenmesi ve potansiyelini düzene physiologi paralel ölçümler yapmak içinakışı ile cal değişiklikler sitometri belirli yaş aralıklarında sırasında diğer hücresel değişiklikler ile genom istikrarsızlık korelasyon etkili bir yoldur. Biriken mutasyonlar oranlarında potansiyel yaşa bağlı değişikliklerin belirlenmesi için gereken: 1) dikkatli genç hücre popülasyonlarında oranlarının belirlenmesi, hücre yaş 2) doğru belirlenmesi, ve 3) güvenilir bir şekilde ölçmek için yeniden üretilebilir ana hücrelerin yeterince büyük popülasyonlarının zenginleştirilmesi için yeteneği Yaşlılıkta genom istikrarsızlık. Bu yaklaşım, maya model sistem oranları ve / veya mitotik aktivite gösteren hücrelerde genom istikrarsızlık frekanslarında yaşa bağlı değişikliklerden sorumlu altında yatan mekanizmaların tanımlanması katkıda bulunmaya olanak sağlamaktadır. Ayrıca, genetik ve çevresel etkenler hızla yaşa bağımlı genom istikrarsızlık katkıları için değerlendirilebilir. Sonuçta, bu karakterizasyonlar mutasyonlar Replikatif yaşlanma sırasında birikir hangi şekilde hesap modellerinin gelişmesine neden olabilir.

Bu yöntem, bu tür olayların oranını ölçmek için seçilebilir fenotip görünümüyle mutasyonları ya da genom istikrarsızlık diğer tür tespit etme yeteneğine bağlıdır. Ancak, deney tasarımı yaratıcılık genom istikrarsızlık birçok yönleri incelenecek izin verebilir. Örneğin, URA3 genlerinin ve CAN1 sonuçlarına genomik konumu hakkında herhangi bir etkilerini test etmek için farklı bir genomik bölgelere yerleştirilmiş olabilir. Fonksiyonel gen allelleri özgü işlevsel olmayan gen allel Reversiyon belirli mutasyon süreçleri test edebilir. Aynı zamanda, bir gen ya da tekrar sıraları ile bir gen eteklenen çoklu aktif olmayan allel giriş sırasıyla restorasyon ya da gen fonksiyon kaybı ile rekombinasyon olayları incelemek için kullanılabilir. Dalgalanma testleri bu çeşitli genom istikrarsızlık olayları ⁹ oranlarını belirlemek için standart yaklaşım vardır. Protokol muta belirlemek için iyi kabul ve nispeten basit Lea-Coulson medyan tahmincisi kullanılarak yazılıryon oranı MSS-maksimum olabilirlik tahmin yöntemi mutasyon oranları ⁹ belirlemek için en iyi yaklaşım olarak kabul edilir olsa da, farklı araştırmacılar için daha erişilebilir hale getirmek için. MSS-maksimum olabilirlik tahmincisi önce detaylı ⁹ gözden geçirilmiştir ve alternatif bir yöntem olarak kullanılabilir, ancak daha sofistike hesaplamalar gerektirir. Alternatif olarak, bu yöntem ile mutasyon oranlarını hesaplamak için ücretsiz yazılım ²² elde edilmiştir. Mutasyon oranları tekrarlanabilir tedbirleri alması, yeterli suret kültürleri kullanılarak yeterince düşük başlangıç ​​hücre yoğunluklarında kültürleri aşılamak dahil deneysel tasarım, birkaç yönlerine dikkat gerektirdiğini 10.000 kat veya daha fazla, ve seçilmesinin uygun kültür hacimleri ile nüfus büyüklüğü artar tüm böylece hücre popülasyonları seçici ortam üzerine yayılır. İkinci nokta için, daha önce tarif edilen formül kültür teste fraksiyonuna dayanan mutasyon oranını ayarlamak için kullanılabilend ^9. Kültürlerin büyüme oranında varyasyon tekrarlanabilir bir mutasyon oranı belirlenmesi ve son zamanlarda ²³ tarif edilmiştir böyle durumlarda daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar doğurabilir değiştirilmiş medyan tabanlı tahmincisi karmaşık hale getirebilir.

Doğru hücre yaşı ölçmek için yeteneği eski hücrelerin genomu dengesizlik nedeniyle genç hücrelere Frekanslar olayların oranı beklenen değerlerle farklı olup olmadığı kurulması için önemli olan diğer bir faktördür. WGA farklı floresan moleküllerine konjuge kullanılabilir beri, arka plan ve esneklik açısından hem de beyaz lekeleme Kalkofluor kıyasla tercih edilir olarak WGA, lekeleme bulduk. Bu esneklik floresan reaktif ile diğer hücre özelliklerinin ölçümleri için daha fazla fırsat sağlayabilir. Ilk iş sonra daha fazla yol açabilir sinyal WGA boyama için yoğunluğu ve hücrelerin tomurcuk izleri tekabül sayısı arasında bir ilişki kurmak içinakış sitometrisi yoluyla hücre yaşı hızlı belirlenmesi. Bu yaklaşım, aynı zamanda, tipik olarak ölçümlerin daha iyi bir reprodüksiyon için mikroskopla incelenmiş göre daha büyük nüfus büyüklüklerinin kullanımına izin vermektedir. Tüm yaş tayinleri hücrelerin mikroskobik muayene ile yapılabilir olabilir iken, biz yaklaşımı sitometri akış yaşa bağlı genom istikrarsızlık etkileyen faktörlerin hızlı tarama kolaylaştırır hissediyorum.

