Biz terminali eritropoezin erken ve geç aşamaları masaya bir in vitro fare fetal karaciğer erythroblast kültür sistemi sunuyoruz. Bu sistem, farklı gelişim aşamasındaki özel genlerin işlevsel analiz kolaylaştırır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Fetal Karaciğer Kültür Sistemi Terminali Eritropoiesis Erken ve Geç Dönemlerinde Hedef Gene İşlevleri teşrih etmek
Bu makalede
Özet
Özet
Eritropoez hızla birimleri oluşturan eritroid koloni (CFU-Es) bölünmesiyle ardından taahhüt eritroid patlama oluşturan birimler (BFU-Es) ile başlayan dinamik bir süreç gerektirir. CFU-Es sonra hücreler morfolojik olarak algılanabilen ve genelde bağlantı eritroblastlarda olarak adlandırılır. Terminal eritropoezin çalışma için zorluklardan biri kronolojik bir şekilde gen fonksiyonlarını incelemek için deneysel yaklaşımların olmaması. Bu protokol, biz terminali eritropoezin erken ve geç evrelerinde gen fonksiyonlarını belirlemek için benzersiz bir strateji belirlemelidir. Bu sistemde, bir fare fetal karaciğer Ter119 (olgun eritroid hücre işaretleme maddesi) negatif Eritroblastlar saflaştırılmış ve cDNA veya ilgi duyulan genler için küçük bir saç tokası RNA (shRNAs) eksojen ekspresyonu ile transduse. Hücreler, bundan sonra, eksojen cDNA veya shRNAs izin verirken 12 saat boyunca da projenitör sahne korumak Eritropoietin (EPO) dışındaki ortam ihtiva eden büyüme faktörleri kültürlendiifade etmek. Hücreler, egzojenez genetik malzeme, daha ifade edildi, hücre farklılaşmasını ve çoğalmasını uyarmak için 12 saat sonra EPO ortamına değiştirildi. Bu protokol, terminal eritropoezin erken evre gen fonksiyonlarının analizini kolaylaştırır. Geç aşama terminali eritrosit oluşumunu çalışmak için, hücreler hemen transdüksiyon sonra EPO ortamı içinde kültürlenmiştir. Transduse genetik malzeme olarak ifade edilmiştir, bu durumda, hücreler daha önce, terminal eritropoezi geç dönem için farklılaştırılmıştır. Biz terminali eritropoezin farklı aşamalarında detaylı gen fonksiyonlarını anlamak yardımcı olacak bu stratejinin genel bir uygulama önerilir.
Giriş
Eritrosit oluşumu, eritrositler olgunlaşması için multipotent hematopoetik kök hücrelerin farklılaşması işlemidir. Bu kademeli işlem, ilgili eritroid patlama oluşturan birimler (BFU-Es), hızla bölünen eritroid koloni oluşturan birimler (CFU-Es) ve morfolojik olarak algılanabilen birçok eritroblast 1,2 oluşumunu kapsamaktadır. CFU-E projenitör hücrelerin Terminal eritropoezis sıralı eritropoietin bağımlı ve bağımsız aşamaları 2,3 içerir. Terminal eritropoezi erken aşamasında, eritropoetin (EPO), hücre yüzeyi üzerinde kendi reseptörüne bağlanan ve hücre apoptozu önlemez ve hızlı hücre bölünmesi ve gen ekspresyonunu teşvik 1,4 aşağı doğr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol açıklanan deneyler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.
Kültür ortamına hazırlanması 1.
- Fibronektin çözeltisi hazırlayın. , Insan fibronestini (1 mg) ile bir şişe su 1 ml ilave edilir. Çalkalama olmaksızın 30 dakika boyunca doku kültürü kaputu çözeltisi bırakın. 20 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyona yapmak için PBS, 50 ml toplam sıvı transferi ve yavaşça karıştırın. Plakası (aşağıya bakınız) kaplamadan önce fibronektin çözelti taze olun.
- Epo serbest ortamda (SCF orta) 50 ml hazırlayın. Taze yapıldığ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1, deneysel stratejileri açıklamaktadır. Bu protokol, terminal eritropoezi erken ve geç aşamalarında sinyal molekülleri Hedef alma fonksiyonları için iki bağımsız koşulları oluşur. Ter119 negatif Fetal karaciğer Eritroblastlar E 13.5 fare fetüs saflaştırılmıştır. Fetal karaciğer eritrosit önce ve saflaştırma işleminden sonra, akış sitometrik analizi ile arıtma (Şekil 2A ve 2B) etkili olduğunu gösterdi. Terminal erythropoiesis (Şekil 1, kesik çizgi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada kronolojik fare fetal karaciğer terminali eritropoezi analiz etmek için eşsiz bir sistem sunuyoruz. Farklı kültür koşulları uygulama sayesinde, başarıyla erken ve geç evrelerinde terminal eritropoezi disseke. Bu çok işlevli genlerin mekanizmaların belirlenmesi özellikle önemlidir. Örneğin, Rac GTPazlar terminali eritropoezin farklı aşamalarında önemli rol oynar. Terminal eritropoezis etkiler, hücre farklılaşması ve çoğalması erken evrede Rac GTPases engellenmesi. Diğer yandan, hücre farklılaşmasını, proliferasyon.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH R00HL102154 tarafından desteklenen ve P Ji Hematoloji bilim adamı ödülü bir Amerikan Derneği oldu.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | GEMINI Biyo-ürün | 700-102P | |
| Penisilin-Streptomisin çözeltisi | Hiklon | SV30010 | 100x |
| L-Glutamin | Hiklon | SH30034.01 | 200 mM |
| Fare FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Fare Rekombinant İnterlökin-6 (IL-6) | GEMINI Biyo-ürün | 300-327P | |
| Fibronektin | BD Biosciences | ||
| Sığır Serumu Albümini (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | IMDM'de %10 stok |
| Eritropoietin (Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3.000 U / ml stok |
| Streptavidin parçacıkları Artı | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Mıknatıs | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polipropilen Yuvarlak Tabanlı Tüp, 5 ml | FALCON |
Kaynaklar
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
