Kalp kapakçığı endotel hücrelerini (VEC'ler) izole etme yeteneği, kapak gelişimi, bakımı ve hastalık mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir. Burada, VEC'lerin gelişimsel ve hastalık süreçlerine katkısını belirleyen çalışmalara izin verecek FACS kullanarak embriyonik ve yetişkin Tie2-GFP farelerinden VEC'lerin izolasyonunu açıklıyoruz.
Yöntem makalesi
Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon
Bu makalede
Özet
Özet
Normal kapak yapıları, kapak interstisyel hücreleri (VIC'ler) ile serpiştirilmiş ve tek katmanlı kapak endotel hücreleri (VEC'ler) ile çevrili tabakalı özel hücre dışı matris (ECM) katmanlarından oluşur. Mesleki eğitim (DEB), embriyonik gelişim sırasında kapak yapılarının oluşturulmasında önemli roller oynar ve yaşam boyu kapak bütünlüğünü ve işlevini korumak için önemlidir. Sağlıklı kapak yaprakçıklarının yüzeyi üzerinde sürekli bir endotelin aksine, VEC bozulması genellikle arızalı valflerde gözlenir ve kapak hastalığını ve disfonksiyonunu teşvik eden patolojik süreçlerle ilişkilidir. Klinik önemine rağmen, VEC'lerin gelişim ve hastalık süreçlerine katkısını belirleyen odaklanmış çalışmalar sınırlıdır. VEC'lerin hayvan modellerinden izole edilmesi, hücreye özgü deneylere izin verecektir. VEC'ler büyük hayvan yetişkin modellerinden izole edilmiştir, ancak küçük popülasyon boyutları, kırılganlıkları ve spesifik belirteçlerin eksikliği nedeniyle, embriyolarda veya yetişkin küçük hayvan modellerinde VEC izolasyonu bildirilmemiştir. Burada, embriyonik ve yetişkin aşamalarında farelerden VEC'lerin doğrudan izolasyonuna izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Tüm endotel hücrelerini Yeşil Floresan Protein (GFP) ile etiketleyen Tie2-GFP raportör modelini kullanarak, floresan aktif hücre sıralaması (FACS) kullanarak GFP pozitif (ve negatif) hücreleri semilunar ve atriyoventriküler kapak bölgelerinden izole etmede başarılı olduk. İzole GFP pozitif VEC'ler, CD31 ve von Willebrand Faktörü (vWF) dahil olmak üzere endotel belirteçleri için zenginleştirilir ve kültürlendiğinde endotel hücre ekspresyonunu korur; GFP-negatif hücreler ise VIC fenotipleri ile uyumlu moleküler profiller ve hücre şekilleri sergiler. Embriyonik ve yetişkin murin DEH'lerini izole etme yeteneği, daha önce elde edilemeyen moleküler ve fonksiyonel çalışmaların belirli bir kapak hücresi popülasyonu üzerinde yürütülmesine olanak tanır ve bu da kapak gelişimi ve hastalık mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde geliştirecektir.
Giriş
Olgun kapak vana endotel hücrelerinin (VECs) 1, tek bir tabaka ile özel bir hücre dışı bir valf interstitial hücrelerin (kurban) serpiştirilmiş matriks (ECM) ile kapsüllenmiş üç katmanlı tabakadan oluşur. ECM rolü kalp döngüsü boyunca hemodinamik yürürlükteki sürekli değişir dayanmak için bütün gerekli biyomekanik özellikleri temin etmektir. Yetişkin vana supap ECM'nin devir sıkıca büyük ölçüde hareketsiz ve hastalık yokluğunda fibroblast gibi kurban düzenlenir. VIC nüfus ek olarak, kalp kapakçığı endotel hücreleri (VECs) vana çizgilerinin 2'nin yüzeyi üzerinde kesintisiz bir endotelyumu oluşturur. Kapak yapısı ve fonksiyonu için ECM ve kurban önemi bizim ve başkaları tarafından tarif edilmiş olmasına rağmen, VECs rolü daha az iyi bilinmektedir. Ancak bu nispeten küçük hücre popülasyonu embriyo kapak oluşumu için çok önemli olan ve valf içindeki işlevsel olarak tanımlanmaktadırhastalığı.