Güvenilir bir hücre yaşı ölçülmesine ek olarak, değerlendirme ana hücre büyümesi ve hücre sıralama her bir ardışık yuvarlak geçmesi için izin verilen hücre bölünmesini sayısına dikkat etmek gerekmektedir. Hücreleri istenen hücre yoğunluğu ulaşmadan önce daha fazla hücre bölünmesi geçmesi olanak sağlayan bir küçük başlangıç ​​popülasyon boyutu ya da daha büyük bir kültür hacminin kullanın. Örneğin, diğer araştırmacılar daha az experime eski hücrelerini elde bariz bir avantaja sahiptir çok eski maya hücreleri ^16, elde etmek için sıralama sadece iki mermi kullanmışntal adım. Hücreler sıralama öncesinde daha fazla hücre bölünmeleri tamamlamak için izin kültür hacmini artırmak olmadığını düşünürken, aklında tek bir sütunda işlenebilir hücrelerinin toplam sayısı sınırı tutmak. Bir hücre popülasyonu sıralamak için birden çok sütun kullanılmasını gerektirebilen daha büyük bir kültür hacminin kullanın. Hücre çeşitleri / toplama noktaları arasındaki hücre bölünmesinin az mermi geçmesi Ayrıca, eğer, daha sonra ömrü boyunca farklı zaman noktalarında beklenen mutasyon frekansları sapmaları gözlemlemek için daha fazla fırsat vardır. Örneğin, ömrü boyunca sadece erken örnekleme ve geç zaman noktalarında veri mutasyon sıklığı sürekli bir artış gösteren, ama çabuk ve daha sonra yaylalar bu mutasyon sıklığı artar gösterebilir ömrü boyunca ek ara zamanlarda örnekleme üretebilir. Bu protokol yaşlı anne hücreleri izolatları Ancak, yaşla birlikte mutasyon oranlarındaki değişimlerin daha doğrudan bir ölçümünü elde etmek için bir fırsat var. Dalgalanma testleri olabilir be mutasyon oranı, genç hücreler kullanılarak elde edilen orandan farklı olup olmadığını belirlemek için farklı yaşlarda annesi hücreleri kullanılarak gerçekleştirildi. Büyüdükçe bu dalgalanmaları deney kültürleri yaşlı ve genç hücrelerin bir karışımı olacak olsa da, genç hücreler ile başlanarak elde oranlarından herhangi bir sapma eski bir başlangıç ​​popülasyonunun kullanımı ile bağlanabilir.

Tekrarlanabilir doğru genom istikrarsızlık ölçmek için yaşlı anne hücreleri yeterince büyük bir nüfus elde etmek için yeteneği, bu yaklaşımın başarısı için kritik öneme sahiptir. Protokol, bu amaç için özel bir manyetik ayırma sisteminin kullanımını tarif etmekle beraber, başka gruplar da alternatif sistemler ^14,18 (Malzeme Tabloya bakınız) maya hücreleri ana kriteri var. Üreticilerin bazı protokoller optimizasyon gerekli olabilir ama böyle bir alternatif sistemleri de, bu yöntem ile çalışması gerekir. Ne olursa olsun kullanılan özel sistem, nüfus büyüklüğü gerektirirÇalışma için seçilen bir mutasyon ya da genom yeniden düzenleme tipinin frekansına bağlı olarak d farklıdır. En azından, yeterli ana hücreler, mutasyon frekansı hesaplamak için kişi başına en azından bir mutant koloni elde etmek için olmalıdır. Sadece sıfır ila beş koloni, mutant nüfusta ve popülasyon boyutu daha küçük bir artış beklenmektedir eğer 5-10 mutan koloniler tahmin edilen, büyük ölçüde tekrarlanabilirliği artırabilir böylece uygulamada, sonuçlar oldukça değişken olabilir. Biotin bir başlangıç ​​nüfusu etiketleme, her tür için kurtarma verimlilik yaşındaki annesi hücrelerde mutasyon frekansını ölçmek için gerekli uygun nüfus büyüklüğü belirlemenize yardımcı olmak için dikkate alınması gerekiyor. Her sıralama sonra ana hücrelerinde% 90 iyileşme ile, orijinal nüfusun sadece% 59 büyüme ve sıralama beş tur sonra kurtarıldı olacaktır. Bu ~% 33 büyüme beş turdan sonra asıl nüfusun geri kazanımı ve etiketli anne hücrelerin sadece% 80'i geri eğer sıralama düşerHer çeşit sırasında ed. Nüfus büyüklüğü iki üç kat azalma kolayca nüfus başına mutant kolonilerin güvenilmez numaraları neden olabilir, çünkü düşük frekanslı olayları ölçerken Ölçme ve kurtarma maksimize önemlidir.

