Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

16.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51879

⸱

29 Ocak 2015

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Biz etiketleme ve yenidoğan farelerin genotiplenmesi ve onlardan birincil nöronal kültürlerin üreten prosedürleri açıklar. genotyping, hızlı, verimli ve güvenilir, ve otomatik nükleik asit ekstraksiyon için izin verir. Bu neonatally öldürücü fareler ve genotipleme önce tamamlanmasını gerektirmektedir kültürleri için özellikle yararlıdır.

Özet

Memeli nöronların yapısının ve fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü analizi genellikle nöronlarının birincil kültürleri analizi ve ardından tek tek hayvanların genotipleme gerektirir. Genotyped için yenidoğan fareler, hızlı genotiplendirmesi etiketleme, ve bu farelerin beyin nöronları düşük yoğunluklu kültürleri kurulması: Biz prosedürlerin bir dizi tarif. Bireysel fareler yetişkinlikte süren uzun süreli kimlik sağlar dövme, tarafından etiketlenir. Açıklanan protokol tarafından Genotipleme hızlı ve verimli ve iyi güvenilirlik ile nükleik asitin otomatik çıkarılması için izin verir. Bu yenidoğan letalitesinin muzdarip farelerde, örneğin geleneksel genotiplemede için yeterli zaman mevcut değildir şartlar altında yararlıdır. Primer nöronal kültürlerin yüksek uzaysal çözünürlükte görüntüleme deneyleri sağlayan düşük yoğunlukta, oluşturulur. Bu kültür yöntemi öncesinde nöronal kaplama için glial besleyici katmanlar hazırlanmasını gerektirir. protocol hareket bozukluğu DYT1 distoni (AE-Torsina knock-in fareleri) bir fare modelinde bütünüyle uygulanır ve nöronal kültürler, bu farelerin hipokampus, serebral korteks ve striatum hazırlanır. Bu protokol, diğer türlere ait hayvanlar için, hem de diğer genetik mutasyonlar olan farelere de uygulanabilir. Ayrıca, protokol bireysel bileşenleri izole alt projeler için kullanılabilir. Böylece bu protokol nörobilim hem de biyolojik ve tıbbi bilimlerin diğer alanlarında değil, sadece geniş bir uygulama, sahip olacaktır.

Giriş

Genetik hastalıkların kemirgen modelleri, normal protein ve nükleik asit, aynı zamanda, bu kusurların patofizyolojik fizyolojik işlevleri açısından yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Örnekler önemli hücresel fonksiyonlara yer alan proteinleri eksikliği olan fareler, aynı zamanda, Alzheimer hastalığı gibi hastalıkların fare modelleri yer alır. Ancak, bazı genetik manipülasyonlar kısa bir süre yenidoğan öldürücülüğü veya doğumdan sonra birkaç gün yol açabilir. Bu gibi durumlarda, birincil hücre kültürleri, canlı hücrelerin ölümünden önce embriyonik veya neonatal yavrular elde edilebilir, çünkü önemli bir araç olup, bu in vitro en az birkaç hafta muhafaza edilebilir, ve bu süre içinde, erken nöronal gelişimi ile takip edilebilir , biyokimyasal, fonksiyonel ve morfolojik deneyler. Birincil kültürler için, bu düşük yoğunluklu nöronlar plaka için yararlı olabilir; Bu bireysel somata, dendrit, akson milleri ve sinir TERMI görselleştirmek mümkün kılaryüksek uzaysal çözünürlükte rken,. Bununla birlikte, düşük yoğunlukta nöron sağkalım ve farklılaşma, tipik olarak bir glial besleyici tabaka kaplama gerektirir, ko-kültür glia 1 şartlandırılmış fiziksel bunlarla temas üzerine ya da ortam içinde kültürlenen yokluğunda glial hücreler.

Glial besleyici katmanlar üzerinde düşük-yoğunluklu nöronal kültürlerin kurulması önceden hızlı ve güvenilir genotipleme bağlı olabilir - bir kaç gün aksine bir kaç saat içinde. Nöronal genotip daha önceden hazırlanmış bir glial besleyici tabakanın edilene uyumlu olması gerekir, hız özellikle önemlidir. Daha pratik bir örnek olarak, genotip arasında yavrular bir deney etkinliğini optimize etmek için, oluşturma kültürlerinde kullanmadan karar vermek için gerekli olabilir.

Burada önceki yayınlarda 2-6 hızlı, basitleştirilmiş ve güvenilir bir fare genotip için kullanılır olmuştur çalışma protokolü göstermektedir. Fare kuyrukları veBir ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılır. Bu protokol, doku nükleik asitlerin tek aşamalı ekstraksiyon ve ('durdurma çözeltisi'), bir nükleik asit saflaştırma adımı veya bir sonlandırma tamponu kullanılmasını gerektirmez. Bu genotipleme yönteminin güvenilirliği farkları örneklerin başlangıç ​​miktarı, hayvanların yaş ve PCR amplikonlarının uzunluğuna göre sokulduğunda bir dizi test sonuçlarını gösteren açıklanmaktadır. Bu kit otomatik çıkarma ve güvenilirlik avantajlar sunuyor.

Kapsamlı olma uğruna, genotip farelerin uzun vadeli belirlenmesi için dövme kullanımı da gösterilmiştir. Dövme (epidermisin altında) derinin dermiş için dövme mürekkep uygulanarak elde edilir 7. Bir prosedür dövmeler gibi kuyrukları ve ayak gibi vücudun diğer bölgelerine uygulanabilir olmasına rağmen, yeni doğan ya da 1 gün eski farelerin pençe yastıkları dövme için tarif edilir ve Anim içinHer yaştan als. Buna ek olarak, yöntemler, glial besleyici tabakalarının 2,8 farklı optimize hazırlanması göre, bir düşük yoğunlukta fare nöronlar kaplama ve kültür olması gerekmektedir.