Atriyoventriküler kanal ve çıkış yolu bölgeler içinde endotel hücrelerinin bir alt mezenkimal dönüşüm (EMT) ve endokardial minderler 1,3 şekli olarak bilinen şişlikler için endotelyal uğradıklannda embriyo kalp kapak oluşumu başlar. Bu yapıların içindeki yeni dönüştürülmüş mezenkimal hücreler, daha sonra kurbanlardan farklılaşmak ve olgun vanaları oluştururlar. EMT tamamlandıktan sonra, yastıklar çevreleyen endotel hücreleri, VECs olarak adlandırılan yaralanmalara karşı koruma valfını olgun kesintisiz bir endotel hücre tabakasını oluşturur. Buna ek olarak, VECs hemodinamik çevre anlamda ECM 1,3 homeostazı düzenlemek için altta yatan kurban ile iletişim kurmak için, moleküler gösterilmiştir. Hasta kapaklarda, VEC tek tabaka ECM organizasyon anormal değişiklikler ve değişmiş biyomekanikteki 4,5 ile birlikte bozulur. Buna ek olarak, fare modelinde yapılan çalışmalar, VEC disfonksiyon kapak d altta yatan nedeni olduğunu göstermektedirhastalığı bulunanlarda 1,6-9. VECs vana geliştirme, bakım, hastalık ve önemli bir rol oynadığı gibi, biz tamamen alanını ilerletmek ve hastalık mekanizmalarını anlamak için kendi zamansal fenotipleri tanımlamak önemlidir.
Birkaç laboratuarları önceki çalışması başarıyla domuz ve koyun modelleri 10-12 VECs izole edilmiştir. Bu sebeplerden dolayı valf büyük boyutları nedeniyle, manyetik tane hücre ayrıştırma ve tek bir hücre klonal olarak saf popülasyonları 11-13 oluşturmak için etkili olmuştur izolasyon dahil olmak üzere farklı bir dizi yöntem ile, ardından, sürme ve / veya enzimatik sindirim yoluyla sağlayan tecritler uygulanmıştır. Ancak, bu modeller sayesinde yüksek maliyetlerine ek olarak moleküler araçlarının kullanılabilirliğini sınırlayan domuz ve koyun genomların eksik açıklama için kısıtlayıcı olabilir. Bu nedenle izolasyon sonra domuz ve küçükbaş VECs bir deney kısıtlayıcı olabilir. Fare modelleri nedeniyle genetik manipü için birçok olasılığa tercih ediliryon embriyonun ve yetişkin moleküler araçları, ancak bugüne kadar küçük hayvan modellerinde herhangi bir izolasyon VEC bildirilmiştir. Bu durum şu anda böylece antikor bazlı izolasyon yöntemleri önlenmesi, VEC-spesifik belirteçler benzersiz kimliğini yoksun bir azınlık hücre popülasyonu içeren küçük doku örnekleri ile çalışma zorluk muhtemeldir.
Bu makalede, embriyonik ve yetişkin aşamalarında sıçangil VECs direkt izolasyonu için yeni bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokol, her endotel hücre tiplerinde ekspres GFP ve kapsamlı bir endotel hücre popülasyonlarının 14 incelemek için kullanılmıştır Tie2-GFP farelerden, yararlanır. Bununla birlikte, bu çalışmada bir yenilik, ilk kez bu fareler, vanalardan endotel hücreleri izole etmek için kullanılmıştır olmasıdır. Kapak dokusu ve FACS ayıklama, ardından dokuz enzimatik sindirim, bir dizi dikkatli diseksiyon ile, VECs izole edilebilir ve çeşitli deneysel teknikler kullanılmaktadırdoğrudan sıralama aşağıdaki RNA ekstraksiyon ve kültürünü tutabilir.
Protokol
Ekipman ve Çözümleri 1. Hazırlık
- Diseksiyon aletleri sterilize - otoklav ile kapalı bir alet tepsisine - kapak bölgenin diseksiyonu için yetişkin kalpleri ve 2 ince forseps ayıklamak için ince doku makas. % 70 etanol (EtOH) diseksiyon önce araçları ile birlikte püskürtün.
- Hemen önce deney için her çözelti hazırlayın ve steril bir 0.2 um filtreden geçirilerek sterilize çözümler. Kullanılıncaya kadar buz üzerinde çözümler tutun.