Genişletilmesi veya mitotik hücre yaşlanma sırasında genom istikrarsızlık daha geniş bir anlayış elde etmek için bu protokolü değiştirerek için çok sayıda seçenek vardır. Basit örnekler gen fonksiyonlarının, ortam değişiklikleri veya diğer çevresel durumu değişiklikleri değişiklikler yaşla birlikte mutasyonların birikimi nasıl değiştirdiğini analiz içerir. Değiştirilmiş gen fonksiyonu ile veya uygun durumda, genç hücreler için Mutasyon oranı ölçülmüş ve kontrol hücre popülasyonlarında daha farklı hızı değerleri ile tahmin ve daha farklı mutasyonların birikmesine olup olmadığını belirlemek için kullanılacaktır. Replikatif yaşlanma sırasında farklı noktalarda Hücre popülasyonları, reaktif oksijen türleri veya DNA hasar verme ajanları gibi özel baskı uygulayıcılar maruz olabilir. Biroksidatif strese geçici ve hafif maruziyet esasen hücre sıralama (Şekil 3) gerçekleştirme yeteneğini değiştirmek değil, ama sert gerilmeler hücrelerin iyileşmesini komplike edebilir. Ön deneyler anne hücreleri hala belirli stresleri sonra bir şekilde geri doğrulamak için gerekli olacaktır. Ayrıca, izole anne hücrelerinin hücresel özellikleri ³ yaşlanma ile ilişkili reaktif oksijen türlerinin, mitokondriyal ve vakuolar morfolojisi ve diğer fizyolojik özelliklerinin düzeyleri dahil olmak üzere, ayrıntılı olarak analiz edilebilir. Ayrıca ana hücreleri bir tedavi ya da bir işlem için bir başlangıç ​​popülasyonu olabilir. Anne ve kızı hücreleri fiziksel işlem sırasında ayrılır yana, kızı hücreleri yine de analiz için mevcuttur. Örneğin, çocuk hücrelere veya maya anne ve ikincil hücreler arasında hasarlı makro moleküllerin asimetrik miras fizyolojik değişiklikleri 24 mutasyon frekansları / oranlarında herhangi bir ilginç değişiklikler zamanlamasına göre olabilir kadar. Kızı hücre popülasyonlarının mutasyon frekansları da Replikatif yaşlanma sırasında mutasyonların asimetrik miras olup olmadığını modellemek için denemek için elde edilebilir. Özet olarak, dalgalanma testleri ile manyetik hücre sıralama yoluyla ana hücrelerin zenginleştirilmesi birleştiren S. avantajlarını mümkün kılmaktadır cerevisiae model sistem verimli mitotik hücre yaşlanma sırasında genetik değişikliklerin birikimi sorumlu mekanizmaların araştırılması için uygulanacak.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335	100 mg
Anti-Biotin Mikroboncuklar	Miltenyi Biotec	130-090-485	Monoklonal fare anti-biyotin antikorlarına konjuge 2 ml Mikro Boncuklar (izotip: fare IgG1)
MACS LS sütunları	Miltenyi Biotec	130-042-401	QuadroMACS ayırıcı için uygun 25 sütun
QuadroMACS ayırıcı	Miltenyi Biotec	130-090-976	Yalnızca Ayırıcı
QuadroMACS Başlangıç Kiti	Miltenyi Biotec	130-091-051	İçindekiler: QuadroMACS Ayırıcı (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Sütunları (130-042-401), MACS 15 ml Tüp Rafı (130-091-052), Bir adet 2 ml MACS Mikro Boncuk. Not: Alternatif sistemler arasında Dynabeads Biotin Binder ve MagnaBind Manyetik Boncuklar
BD Falcon Hücre Süzgeci, 40 & m	BD Biosciences	352340	40 & BD Falcon 50 ml Konik Tüpler ile kullanım için m. Paket başına 50
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T6146	Tozu, çözüldükten sonra filtreleme partikülleri gidermek için önemlidir
Buğday tohumu aglütininin Alexa Fluor488	Yaşam Teknolojileri	W11261	Farklı uyarma/emisyon spektrumlarına sahip konjugatlar da kullanılabilir
ProLong Gold antifade reaktifi	Life Technologies	P36930	10 ml, diğer antifade reaktifleri de kullanılabilir