(; P.Glu302del / p.Glu303del c.904_906delGAG / c.907_909delGAG) 9 gen TOR1A bir mutasyon nedeniyle otozomal dominant hareket bozukluğu - Biz miras nörolojik bozukluk DYT1 distoni bir genetik fare modeli kullanın. Protein açılımı, protein kompleksi demontaj, membran kaçakçılığı ve vezikül füzyon: kodlanan protein, Torsina, üyeleri genellikle, hastabakıcı gibi işlevleri yerine yardımcı (AAA +) proteinlerin ailesi, "çeşitli hücresel faaliyetler ile ilgili ATPazların" aittir 10-13. Mutasyon glutamik asit için bir kodonun bir çerçeve içi silme ile sonuçlanır, ve erken başlangıçlı genel izole distoni '14,15 ortaya konulmasına neden olur. Bununla birlikte, yolBu bozukluk sorumlu ophysiological mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır kalır. Bir knock-fare modelinde, mutant alel Tor1a AE olarak, burada bahsedilen Tor1a tm2Wtd vardır. Heterozigot AE-Torsina knock-farelerin DYT1 distoni ile canlı ve genetik taklit insan hastalar, oysa homozigot knock-fareler genetik kökenli 18 etkilenen doğum sonrası ölüm gecikme ile, doğumdan 16,17 sonra ölürler. homozigot knock-farelerin erken ölüm hayvanların genotipleme ve nöronal kültürlerin kurulması hem hızla tamamlanmasını gerektirmektedir. Genotipleme başka örnek olarak, Tfap2a (transkripsiyon faktörü, AP-2α, arttırıcı protein 2α bağlanma geçirmek için) kullanılır. Bu gen tarafından kodlanan bir protein, proliferasyon, diferansiyasyon, hayatta kalma ve apoptoz 19 gibi çok sayıda hücresel işlemleri düzenleyen önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bu çalışmada yapılan tüm hayvan prosedürleri Iowa Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Paw Pedleri dövme yapılması kullanma Fareler 1. Uzun süreli Kimlik

  1. Deneyci bakan pençe ped (plantar yüzeyi) ile bir pençe hareketsiz. Başparmak ve işaret parmağı ile pençe tutun. Pençe sıkmamaya özen gösterin.
    NOT: Kararlı immobilizasyon dövme pigmenti pençe pad dermis içine yerleştirilir sağlamak için önemlidir, ve bu nedenle 7 kalıcıdır.
  2. Bir gazlı bez sünger veya bez üzerinde% 70 etanol ile pençe pedi çubukla.
  3. Bir pamuk uçlu aplikatör cilt yağı uygulayın ve nazikçe pençe ped birkaç kez yüzeyine karşı ucunu basın. Cilt yağ çok az miktarda kullanmak; mevcut olduğunda büyük miktarlarda, cilde ulaşmasını dövme pigmenti önleyecektir.
  4. Hemen önce dövme mürekkebi içine dövme iğneleri ipuçları Dipdövme için. Ağrı ve enfeksiyon olasılığını azaltmak için, ve aynı zamanda dövme verimliliğini artırmak için, temiz, aseptik ve keskin dövme iğne kullanın.
  5. Pençe ped yüzeyi cilt yağı ile kaplı iken, pençe pad merkezinde cilde karşı dikey ve hafifçe dövme iğne ipuçları basın ve mürekkep birden çok kez enjekte edilir. Elektrik dövme sistemi hakkında bilgi almak için Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın.
  6. Yavaşça, bir gazlı bez sünger üzerinde% 70 etanol Sprey cilt yüzeyinde ekstra dövme pigmenti kaldırmak için pençe karşı basın ve dövme kalitesini kontrol edin. Pençe pad orta normal deri pigmentasyonu farklı bir karanlık, yuvarlak nokta olduğunu kontrol edin. Dövme koyu veya kolay görüntüleme için yeterince büyük değilse, önce dövme adımları tekrarlayın.

Fast PCR Genotipleme Kit kullanarak 2. Genotipleme Yenidoğan Fareler

  1. % 70 etanol ile bir fare kuyruk distal ucunu dezenfekte kuyruk 5 mm ya da daha az kesimipucu ve PCR için kullanılan tipte 8 boru şeridin bir tüpe aktarın. Örneklerin arasında çapraz bulaşmayı önlemek için her yavru için bir un-kullanılan jilet kullanın. Seçenek olarak ise, bir makas kullanımı, ancak bu durumda, dikkatli bir şekilde ve iyice% 70 etanol kullanılarak bıçaklar üzerinde kalan doku çıkarın. Kanama kontrol edin. Kanama oluşursa kanama durana kadar, bir gazlı bez sünger ile kuyruk kesme kısmına basınç uygulayın.
  2. Bir örnek ihtiva eden her bir PCR tüpü DNA ekstraksiyon çözeltisinden 200 ul ekle. Kit hakkında kompozisyonu ve bilgi Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın.
  3. PCR termal döngü içine boru şeridi yerleştirin ve aşağıdaki programı kullanılarak DNA çıkarma işlemini başlatmak: 1 döngü, 55 ° C'de 10 dakika, 10 dakika boyunca 95 ° C 'de 1 döngü için, ve 4 ° C'de tutma.
    Not: Bu, daha sonra, PCR için kullanılan aynı PCR termal döngü cihazı olup.
  4. DNA ekstraksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, termal döngü a gelen tüp şeridi çıkarınnd 5 kez ters çevirin.
  5. Bir un-kullanılan bir 8-tüp şerit tüp, ve ile karıştırmak için her numunenin Transfer çözüm (DNA özü) 4 ul: 2X PCR Hazır II 10 ul, ileri ve geri primerler karışık 2 ul (tavsiye edilen 0.5 uM, her numune için nükleazsız H 2 O dizileri için Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız), ve 4 ul. Bir masa üstü santrifüj kullanılarak Spin kısaca (örneğin, 3 sn). Işlerken dışında her zaman buz üzerinde tüpler tutun.
  6. Termal bisiklet gerçekleştirin. Görmek Termal program Malzemeleri / Ekipman Tablosu.
  7. Çoğaltılan DNA ürünleri algılar. Doğrudan bir agaroz jel, bir kuyu içine PCR'dir (20 ul), toplam reaksiyon çözeltisinin yerleştirin. Ayrı bir kuyuya moleküler ağırlık belirteçleri yükleyin. Bir elektrik alanı uygulanır.
  8. Ultraviyole ışık altında floresan bantları görüntülerini elde edin.