- Steril Ayrılma Tampon (15 ml toplam / numune). 1.2 mi kollajenaz IV, 300 ul% 2.5 tripsin ve 150 ul serum civciv birleştirin. Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile 15 ml hacim getirin.
- Steril Sıralama Tamponu (12 ml toplam) hazırlandı. 25 ul 0.5 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ve 12 ul DNase I birleştirin (Rnase-serbest). HBSS ile 12 ml hacmi kadar getir.
- VEC Kültür Medya. Mix endotel GroEBM2 ortam 500 ml kitinden parçalara ayrılır bileşenlerin eklenmesiyle, üreticinin talimatlarına (malzeme-tabloyu bakın) göre ortam wth.
- GFP Negatif Kültür Medya (non-endotelyal hücre medya). Penisilin / streptomisin (pen / strep), 5 ml (% 1 son konsantrasyon) ve 50 mi FBS (% 10 nihai konsantrasyon) ile Medium 199 1x 445 ml karıştırın.
Yetişkin farelerde ve E14.5 embriyolar Kapak Bölge 2. Diseksiyon
- Tüm hayvan prosedürleri onaylanmış ve Nationwide Çocuk Hastanesi Araştırma Enstitüsü IACUC kurallarına uygun olarak yapıldı.
- Tie2 GFP fareleri, Jackson Laboratories'den (stok no 003658) 14 'den satın alınmıştır ve FVB / N background homozigoz genotip olarak muhafaza edildi ve bu nedenle bu sağlanması Tie2 pozitif endotel hücreleri tüm dışı yay ifade GFP.
- FACS sıralama için, bir yaş eşleştirilmiş negatif samp hazırlamakBöyle C57 / BL6 olarak GFP içermiyor le FACS sıralama için GFP kapısı parametrelerini ayarlamak için. NOT: Bu protokol ve temsili sonuçları üç, dört aylık yetişkin fareler veya embriyonik gün (E) 14.5 bir çöp kullanarak dayanmaktadır.
- Yetişkin Fareler: CO 2 anoksi hemen aşağıdaki fedakarlık, hafifçe göğüs boşluğu açmak ve kalp ve akciğerler maruz diseksiyon makas kullanın. Büyük arterlerde, kavrama forseps ile kalp maruz kalan ve vücudun uzak çekin sonra. Bozulmamış ise akciğer dokusu çıkarın ve soğuk HBSS'de yer kalpler durulayın. Ventrikül çıkarın ve bozulmamış atriyoventriküler kanal 'halka' ve aort bölgeleri terk Atriumlarm uzak çekin. 'Halka' açmak ve kapak yapıları ortaya çıkarmak için atriyoventriküler kanal tarafında aşağı bir kesi yapmak. Forseps ile yavaşça uzak alay tarafından miyokardiyumu ve proksimal aort bölgeleri çıkarın. Pembe miyokardiyumda üzerinde beyaz, yoğun doku gibi valf broşürler tanımlayın. Yavaşça detaatriyoventriküler valflerden korda tendinae ch ve mümkün olduğu kadar geriye kalan miyokardın kadar çıkarın. Çekin veya VECs yerinden olabilir beri bu işlem sırasında vana broşürler kazımak değil dikkatli olun. 1 ml HBSS içeren 1.5 ml Eppendorf tüpüne kesilmiş kapak bölgeleri koyun ve buz üzerinde tutmak. NOT: Dikkatli diseksiyon örneği kontamine olabilir non-valvüler endotel hücreleri ortadan kaldırmak için çok önemlidir.
- Embriyolar: çiftleşme fiş görülmektedir 14.0 gün sonra dişi farelerin (çiftleşme fiş = 0.5 gün arasında sabah) Kurban.
- Hemen kurban takip, rahim (embriyoları içeren) incelemek ve soğuk HBSS'de yıkayın. Rahim bireysel embriyolar parçalara ayır ve her embriyoyu çevreleyen embriyonik sarısı kesesi kaldırmak. Embriyoların her birinden kalpleri çıkarın ve 2.1 adım takip. (NOT: yavaşça kalp maruz ve çıkarma işlemini kolaylaştırmak için yardımcı olmalıdır, sadece üst uzantıların altında forseps ile embriyo sıkma.)
- Steril bir pipet uçları kullanılarak, kapak bölümleri ihtiva eden Eppendorf tüp HBSS çıkarın.
- 1 ml ayrışma tamponu ve 4 ul DNase ile değiştirin
- , 7 dakika boyunca 37 ° C'de tüpler döndürün.
- Pipet yukarı ve 3 kez aşağı ve sonra örnek 15 sn razı. 15 ml konik tüp içine (ayrışmış hücreleri içeren) süpernatant toplayın.
- , Kollajenaz tepkimeyi durdurmak toplama tüpüne at serumu 125 ul ekleyin. Buz üzerinde toplama tüp tutun.
- Tekrar ayrışma adım (3,2-3,5) dokuz kez yüzer dokuz fraksiyonlarını toplamak.
- Artık ve yığınlarını kaldırarak tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için yeni bir toplama tüpüne 70 mikron naylon filtre yolu ile fraksiyone toplama geçirin.
- 5 dk hücrelerini pellet haline getirmek için 400 g süspansiyon Spin.
- 1 mi Sıralama Tamponu içinde ve hücre pelletiniFACS kadar buz üzerinde tutmak.
GFP pozitif VECs Sınıflandırma 4. FACS
- Enkaz dışlamak ve tek hücreleri yakalamak için ileri ve yan dağılım için kapıları ayarlamak; çiftli ayrımcılık kapılamayı kullanarak ikilileri hariç. Negatif kontrol örneği kaydedin ve Tıe2-GFP örnekteki GFP pozitif hücre nüfus karşılaştırmak ve doğru tanımlamak için kapı ayarları tanımlayın.
- FACS üzerinden GFP pozitif hücrelerin analiz ve kapı ayarları rafine.
- Sıralama Tie2 GFP numunesi ve hem de GFP-pozitif ve GFP-negatif hücreleri toplamak. Hücreler doğrudan sıralama Sıralama tamponuna RNA ekstraksiyonu için kullanılacak ise. FACS sonra kültür hücreleri, 1 ml FBS ile 1 ml VEC ortam ihtiva eden bir steril tüp içinde, GFP-pozitif hücrelerin toplanması, ve 1 ml FBS olmayan endotel 1 ml'lik ortam GFP negatif hücreleri toplamak. Hücre canlılığı artırmak için bu% 50 medya / 50% serum kombinasyonunu kullanın. Sonrası FACS analizi kadar buz üzerinde tutun.
5. Mesaj FACS verenins
- RNA Ekstraksiyonu:
- Hemen 8 dakika boyunca 1.500 xg'de FACS, santrifüj GFP pozitif ve negatif hücrelerin takip.
- Dikkatlice süpernatant (sıralama tampon) pipet ve atın.
- 200 ul TRIzol (pelet burada önerilen numune boyutları için görünür değildir) hücre pelletini.
- -80 ° C'de dondurmak ya da daha önce laboratuarımızda 15 tarafından tarif edildiği gibi, mRNA'nın izole edilmesi için standart bir fenol-kloroform ekstraksiyonu başlar.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak kullanılarak, cDNA sentezi Mastermix için RNA 50-200 ng kullanın.
- Fare endotel hücre belirteçleri (CD31, von Willebrand Faktör (vWF)), valf interstisyel hücre belirteçleri (α-düz kas aktin (α-SMA), periostin (POSTN)) karşı IDT Primetime QPCR sondaları kullanılarak kantitatif PCR amplifikasyonu, miyositlerdeki Konu cDNA belirleyicileri (Mhc6, Mhc7) ve GAPDH.
- Murin VEC Kültürleme:
- FACS sıralama ve hücre toplama (adım 4.3), 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj sonrasında, hücreler.
- Dikkatlice süpernatant (sıralama tampon + medya) pipetle ve atın.
- VEC ortam 1 ml GFP-pozitif hücre peleti 1 ml ve endotel dışı ortam GFP-negatif pelletini.
- Plastik slaytı bir kuyuda her numune Plaka ve birleşene kadar büyür. GFP negatif hücre için yaklaşık 1 hafta boyunca kültür konfluent hale gelmeye ve GFP pozitif hücreler için 2 haftadan daha uzun (3 bir örnek, yetişkin farelerden) konfluent hale gelmeye. Her iki gün medya değiştirin.
- Immunofluorescent Boyama:
- Hücrelerden Ortamı çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) sabitleyin. Fosfat Tamponlu Tuz çözeltisi içinde 5 dakika her biri (PBS) ile sabit hücreler üç kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 bovin serum albümini / 1x PBS içinde ileri-geri ve blok oda kuyu çıkarın.