Fare Beyin Neuron 3. İlköğretim KültürüGlial Besleyici Layer s

NOT: Beyin diseksiyon ve hücre ayrışma (3.1) için prosedürler izleyen tüm prosedürler için ortaktır. Fare glial kültürlerinden prosedürleri (3.2), sıçan glial kültürleri (3.3) ve fare nöronal kültürlerinde (3.4) daha sonra ayrı ayrı açıklanmaktadır.

  1. Beyin Diseksiyon ve Hücresel Dissocaiation
    1. Hızla beyin kaldırmak ve Hanks solüsyonu içine yerleştirmek, başı kesilerek bir fare veya sıçan yavrusuna Kurban (bileşim için tablo 1 e bakınız) +% 20 (buz üzerinde tutulur), bir 35 mm çanak fetal sığır serumu (FBS).
    2. İki hemisfer içine orta hat boyunca beyin kesin. Beynin her yarımkürede ilgi bölgeyi (örneğin, serebral korteks, striatum ve hipokampus) sökün. Yüzeyden meninksler ve büyük kan damarları çıkarın. Cerrahi bıçak kullanarak 4-10 ince dilimler halinde beyin bölgesini kesin.
    3. Zekâ, bir kez 15 ml'lik santrifüj tüp içinde beyin dilimleri durulayınh Hanks çözeltisi +% 20 FBS, Hanks ile sonra da 3 defa '(serumsuz örneğin) bir (4 ° C). , Durulama 5-10 ml solüsyon ekleyin, dilim tüpün dibinde yerleşmek beyin, üst çözüm aspirat, izin ve taze bir çözüm eklemek için. Çözüm aspire durulama işlemi bitirin.
    4. 3 ml'lik bir şırınga ve bir 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak tripsin içeren sindirim çözeltisi (bileşim için tablo 1 e bakınız), 2 ml filtre ve beyin dilim içeren tüp içine doğrudan filtrat ekleyin. Trypsinization oda sıcaklığında 13 dakika devam edelim.
    5. En iyi şekilde aspire ve 7-10 mi Hanks çözeltisi +% 20 FBS (4 ° C) ilave etmek suretiyle tripsin solüsyonu nötralize.
    6. Hanks ile iki kez, beyin dilimleri yıkayın 'çözeltisi +% 20 FBS ve Hanks daha sonra üç kez' solüsyonu (yani serumsuz) (4 ° C). Solut aspire durulama işlemi bitirmekiyonu temsil etmektedir.
    7. 3 ml'lik bir şırınga ve bir 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak ayrışma çözeltisi (bileşim için tablo 1 e bakınız), 2 ml filtre ve beyin kesitleri ile doğrudan boruya filtrat ekleyin.
    8. Mekanik görünür doku parçaları kaybolana kadar hafifçe, 10-20 kez öğütülerek hücreleri ayırmak. Bir pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipet kullanın ve triturasyonun sırasında kabarcıkları yapmaktan kaçınmak.
    9. Küçük parçalar yerleşmek için 3 dakika bekleyin.
    10. Çözeltisi çoğunluğu aktarın (~ 1.5 mi, altındaki bir bir solüsyon) kullanılarak, 3 mi Hanks solüsyonu +% 20 FBS çözeltisi (4 ° C) ihtiva eden bir 15 mL santrifüj tüpüne pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti. Altındaki herhangi bir tortu dahil tipik kültür bozulması ile sonuçlanır, çünkü tüm çözüm transferi yapmayın.
    11. 4 ° C'de ~ 185 g (~ 1100 rpm) 13 dakika santrifüj uygulayın.
    12. Yavaşça süpernatant aspire,eklemek 1 ml önceden ısıtılmış pelet orta (37 ° C) kaplama ve hafifçe pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipet kullanarak birkaç kez pipetleme bunu tekrar süspansiyon.
      NOT: Ortamı kaplama Üç farklı farklı kültür amaçlı kullanılır: fare nöronları orta-2 kaplama, fare glial hücreler orta-1 kaplama, ve sıçan nöronlar ve glial hücreler orta-3 kaplama (kompozisyonlar için Tablo 1'e bakınız) .
    13. Hemasitometre veya otomatik hücre sayıcı kullanılarak, hücre süspansiyonu 10 ul çıkarın% 0.4 tripan mavisi çözeltisi 10 ul ile karıştırarak, ve canlı hücrelerin yoğunluğunu ölçmek.
  2. Fare Glial Kültürleri
    1. Fare hücreleri sağlıklı kültürleri kurulmasına yardım etmek lamelleri yıkayın.
      1. Cam bir Petri kabı içinde% 70 nitrik asit içinde cam lamelleri (yuvarlak, 12 mm çapında) daldırın. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun ve bir yörünge çalkalayıcı O / N üzerine yerleştirin.
      2. Cam coversli durulayındamıtılmış su ile Petri kabındaki PS en az üç kez. Distile su onları bırakın. Bir yörünge çalkalayıcı O / N çanak yerleştirin.
      3. Biyolojik güvenlik kabininde bir Whatman 150 mm filtre kağıdı üzerinde lamelleri kurulayın.
      4. Lamelleri otoklavlayın.
      5. 24-çukurlu kültür kabına lamelleri yerleştirin.
    2. Adım 1 ve 2'ye göre etiket ve genotip doğan farenin.
    3. Adım 3.1 göre fare yavrular beyin hücreleri elde.
      Not: serebral kortekste fare glial besleyici tabakanın hazırlanması için tipiktir. Bununla birlikte, bu hipokampus ve striatum gibi diğer beyin bölgelerinde, farklı sayı ve farklı bölgelerden hücre verimi için hücre yoğunluğu, uygun ayarlamadan sonra çalışır.