- Inkübe(: 1000 ya da α-düz kas aktin (α-SMA), 1: 100, CD31, 1) primer antikorlar ile 4 ° C'de slaytlar göre O / N. PBS içinde 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
- , 400 PBS slaytlara ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin: ikincil antikoru (Alexa Fluor 568 keçi anti-fare) 1. seyreltin. Durulama slaytlar PBS içinde 5 dakika boyunca 3 x.
- Vectashield içeren DAPI'nin Dağı ve önceki görüntüleme için 4 ° C'de 1 saat inkübe.
Sonuçlar
Tie2-GFP hücreler embriyonik ve yetişkin kalp kapakçıkları endotel hücre belirteçleri ile birlikte lokalize.
Embriyonik ve yetişkin farelerden VECs olarak Tie2-GFP özgünlüğünü teyit etmek üzere, imüno-E14.5 ve 3 aylık yetişkin Tie2-GFP hazırlanabilir doku kesitlerinde in endotel hücre markeri ile birlikte-lokalizasyonunu, CD31 belirlemek için yapılmıştır yöntemleri kullanarak farenin önce laboratuarımızda 16 tarafından yayınlandı. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, eş-ifade VECs GFP (Şekil 1 A, B, E, F) hem de yetişkin ve CD31 (C, D, E, F, Şekil 1) (Şekil 1 B, D, F) ve embriyonik ( Bu nedenle takip eden VEC izolasyonu için bir model doğrulama Şekil 1 A, C, E) aşamaları,.
FACS analizi Tie2-GFP farelerden izole embriyonik ve yetişkin kalp kapakçıkları belirgin GFP pozitif ve GFP-negatif hücre popülasyonları tespit.
Vahşi tile tipi C57 / BL6 farenin GFP parametrelerini ayarlamak için kullanılır ve Tie2 GFP farelerden tek kapılanmış hücrelerin yaklaşık olarak% 2 (Şekil 2), embriyonik ve yetişkin örneklerinde hem de FACS analizi ile, GFP-pozitif hücrelerindeki zenginleştirme göstermektedir. Şekil 1 'de gösterilen ko-lokalizasyon çalışmaları dayalı olarak, bu hücreler, VECs olarak kabul edilir ve 61.800 toplam hücrelerin ortalama verim erişkin numuneler (n = 3) ve 8928 hücreleri (8,015- (Örnekler 39,000-77,000 hücre / örnek civarında olmak üzere) 11.000 hücreleri E14.5 embriyoların bir aileden gelen / çöp).
PCR analizi, Tie2, GFP farelerden izole edilen GFP-negatif hücrelerinde GFP-pozitif hücrelerin ve valf interstisyel hücre markörleri endotel hücresi belirleyicilerinin zenginleştirme doğrulamaktadır.
QPCR şu FACS GFP pozitif ve negatif hücre popülasyonlarının gen ekspresyon analizleri farklı moleküler profillerini göstermektedir. Tie2-GFP embriyolar ve Adul izole GFP negatif hücre popülasyonları ile karşılaştırıldığındats GFP pozitif hücreler, endotelyal hücre işaretleyicileri CD31 ve vWF, (Şekil 3) ifadesi için zenginleştirilmiştir. Bundan başka, bu hücre popülasyonunda miyosit belirteçleri (Myh6, MYH7) ekspresyonu olmayan endotel hücrelerinin az kirlenme gösteren, çok düşüktür. Buna karşılık olarak, yetişkin Tie2-GFP farelerden ve E14.5 embriyolardan izole GFP negatif hücrelerin valf interstisyel hücreli (VIC) 'belirteçleri, GFP'ye α-sma ve periostin (POSTN) nispeten pozitif hücreler açısından zenginleştirilmiş olan. Bu işaretlerin zenginleştirilmesi bağlı olarak yetişkin kurban durgun fenotipi ve aktif belirteçler bu nedenle de düşük ekspresyonu için, yetişkinler ile karşılaştırıldığında E14.5 örneklerden izole GFP negatif hücrelerde daha yüksektir.
Tie2 GFP erişkin farelerden izole edilen GFP-pozitif hücreler, in vitro kültür edilebilir.