    4. Önceden ısıtılmış son hücre süspansiyonu, orta 1: kaplama ~ 4 ml (~ 1 mi). Ön ısınma kültür ortamı için, kültür inkübatör çözümü (% 5 CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, yerleştirmeksıcaklık ve pH değerleri, stabilize olmasına izin verin.
    5. Pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak, bir kaplanmamış T25 kültür şişesine hücre süspansiyonu aktarın. Kültür inkübatör içine yerleştirilir.
    6. Nitro (DIV), 1 gün içinde iki defa kaplama ile T25 şişesi içinde kültürlenmiş hücrelerin durulama orta 1 (4 ° C). Geri kuvöz içine balon yerleştirin. Bir girdap hareket birkaç kez taze ortamın ~ 5 ml ekleyerek, tamamen Pasteur pipeti şişeye içinde orta aspire ve yavaşça şişeyi eğerek durulama yapınız.
    7. 6-9 DIV anda, (yani, bir trypsinization gün önce ve 3.2.8-3.2.13 adımda, lamelleri kaplama), (hücre dışı matriks proteinleri ile kaplama malzemesinin 100 ul yer hakkında yorumlar için Malzemeleri / Ekipman bkz: İçindekiler Kaplama bir kültür kabı içinde cam lameller üzerine bir malzeme) ve kültürü inkübatöründe kültür kaplarına yerleştirin.
    8. 7-10 DIV, at hücreleri 20-4 olduğunda0% konfluent (mekansal sürekli), onları trypsinize.
      1. Bir şişe içinde tüm solüsyonu aspirasyon ve ~ Hanks solüsyonu (4 ° C) 13 ml ilave etmek suretiyle, bir kez balon yıkayın, yumuşak bir dönme hareketi bir şişe içinde bir kaç kez tilt ve tamamen çözelti aspire.
      2. 4 mi tripsin-EDTA çözeltisi DNaz çözeltisi (nihai konsantrasyon, 750 birim / ml) 40 ul ekle 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir çözeltisinin, ve şişe hücreler doğrudan filtrat ekleyin.
      3. Tripsinizasyon kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 13 dakika sürmesine izin verin.
      4. Şişeye 100% FBS (4 ° C) 2 ml ekleyerek tripsin solüsyonu nötralize.
      5. Hanks çözeltisi +% 20 FBS (4 ° C), santrifüj ~ 4 ml, bir 5- ila 10-mi bir pipet kullanarak 15 ml santrifüj tüpüne tripsinize hücreleri transfer ~ 185 g ve 13 dakika süre ile 4 ° C ve süpernatant aspire.
    9. Ön Warme 1 ml pelletinid kaplama orta-1.
    10. Aşama 3.1.13 göre hücre yoğunluğu ölçülür.
    11. Lamelleri ~ yeniden süspanse glial hücreler 50 ul kaplama cam lamelleri tamamen malzeme, ve plaka aspire.
      NOT: Bu hücreler glial besleyici tabaka kuracak.
    12. Inkübatör lamelleri kültür çanak yerleştirin.
    13. 20-60 dakika sonra, önceden ısıtılmış her kuyuya orta-1 kaplama 1 ml ekleyin ve inkübatör geri çanak yerleştirin. Not: kaplama ortam ilave edilirken, lamel ortamda yüzer olmayacak şekilde, (hayır kaplama hücreler vardır) lamel çevresini aşağı basın başka bir pipet kullanmak yararlı olacaktır.
    14. (Cam lamel üzerinde, yani,), glial besleyici tabakanın 1 DIV içinde 1 ml orta yerine önceden ısıtılmış kaplama orta 1, bir kuyu içinde çözelti her aspirasyon ve daha sonra taze aracı ile doldurarak.
    15. Glial besleyici tabakasının 2-3 DIV at zaman celher bir oyuğa, bundan dolayı DNA replikasyonu ve inhibe etmek için, Ls mitotik durdurucu (81,2 ve 204,8 uM nihai konsantrasyonlar, sırasıyla 5-floro-2'-deoksiüridin + üridin karışımı 10 ul) ekleyin,% 80-100 konfluent Glial hücre çoğalmasını bastırmak.
    16. Hücreler% 90-100 sıklıkta (glial besleyici tabaka nöronlar kaplama önce 1-2 saat) zaman 7-9 DIV de, kültür ortamı yerine önceden ısıtılmış kaplama, orta-2 (37 ° C).
      Not: Nöronlar adım 3.4 kullanarak, aynı gün kaplama olacaktır.
  3. Sıçan Glial Kültürleri
    1. Kaplama aynı kaplama malzemesi ile T25 kültür şişesi.
      NOT: Bu adımda 3.3.5 içinde yapışkan olmayan hücreler daha sonra çıkarılması için gereklidir.
      1. Şişeye kaplama malzemesinin 2.0 ml ilave edilir, ve kültürü inkübatöründe balon yerleştirin.
      2. 2-3 saat sonra, şişenin taban kurur, böylece, tam olarak kaplama malzemesini aspire.
    2. Hücreler elde edilirsıçan yavrularından, 3.1 adım göre yöntem.
      NOT: hipokampus CA3-CA1 bölgesi sıçan glial besleyici tabaka hazırlamak için kullanılır. Bununla birlikte, bu tür beyin bölgelerinden gibi diğer beyin bölgelerinde, farklı sayı ve farklı bölgelerden hücre verimi hücre yoğunluğunda farklılıklar için ayarlama yapıldıktan sonra çalışacaktır.
    3. Önceden ısıtılmış son hücre süspansiyonu, orta 3: kaplama ~ 4 ml (~ 1 mi).
    4. Pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak, kaplamalı T25 kültür balona hücre süspansiyonu aktarın. Kültürü inkübatöründe (% 5 CO2 -95% O 2, 37 ° C) tutulur.
    5. 2-3 DIV hücreler% 20-40 konfluent olduğunda, kapağı sıkıca kapama balonu çalkalamak, yapışkan olmayan ya da zayıf biçimde yapışmayan hücreler giderilmiş kuvvetli bir şekilde ~ 10 kat çözeltisi, aspirasyon ile kaplama 4-5 mi ekleme Orta-3 (4 ° C'de). Bir kez bu işlemi tekrarlayın. (Örn tüm şişe zemin üzerinde kültür hücreleri incelemek,tamamen kaldırılır) hücre vücudun dış kenar faz parlak görünen o ki için, yani nöronal (görünür olanlar onaylamak için faz-kontrast mikroskobu) kullanılarak. Bu hücreleri kaldırmak ve daha sonra inkübatör şişeyi geri dönmek için gerektiği kadar işlemi tekrarlayın.
      NOT: gücü ve bireysel deneyci arasında farklılık olabilir gerekli 'sallar' toplam sayısı. Önemli olan bir dizi sayıya sallar toplam sayısını tutmak, ancak nöron benzeri hücreler ortadan kalkar onaylamak değildir.
    6. 6-8 DIV hücreler% 90-100 sıklıkta olduğu, geçiş adımı 3.2.8 olduğu gibi bunları trypsinizing glial hücreler olduğunda.
    7. Santrifüj işleminden sonra, bir kaplanmamış T75 şişeye tripsinize hücreleri transferi, orta-3 (4 ° C), kaplama 10 mi ekleyin ve kültür onları orta-3 (4 ° C), kaplama, 1 ml pelletini inkübatör.
      NOT: Sıçan glial hücreler iki kez geçişli olacak; Buna fare glial hücreler arbirden çok pasajlar sonra sağlıksız hale çünkü e sadece bir kez pasajlanır. Sıçan, glial hücreler, herhangi bir kaplama malzemesi ile kaplanmıştır değildir T75 şişeleri içinde pasajlanmağa devam edilecektir. Kaplama sıçan glial hücreler çok hızlı büyür ve daha sonra nöronal kültür durumunu bozulacaktır birçok kirpikli hücreler (varsayılan ependimal hücreler), verim sağlar.
    8. Bir şişe içinde, glial kültür 17-19 DIV de (örneğin, 11 gün pasaj ve tripsinleme bir gün önce ve 3.3.9-3.3.14 adımlarla lamelleri üzerine kaplama sonrası), (yıkanmamış cam lameller üzerine kaplama malzemesinin 100 ul koyun yuvarlak, 12 mm çapında) bir kültür çanak ve kültür inkübatör kültür çanak yerleştirin.
      NOT: sıçan glial kültürler için, bir fark ile veya lamelleri yıkama olmadan kültür sonuçlarında fark edildi.
    9. Bir şişede glial kültür 18-20 DIV anda (yani, Pasajlanması sonra 12 gün), st göre, kültür hücreleri trypsinizing glial besleyici tabaka hazırlamakep 3.2.8.
    10. Santrifüj sırasında, cam lamelleri tamamen kaplama malzemesi aspire.
    11. Santrifüj işleminden sonra, adım 3.1.13 göre, orta-3 (4 ° C), kaplama, 1 ml pelet tekrar süspansiyon ve hücre yoğunluğunun ölçülmesi.
    12. 10 4 canlı hücre / ml glial yoğunluğunu ayarlayın ve kaplamalı cam lamelleri glial hücre süspansiyonu 100 ul plaka.
      NOT: Bu hücreler glial besleyici tabaka kuracak.
    13. 20-60 dakika süreyle kuvöz içine lamelleri ile kültür çanak yerleştirin.
    14. Her bir orta-3 (4 ° C) kaplama için 1 ml ilave edilir, ve inkübatör çanak yerleştirin.
    15. Lamel hücreleri% 40-80 konfluent olduğunda, glial besleyici tabaka 3-4 DIV, içinde önceden ısıtılmış bir büyüme ortamı, 1 ml ilave (sitosin β-D-arabinofuranosid içeren (bileşim için tablo 1 e bakınız) Araç, 4 uM nihai konsantrasyon), glial hücre çoğalmasını durdurmak için. Plaka nöronGlial besleyici tabakasının 7-9 DIV s at hücreleri adım 3.4 kullanarak,% 60-80 konfluent olduğunda.
  4. Fare nöronal kültürlerinde
    1. Adım 1 ve 2'ye göre etiket ve genotip doğan farenin.
    2. Adım 3.1 için fare yavrular kullanın.
    3. Canlı hücre süspansiyonu yoğunluğunu ayarlamak için ~ kullanılarak, 2.0 x 10 5 hücre / ml önceden ısıtılmış orta 2 fare, glial hücreler üzerinde kaplama ya da kullanımı için kaplama kaplama orta 3 sıçan glial hücreler üzerine kaplama için.
    4. Yavaşça her kültür ortamı hücre süspansiyonuna eklenmeden tarafından iyi glial besleyici tabaka, hücreler plaka. Not: eklenecek hücre süspansiyonu hacmi de bir kültürde hücrelerin hedef numarası ile belirlenecektir. Örneğin, plakasının hücre süspansiyonu 60 ul / kuyucuk 12,000 hücre elde etmek için.
    5. Nöronlar kaplama sonra hiçbir çözüm değişiklikler gerekli olduğunu unutmayın. Kültür boyunca, iç o nemlendirerek kuyulardan çözümün buharlaşmasını önlemek için dikkatli olunkültürü inkübatöründe f.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolün uygulanmasında bir örnek olarak, temsili sonuçlar çeşitli deneysel koşullar altında dövme, güvenilir genotiplemede tarafından fareler etiketleme, ve glial besleyici katmanlar birincil nöronal kültürlerin kurulması için gösterilmiştir.