Anahtar örneklerinden izole kültür GFP pozitif ve GFP negatif hücrelerin yeteneği, taban incelendihücre morfolojisi ve immünohistokimyasal boyama üzerinde d. Daha önce GFP pozitif hücreler, iki hafta kültür içinde (Şekil 4C) sonra endotel hücre işaretleyici CD31 ile morfolojisi (Şekil 4A) olarak yuvarlak ve birlikte-ifade GFP ortaya çıktığı Şekil 4'te gösterilir bize 17 tarafından tarif edilmiş protokolleri kullanılarak. Bunun aksine olmayan endotel hücreleri dokuz gün (Şekil 4D) sonra VIC işaretleyici α-SMA mezenkimal benzeri morfoloji gösterir (Şekil 4B) ve görüntülemek ifade GFP için negatiftir.
Şekil 1. Tie2-GFP pozitif hücreler, embriyonik ve yetişkin kalp kapakçıklarında CD31 ile ko-lokalize. Immünofloresan endotelyal hücre belirteci ile (Tie2-) GFP tanımının ilişki (A, B) göstermek üzere, CD31 (C, D) olarak larE14.5 (A, C, E) ve yetişkin de mitral kapak eptal bildiriler (B, D, F) aşamaları. Vana bölgesinde A vurgulanır, C, E. (E, F) Birleştirilmiş'i görüntüleri. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Tie2-GFP pozitif VECs FACS ile tespit edilebilir. Yaşa göre eşleştirilmiş C57 / BL6 kontroller (A, C) ile karşılaştırıldığında, Tie2 GFP embriyolar (B) ve yetişkin (D) 'den izole edilen valfler içeren ayrı bir GFP Yeşil gösterildiği gibi pozitif bir hücre popülasyonu. Kırmızı gösterilen GFP-negatif olaylar, bir kontrol olarak toplanmıştır. (B) ve (D) 'de sayılar GFP p ortalama% göstermektedirFACS sıralama kriteri olayların toplam sayıdan ositive hücreleri (n = 3). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
GFP-negatif hücreler valf interstitial hücrelerin ile ilişkide bulunan genleri ifade ise Şekil 3. GFP pozitif hücreler endotel hücre işaretleyicileri için zenginleştirilmiştir. Endotel hücre işaretleyicileri (CD31, Von Willebrand Faktörü (vWF) ile birleşmesi) ve yetişkin (Myh6) ve fetal Temsilcisi QPCR ( MYH7) E14.5 (A) ve yetişkin (B kapak bölgelerinden elde edilmiş olan GFP-pozitif hücrelerindeki miyosit işaretleri) Tie2-GFP uygulanan farelerden. Endotel hücre belirteçleri ve miyositlerdeki ilişkili genlerin çok düşük düzeylerde Not zenginleştirme. (C, D) cha Foldvana interstisyel hücre belirteçlerinin ifadesinde nges α-SMA E14.5 (C) ve yetişkin (D) Tıe2-GFP farelerden izole GFP-negatif hücrelerin ve POSTN. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Tie2-GFP pozitif hücreler, in vitro endotel hücresi belirleyicilerinin sentezlemenin muhafaza edilmesi. Ardından FACS, GFP pozitif (A, C) ve negatif (B, D) görüntüleme kontrast faz akışa kadar kültürlendi ve Denekler, erişkin farelerden hücre popülasyonları (A, B) ve floresan immüno-(C, D). GFP-pozitif hücreler CD31 sonra (kırmızı) (C) ekspreseKültür 10 gün. Bunun tersine GFP ifade α-SMA, aktive kurban (D) bir marker için pozitif boyandı, negatif hücre popülasyonu, bulgulanmamıştır.
Tartışma
Burada ilk kez tarif Tie2-GFP farelerden elde edilen murin embriyonik ve yetişkin VECs izolasyonu için yeni bir yöntem. Bu fare hattı yaygın endotel hücre popülasyonlarının izolasyonu için kullanılmış olsa da, bu VECs seçici izolasyonu gösteren ilk rapordur. Nedeniyle VEC nüfusun kırılganlığı, embriyonik ve yetişkin farelerin kalp kapakçıkları olumlu GFP (ve GFP negatif) hücrelerin tek hücre izolasyonu sağlayan bir sıkı protokol geliştirdik. Tie2-GFP farelerden alınan bütün 14 embriyolar ya da organları kullanarak orijinal yayın karşılaştırıldığında, hücrelerin seçilmiş bir popülasyonu izole etmek üzere, bu kırılgan endotel hücre popülasyonunun düşük yoğunlukta göre kolajenaz ve kesilmesi adımlarını optimize ettik.