Dövme

Yenidoğan yavrular (Şekil 1 'Yenidoğan') bir dövme sistemi kullanılarak pençe yastıkları etiketli bulundu. etiketler 3 haftada açıkça görünür kalmıştır ('3 haftalık') ve yaş 32 h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan protokol kuyruk ipuçları fareler genotiplemeye, / etiket fareler tanımlamak için dövme prosedürlerini içerir ve düşük yoğunlukta kültür fare beyin nöronları için. 6-8 yavrular kullanıldığı deneylerde bir turunda, bu işlemler genellikle 6-7 saat toplam sırasıyla ~ 0.5 saat, ~ 4 saat ve ~ 2 saat, gerektirir. (Glial besleyici katmanlar önceden hazırlık hariç) tek bir çalışma günden kısa bir sürede - Bu nöronal kültürlerin kaplama için pups 'doğum sırasında gerekli tüm prosedürleri tamamlamak için bir tek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazar (Zhengmin Huang), bu makalede açıklanan reaktifleri üreten EZ BioResearch LLC'nin başkanıdır.

Teşekkürler

Yazarlar, Iowa Üniversitesi'ndeki araştırmacılara, Dr. Luis Tecedor, Ines Martins ve Beverly Davidson'a striatal kültürlerle ilgili talimatlar ve yardımcı yorumlar için ve Dr. Kara Gordon, Nicole Bode ve Pedro Gonzalez-Alegre'ye genotipleme yardımı ve tartışmaları için teşekkür eder. Ayrıca dövme ile ilgili yararlı yorumları için Dr. Eric Weyand'a (Hayvan Tanımlama ve İşaretleme Sistemleri) ve fare kültürüyle ilgili yararlı yorumları için Dr. Shutaro Katsurabayashi'ye (Fukuoka Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği, Savunma Bakanlığı (Hakemli Tıbbi Araştırma Programı ödülü W81XWH-14-1-0301), Distoni Tıbbi Araştırma Vakfı, Edward Mallinckrodt, Jr. Vakfı, Ulusal Bilim Vakfı ve Whitehall Vakfı (NCH).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
REAKTİFLER
Makinesi TemizleyiciHayvan Tanımlama ve İşaretleme Sistemleri A.Ş.NMCR3Bu, dövmeden sonra iğneleri ve tutucuyu temizlemek için kullanılır.
Makine Kurutma MaddesiHayvan Tanımlama ve İşaretleme Sistemleri A.Ş.NDAR4Bu, temizlikten sonra iğneleri ve tutucuyu kurutmak için kullanılır.
Yenidoğan Dövme Siyah PigmentHayvan Tanımlama ve İşaretleme Sistemleri A.Ş.NBP01
Deri Hazırlama AplikatörüHayvan Tanımlama ve İşaretleme Sistemleri A.Ş.NSPA1Q ucu.
Deri Hazırlama ÇözümüHayvan Tanımlama ve İşaretleme Sistemleri A.Ş.NSP01Bu reaktif, dövmenin verimliliğini artıran ve dövmenin solmasını önleyen ince bir yağ tabakası sağlar (satıcıdan bilgi): 1) dövme yapılmamış cildin geçici olarak lekelenmesini önler, böylece bir pençe pedi dövmesinin kalitesinin, yavru ev kafesine geri dönmeden önce kolayca değerlendirilmesini sağlar – Lekeli cilt yüzeyi dövmeli cilt ile karıştırılabilir, 2) dövme sırasında cilt hasarını azaltır – Cildi yumuşatmak ve iğneyi yağlamak, iğnenin cilde zarar vermeden cilde nüfuz etmesine yardımcı olur ve 3) moleküler oksijenin cilde girmesini önler, böylece üretilebilecek reaktif oksijen türlerine karşı enflamatuar tepkileri azaltır.
REAKTİFLER - genotipleme
EZ Hızlı Doku/Kuyruk PCR Genotipleme Kiti (Şerit Tüp Formatı)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-1002X PCR Ready Mix solüsyonuna elektroforez için kırmızı, yükleme boyası dahildir.
Doku Lizis Çözeltisi AEZ BioResearch LLCG2001-10020 ve mikroyu karıştırarak DNA Ekstraksiyon Çözeltisi hazırlayın; l Doku Lizis Çözeltisi A ve 180 &mikro; l örnek başına Doku Lizis Çözeltisi B.
Doku Lizis Çözeltisi BEZ BioResearch LLCG2001-10020 ve mikroyu karıştırarak DNA Ekstraksiyon Çözeltisini hazırlayın; l Doku Lizis Çözeltisi A ve 180 &mikro; l örnek başına Doku Lizis Çözeltisi B.
Asetik asit, buzulVWRBDH 3092
Agaroz optimize edilmiş sınıf, moleküler biyoloji sınıfırpiA20090-500 SYBR Safe DNA jel boyası (10.000 kat seyreltilmiş) veya etidyum bromür (0.5 & mikro; g/ml jel hacmi).
Etidyum bromürSigma-AldrichE7637-1G
Etilendiamin tetraasetik asit, disodyum tuzu dihidrat (EDTA)FisherBP120-500
Filtreli Pipet Uçları, Aerosol İçermeyen, 0.1-10 ve mikro; lNokta Bilimsel A.Ş. UG104-96RS Steril ve DNA, RNase ve DNaz içermeyen pipet uçları kullanın. DNA ile ilgili tüm adımlarda, çapraz kontaminasyonu önlemek için filtrelenmiş pipet uçları kullanın.
Filtreli Pipet Uçları, Premium Fit Filtre Uçları, 0,5-20 & lDot Scientific IncUG2020-RSSteril ve DNA, RNaz ve DNaz içermeyen pipet uçları kullanın. DNA ile ilgili tüm adımlarda, çapraz kontaminasyonu önlemek için filtrelenmiş pipet uçları kullanın.
Filtreli Pipet Uçları, Premium Fit Filtre Uçları, 1-200 & lDot Scientific IncUG2812-RSSteril ve DNA, RNaz ve DNaz içermeyen pipet uçları kullanın. DNA ile ilgili tüm adımlarda, çapraz kontaminasyonu önlemek için filtrelenmiş pipet uçları kullanın.
Moleküler ağırlık belirteci, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001Bu üç moleküler ağırlık belirtecinden birini kullanıyoruz.
Moleküler ağırlık işaretleyicisi, EZ DNA Eşit Merdivenler 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Moleküler ağırlık işaretleyicisi, TrackIt, 100 bp DNA MerdiveniGIBCO-Invitrogen10488-058
PCR tüpleri, ayrı ayrı takılmış kubbe üst kapaklı 8 tüplü şeritler, doğal, 0,2 ml ABD Bilimsel1402-2900Steril ve DNA, RNaz ve DNaz içermeyen tüpler kullanın. 8 tüplü bir şeridin kullanımı ve numuneleri gruplandırması, tek tek tüplere göre daha kolaydır.
PCR tüpleri, Ultraflux Bireysel rpi145660Steril ve DNA, RNaz ve DNaz içermeyen tüpler kullanın.
Seal-Rite 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü, doğalUSA Scientific1605-0000Steril ve DNA, RNaz ve DNaz içermeyen tüpler kullanın.
SYBR Güvenli DNA jel boyası * DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris bazrpiT60040-1000'de 10.000x
&Delta'da Tor1a genini amplifiye etmek için primerler; E-torsinA knock-in fareler5'-AGT, CTG, TGG, CTG, GCT, CTC, CC-3' (ileri) ve 5'-CCT, CAG, GCT, GCT, CAC, AAC, CAC-3' (geri) (referans 18). Bu primerler, 1.0 ng/&mikro'luk bir nihai konsantrasyonda kullanıldı; l (~0.16 &mikro; M) (referans 2).
Yabani tip farelerde Tfap2a genini amplifiye etmek için primerler ve 1990-BP Amplikon için 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (ileri), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (geri). Bu astarlar 0.5 &mikro;M'de kullanılır.
REAKTİFLER - hücre kültürü
5-Floro-2&prim;-deoksiüridinSigma-AldrichF0503-100MGDaha fazla bilgi için üridinin yorumlar bölümüne bakın.
B-27 takviyesiGIBCO-Invitrogen17504-044
Hücre Kültürü Kapları 35 x 10 mm Tabaklar, Doku Kültürü ile muamele edilmişBD şahin353001
Hücre Kültürü Şişeleri, T25, Doku Kültürü ile işlenmiş, Eğimli boyunlu, tapalı kapak, 25 cm2 Büyüme Alanı, 70 mlBD şahin353082
Hücre Kültürü Şişeleri, T75, Doku Kültürü ile işlenmiş, Eğimli boyunlu, havalandırmalı kapak, 75 cm2 Büyüme Alanı, 250 mlBD şahin353136
Konik Tüp, polipropilen, 15 mlBD şahin352095
Kontes (hücre numarası sayacı) oda slaytlarıGIBCO-InvitrogenC10312
Sitozin ve beta;-D-Arabinofuranosid hidroklorür (Ara-C hidroklorür)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-Glikoz (Dekstroz) susuz, SigmaUltra, %99,5 (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
Tabak, Petri camı 100 x 15 mmPyrex3160-101
Damıtılmış suGIBCO-Invitrogen15230-147
DNase Tip IISigma-AldrichD4527-200KUStok çözeltisi 1.500 birim / 20 &mu'da hazırlanır; l = 75.000 birim/ml damıtılmış suda.
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM), yüksek glikoz, GlutaMAX, piruvatGIBCO-Invitrogen10569-010, 500 ml
Hızlı PES Filtre Ünitesi, 250 ml, 50 mm çapında membran, 0.2 & m Gözenek BoyutuNalgene568-0020
Hızlı PES Filtre Ünitesi, 500 ml, 90 mm çapında membran, 0,2 & m Gözenek BoyutuNalgene569-0020
Fetal sığır serumu (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
Cam lamel, 12 mm Yuvarlak, kalınlık 0.09– 0.12 mm, No. 0Carolina633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Hanks'in Dengeli TuzlarıSigma-AldrichH2387-10X
HEPES, & ge; %99,5 (titrasyon)Sigma-AldrichH3375-250G
Hidroklorik asit, %37, ACS reaktifiSigma-Aldrich258148-100 ML
İnsülinSigma-AldrichI5500-250 mg
Magnezyum sülfat heptahidrat, MgSO4•( 7H2O), BioUltra, & ge; %99,5 (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel Bodrum Membran Matris çözeltisi, Fenol Kırmızısı İçermeyenBD Biosciences356237Bu, lameller ve şişeler için kaplama malzemesidir. 1) Hazırlamak için, Matrigel Basement Membrane Matrix çözeltisini buz üzerinde çözdürün, bu genellikle ~ 1 gün sürer. Önceden soğutulmuş bir pipet kullanarak, çözülmüş çözeltiyi buz üzerinde önceden soğutulmuş T25 şişelerine ayırın ve şişeleri -20 ° C'de saklayın. Çalışan Matrigel çözeltisini hazırlamak için, alikotlanmış Matrigel'i buz üzerinde bir şişede çözdürün, önceden soğutulmuş MEM çözeltisi ekleyerek 50 kat seyreltin ve seyreltilmiş çözeltiyi 4 ° C'de tutun. Lamellerin kaplanması sırasında ve sonrasında dışında, Matrigel ile temas eden tüm kültür eşyalarını ve ortamlarını, erken bir jel oluşturmasını önlemek için önceden soğutmak önemlidir. 2) Cam lamellerin veya kültür şişelerinin Matrigel ile kaplanması için Matrigel solüsyonunu yüzeye uygulayın. Hücreleri kaplamadan önce, yüzeyin tamamen kurutulması önemlidir. Bu amaçla, hücreleri kaplamadan hemen önce hücresel santrifüjleme sırasında Matrigel'i aspire etmek ve kurutma için yeterli zaman tanımak faydalı olabilir.
Minimum Esansiyel Orta (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO + Serum Genişletici, 5 mlBD Biosciences355006
Çok Kuyulu Plakalar, Doku Kültürü ile tedavi edilmiş 24 oyuklu plakaBD şahin353047
Çok Kuyulu Plakalar, Doku Kültürü ile tedavi edilmiş 6 oyuklu plakaBD şahin353046
Nörobazal-A Ortamı (1X), sıvıGIBCO-Invitrogen10888-022
Nitrik AsitVWRbdh 3044
NS (Nöronal Takviye) 21 LaboratuvardaKaynak: referans 69
Pasteur pipetleri, 5 & frac34; ”  Fisher13-678-6ABu pamuk tıkalı 5 ¾'ü kullanın; ” Hücresel öğütme için pasteur pipeti. Kesilen yüzeyi düzleştirmek ve iç çapı orijinalin %50-80'ine düşürmek için ucu önceden ateşle parlatın. Çok küçük bir uç hücreleri bozar ve hücre canlılığını azaltır, ancak çok büyük bir uç öğütme verimliliğini azaltır.
Pastör pipetleri, 9"  Fisher13-678-6B
Potasyum klorür (KCl), SigmaUltra, & ge; %99,0Sigma-AldrichP9333-500G
Serolojik pipet, 2 mlBD şahin357507
Serolojik pipet, 5 ml BD şahin357543
Serolojik pipet, 10 mlBD şahin357551
Serolojik pipet, 25 mlBD şahin357525
Serolojik pipet, 50 ml BD şahin357550
Sodyum bikarbonat (NaHCO3, Sodyum hidrojen karbonat), SigmaUltra, > % 99,5Sigma-AldrichS6297-250G