VEC izolasyon önce sadece sınırlı bir genetik ve biyomoleküler araçları ile büyük hayvan modellerinde bildirilmiştir. Bu araçlar iyi, bu nedenle abi farelerde kurulmuş ve kendilerinesıçangil VECs izole edilmesi için vasıflı kapak araştırma için kullanılacak deney tasarımları genişletilmiş bir dizi sağlar. Bu nedenle, bu yaklaşımın önemli bir avantajı, VECs Vahşi tip farelerde ve kapak hastalığı ve yaralanma modellerinin geçici olarak izole edilebilir olmasıdır. İkinci bir avantaj VECs izole edilmiş ve daha kesin bir şekilde, in vivo durumu yansıtan ekspresyonu koruyarak, diseksiyon hemen sonra analiz edilebilmesidir. Bundan başka, bu yalıtım protokol numarası genişlemesi ve in vitro ortamda neden olduğu, bu nedenle potansiyel fenotipik değişikliklerin engellenmesi hücre kültürü ortadan kaldırmak için yeterlidir.
Yenilikleri ve bu protokol deneysel yararlarına rağmen, biz sınırlamalar hala varolduğunu. İlk olarak, kemirgen vanalarındaki VEC nüfusun boyutu çok küçük ve bu nedenle birden fazla zamana embriyonik yavrular gen ekspresyon analizi için yeterli RNA'yı üretmek için gerekli olmasıdır. Thi ikens Birden yetiştiricilerin kullanılarak aşılabilir, bazı post-izolasyon analiz araçları uygulama üzerinde bir etkisi olabilir. Bu sınırlama özellikle moleküler profil ve fonksiyonel analizleri dahil olmak VECT fenotipleri daha kapsamlı analizler gerçekleştirmek için GFP pozitif VECs kaynaşmaya kültürleri kurulması için bir meydan okuma olmuştur. Bu nedenle biz değil tüm zorluklar bizim yaklaşımla üstesinden edildiğini kabul ama bu üstesinden gelmek için çalışıyoruz ilgi alanıdır.
Kapak bölgelerden VECs izole Bu yaklaşım ventriküler miyokard içinde endokarda, veya vasküler yapıların Tie-GFP -pozitif, non-valvüler endotel hücrelerinden kirlenme olasılığını tanıttı. Bugüne kadar, diğer kalp endotel hücre popülasyonlarından VECs moleküler fark tespit edilmemiştir. Ancak Nfatc1 geninin bir artırıcı bölge tanımlanmış ve spesifik olarak yok olduğunu VECs etiket gösterilmiştirkalp 18 içinde EMT ve başka bir endotel hücre popülasyonu tabi tutulur. Cre modeli (Nfatc1 encre) olarak mevcuttur, gelecekteki çalışmalar kontaminasyon riskleri en aza indirmek için bu hattın özgüllüğünü faydalanabilirler. Non-valvüler Tie2-GFP- pozitif hücrelerinin yanı sıra, kapakçıkların septal ve duvar miyokard duvarların dairesel bölgeye eklemek noktada miyositlerden kirlenme olasılığı her zaman vardır. Burada veriler gösterilmemiştir, başlangıçta, anti-GFP ve anti-CD31 antikoru ile kaplanmış konjuge edilmiş boncuklar kullanılarak kesilmiş kapak bölgelerden VECs izole etmek için çalışmalar başladı. Bu yaklaşım, endotel hücreleri izole etmek için başarılı iken, biz bitişik olmayan endotel hücre tiplerinden önemli hücre topaklanma deneyimli ve bu nedenle kurbanda ve miyokard hücreleri bizim deneysel örnek kirlenmiş. Bu parametreler sadece tek hücre süspansiyonu yalıtmak için ayarlanmış gibi FACS analizi kullanılarak kaçınılması olmuşturS ve PCR analizi, miyosit spesifik genlerin ekspresyonu, bu sınırlama (Şekil 3) için kontrol edilen şekilde tespit etmek. Bizim kontaminasyon minimum olarak kabul edilebilir olsa da, GFP ve endotel hücre-spesifik yüzey belirteçlerinin çift seçimi ile gelecekte önlenebilir potansiyel bir deneysel karmaşıklık kalır.
Bu protokolü kullanarak, embriyonik ve yetişkin fareler ve bu yaklaşım RNA izolasyonu ve GFP ve GFP pozitif negatif hücre popülasyonlarının, hücre kültürü için kullanılabilir olduğuna ilişkin örneklerden başarılı bir şekilde izole VECs sahiptir. Bununla birlikte bu yaklaşım, bu uygulamalarla sınırlı değildir, ve hücresel ve moleküler fonksiyonel yaklaşımları bir bolluk için kullanılabilir. Ayrıca, Tie2-GFP arka plan, hastalık ve sağlıkta VECT nüfus karşılaştırmalı çalışmalar için izin verecektir genetik fare modelleri ile yetiştirilen olabilir. Bu yeni yöntemin geliştirilmesi, ilk kez, odaklanmış çalışmaları için sağlayacaktırvana geliştirme ve bakım VECs katkısını inceleyen ve endotel-bağımlı kapak hastalığı önceden hesaba katılmayan mekanizmalarını ortaya koyabilir.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz FACs analizi ile teknik yardım için Ohio State Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi Analitik Cytometry Çekirdek tesisi, özellikle Katrina Moore, teşekkür ederim. Ayrıca biz onların bilimsel anlayışlar için Dr William Pu ve onun grubunu tanır. Bu çalışma NIH HL091878 (JL) ve Nationwide Çocuk Hastanesi Kalp Merkezi tarafından desteklenmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 568 Keçi Anti-Sıçan IgG (H + L) | Yaşam Teknolojileri | A-11077 | |
| 70 & mu; m naylon hücre süzgeci | BD Falcon | 352350 | |
| %2.5 Tripsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
| Sığır Serum Albümini (BSA), Fraksiyon V, Isı Şokuna Tabi | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| CD31 sıçan anti-fare antikoru | BD Pharmingen | 553370 | |
| Civciv Serumu | Invitrogen LT | 16110-082 | |
| Kollajenaz IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır |
| DNase I, RNase içermez (10.000 Birim) | Roche | 4716728001 | |
| EBM-2 | Lonza | CC3156 | VEC ortamı |
| için EDTA, 0,5 M Çözelti | Hoefer | 03-500-506 | |
| EGM2 SingleQuot, | VEC ortamı için | Lonza | CC-4176 |
| Fetal Sığır Serumu (FBS), Isıyla İnaktive | Edilmiş Hiklon | SH3007103IH | |
| Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) | Yaşam Teknolojileri | 14025-092 | |
| At Serumu | Invitrogen LT | 16050-130 | |
| Hibridizasyon Fırını | VWR | 230301V | |
| Orta 199 1X | Corning cellgro | 10-060-CV | |
| Paraformaldehit %16 Çözelti EM sınıfı | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15710 | |
| Kalem/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
| Permanox kapaklı steril hazneli sürgü | Termo-Bilimsel | 177429 | |
| Fosfat Tamponlu Salin, 1X | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| PrimeTime Mini qPCR Testi | Entegre DNA Teknolojileri | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
| StepOnePlus Gerçek Zamanlı PCR Sistemi | Uygulamalı Biyosistemler | 4376600 | |
| SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 | |
| [başlık] | |||
| Tie2-GFP fareler | Jackson Laboratuvarları | 3658 | |
| Doku forseps # 5 11 cm | Dumont | 14096 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| &alfa;-SMA anti-fare antikoru | Sigma-Aldrich | A2547 | |
| VECTASHIELD DAPI Vektör | Laboratuvarları | H-1500 |
Kaynaklar
- Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells. Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).
- Lincoln, J., Yutzey, K. E. Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research. Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).
- Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development. Developmental biology. 359, 209-221 (2011).
- Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro. Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).
- Hinton, R. B. Jr Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease. Circulation research. 113, 186-197 (2013).
- Bosse, K., et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease. Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).
- Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve. The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).
- Hofmann, J. J., et al. Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome. Development. 139, 4449-4460 (2012).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2010).
- Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).
- Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).
- Motoike, T., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).
- Levay, A. K., et al. Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo. Circulation research. 103, 948-956 (2008).
- Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells. Developmental biology. 292, 292-302 (2006).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation research. 109, 183-192 (2011).
Yeniden basım ve izinler