Sodyum klorür (NaCl), SigmaUltra, vb; % 99,5Sigma-AldrichS7653-250G
Sodyum hidroksit (NaOH), peletler,% 99,998 eser metal bazlıSigma-Aldrich480878-250G
Sodyum fosfat dibazik heptahidrat (Na2< / sub>HPO4< / sub>•( 7H2O)), ≥ %99,99, AldrichSigma-Aldrich431478-250G
Sükroz, SigmaUltra, & ge; % 99,5 (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
Şırınga filtresi, steril, 0.2 ve mikro; mCorning431219
Şırınga, 3 mlBD şahin309585
Transferrin, Holo, sığır plazmasıCalbiochem616420
Tripan Mavisi boya, %0.4GIBCO-InvitrogenT10282Bu, canlı / ölü hücreleri saymak için kullanılır. Eski bir tripan mavisi çözeltisini birçok kez yeniden kullanılırsa (örneğin birkaç hafta boyunca haftada birkaç kez) yenileyin, çünkü çökeltiler oluşturacak ve hücresel yoğunluğun hatalı okumalarına neden olacaktır.
Tripsin, tip XISigma-AldrichT1005-5G
Tripsin-EDTA çözeltisi, %0.25 GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5GStok çözeltisi, 25 ml DMEM'de (sırasıyla 8.12 ve 20.48 mM) 50 mg 5-floro-2'-deoksiüridin ve 125 mg üridin olarak hazırlanır.
REAKTİFLER - immünositokimya
Antikor, tavşan poliklonal anti-MAP2Merck MilliporeAB5622
Antikor, fare monoklonal anti-GFAP kokteyliMerck MilliporeNE1015
EKİPMAN - dövme
AIMSHayvan Tanımlama ve İşaretleme Sistemleri A.Ş.NEO– 9Bu Yenidoğan Kemirgen Dövme Sistemi, 1 veya 3 noktalı dövme iğnelerini cilde dikey olarak hızla hareket ettirerek çalışan bir elektrik sistemidir. Dövme iğne uçları cilt yüzeyine dik tutulurken dövme makinesini yaklaşık 0,5 saniye boyunca bir kez etkinleştirin. Dövme yapılan bölgeyi en üst düzeye çıkarmak için üç iğneli dövmeyi tercih ediyoruz, ancak tek iğneli dövme daha dar alanlarda, örneğin ayak parmaklarında em< / em> veya ince mekanik kontrol gerekiyorsa, örneğin < / em> sayılar dövme yapıldığında etkilidir. En düşük hızda iki tur dövme (3 adımdan "1" ayarı) tipik olarak pençe yastıklarının görünür ve uzun süreli bir dövmesini oluşturmak için yeterlidir.
EKİPMAN - genotipleme
Elektroforez sistemi, yatay, Geniş Mini– Alt Hücre GTBIO– RAD170– 4405Tipik elektroforez parametreleri, 10 cm'lik bir jel için 6 V/cm'de elektrik alan kuvveti ve 25 dakika süredir.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini Termal DöngüleyiciBIO-RADPTC-1148EDUΔ'daki Tor1a geni için PCR reaksiyonlarımız; E-torsinA knock-in fareler aşağıdaki gibidir: 94 & # 176'da 1 döngü denatürasyon; 3 dakika boyunca C, 94 & # 176'da 35 döngü denatürasyon; 30 saniye boyunca C, 58 & # 176'da tavlama; 30 saniye boyunca C, 72 & # 176'da uzatma; 2 dakika boyunca C. Bunu 72 & # 176'da son uzatma takip ediyor; 10 dakika C ve 4 &# 176;C'de tutun.
Güç kaynağı, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
EKİPMAN - hücre kültürü
Otomatik hücre sayacı, KontesGIBCO-InvitrogenC10310Bu otomatik hücre sayacı, canlı ve ölü hücrelerin yoğunluklarını ayrı ayrı ölçer (sırasıyla lekelenmemiş ve tripan mavisi ile lekelenmiş). Optimum yoğunluk ölçüm aralığını bilmek önemlidir: kullandığımız sayaç, 1 x 105< / sup> ile 4 x 106< / sup> hücre / ml aralığında en yüksek doğruluğa sahiptir. Ölçülen hücre yoğunluğu değerleri önerilen aralığın dışına çıkarsa, yeniden süspansiyon hacmini uygun şekilde ayarlayın.
Biyolojik Güvenlik Kabini, Sınıf II, Tip A2NUAIRENU-425-400Bu başlık, beyin diseksiyonu hariç tüm hücre kültürü prosedürleri için kullanılır.
CO2 İnkübatör, AutoFlow, Nem Kontrollü Su CeketiNUAIRENU-4850
Yatay Temiz TezgahNUAIRENU-201-330Bu temiz tezgah beyin diseksiyonu için kullanılır ("Beyin Diseksiyonu ve Hücresel Dissosiyasyon" 3.1.1 ve 3.1.2 adımları).
Orbit LS Düşük Hızlı ÇalkalayıcıLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Süper Hızlı SantrifüjFisher46910 (santrifüj)/46922 (rotor)
- dövme konsantrasyon : 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (ileri), 5'-CGT GTG GCT GTT GTT GTT GCT GAG GTA-3' (geri) 498-bp amplikon için, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (ileri), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (ters) 983-bp amplikon için, hazırlanmıştır

Kaynaklar

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793(2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034(2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245(2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626(2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844(2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895(2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373(2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389(2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634(2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965(2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703(2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257(2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111(2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633(2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Primer Nöronal KültürlerGlial Besleyici TabakaDNA EkstraksiyonuPCR AmplifikasyonuJel ElektroforeziBeyin DiseksiyonuDoku SindirimiHücre DissosiyasyonuNöronal Ekimi
Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.