Method Article

Protein Analiz Sürekli Tanıma Desenler oluşturma Elektronik Dil

DOI:

10.3791/51901

⸱

September 16th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Structure et Propriétés d'Architectures Moléculaires, Institut Nanosciences et Cryogénie, CEA-Grenoble, 2Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d'Orsay, Université Paris-Sud, 3Institut de Biologie Structurale

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektronik dilin (eT) inşası için, algılama malzemelerinin tasarımını ve üretimini büyük ölçüde basitleştiren ve eT'nin sıvıdaki numuneler için sürekli evrim profilleri ve manzaraları oluşturmasına izin veren yeni bir yaklaşım tanımlanmıştır. Elde edilen eT, ayrımcılık gibi yaygın protein analizi için etkilidir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokolde, protein analizi için elektronik dillerin (eT) inşası için algılama malzemelerinin tasarımını ve üretimini basitleştirmek için kombinatoryal bir yaklaşım geliştirilmiştir. Farklı fizikokimyasal özelliklere sahip, yapı taşları (BB'ler) olarak kullanılan az sayıda basit ve kolay erişilebilir molekülün, değişen ve kontrollü oranlarda karıştırılması ve karışımların bir prizmanın altın yüzeyi üzerinde kendi kendine bir araya gelmesine izin verilmesiyle, protein algılama için uygun özelliklere sahip bir dizi kombinatoryal yüzey oluşturuldu. Bu şekilde, çok sayıda çapraz reaktif reseptör hızlı ve verimli bir şekilde elde edilebilir. Bu tür bir kombinatoryal çapraz reaktif reseptör (CoCRR'ler) dizisini yüzey plazmon rezonans görüntüleme (SPRi) gibi bir optik algılama sistemi ile birleştirerek, elde edilen eT, bağlanma olaylarını gerçek zamanlı olarak izleyebilir ve sıvıdaki numuneler için 2D sürekli evrim profili (CEP) ve 3D sürekli evrim manzarası (CEL) dahil olmak üzere sürekli tanıma modelleri oluşturabilir. Böyle bir eT sistemi, yaygın saflaştırılmış proteinlerin ayırt edilmesi için etkilidir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hassas ve hızlı protein algılama yöntemleri tıbbi teşhis ve Proteomikte çok önemlidir. Böyle bioçipler gibi klasik protein-tespit diziler, "kilit ve anahtar" tanıma ilkesine dayalı ve bu aptamers, antikorlar, veya taklitçi gibi belirli reseptörleri gerektirir.

Son yıllarda, insan koku duyusunun ve tadına bakma esinlenerek diferansiyel algılama alternatif 1 olarak ortaya çıkmıştır. Bu elektronik burun / dil (eN / eT) yaklaşımı hedef moleküller için son derece spesifik veya seçici olması gerekmez çapraz-reaktif reseptörleri (crrs), bir dizi Analitlerin farklı bağlanmanın dayanmaktadır böylece zahmetli aşmak için izin yüksek ölçüde seçici reseptörleri geliştirme süreci. Onun teşhisine izin veren, bir parmak izi gibi, her bir örnek için ayrı bir desen oluşturur tüm reseptörlerinin birleşik yanıttır.

ELEC gelişimi için iki önemli zorluklaretkin bir protein algılama tronic burun / yay yapısal olarak benzer bir analit ve bağlanma olayı için uygun olan iletim sistemine arasında ayrım yeteneğine sahip algılama elemanlarının üretimi. Şimdiye kadar yapılan çalışmalar dizi gelişme 2 için çeşitli yaklaşımlar bildirdi. Bir çalışmada Örneğin proteinlerin bir dizi-bazlı kimlik çeşitli amino asitler veya proteinler ve ücret için farklı çevresel birimlere afinite için bir hidrofobik çekirdeğin sahip diferansiyel reseptörleri sağlamak dipeptidlerin için karboksil grupların birleştirilmesi ile, tetra-carboxyphenylporphyrin türevlerinden hazırlanabilir crrs kullanılarak geliştirilmiştir kazandıran farklı bağlama. Bu sistemi kullanarak, farklı proteinler ve protein karışımları analitlerle etkileşimin ardından 3,4 reseptörlerinin floresanlık sönmesini ölçülerek tespit edilmiştir. Başka bir çalışmada, hexasubsti bir birleştirici şekilde sentezlendi, tripeptid ve boronik asit kısımları içeren 29 crrs oluşan bir kütüphanedeğiştirilmemiş benzen iskele bir göstergesi alım kolorimetrik algılama 5,6 proteinleri algılama için geliştirilmiştir. Böyle bir tasarımla, her reseptör glikoproteinlerden proteinlerinin ayrımında destekli peptid kollardaki varyans göre protein ve boronik asitler ile farklı bağlama kapasitesini göstermiştir. Daha yakın zamanda, bir anyonik floresan polimer poli (p-phenyleneethynylene) (PPE) konjüge edilmiş farklı katyonik fonksiyonalize altın nanopartiküllerinin oluşan bir dizi tespit etmek ve tanımlamak için proteinleri 7 oluşturuldu. Rekabetçi protein için farklı tanıma desen üreten bir protein analit arasındaki bağlanma ve floresan yeniden PPE / altın nano partiküler kompleksleri söndürüldü. Bu çalışmada, fonksiyonalize nanopartikül-protein etkileşimleri nanopartikül uç gruplarının fizikokimyasal özellikleri değiştirilerek ayarlanmıştır. Ayrıca bu yaklaşım, karmaşık ve protein açısından zengin bir ortamda bu protein analizi için etkili olduğu gösterilmiştirfizyolojik ilgili konsantrasyonlarda insan serumu gibi, böylece hastalık durumlarının 8 teşhisi için gerçek örnekleri profil olarak eT potansiyelini gösteren.

Çok umut verici olsa da, bu sistemler bazı sınırlamaları vardır. Onlar tasarımı ve oldukça karmaşık yapılara sahip 5 ila 29 crrs sentezlenmesi gerektirir. Buna ek olarak, her bir ölçüm takip sıfırlanır koku sistemi farklı olarak, protein, numune başına bir algılama dizisi hazırlamak gerekir. Son olarak, gerçek zaman bağlanma olguları arasında son derece zordur.

Bu bağlamda, bir kombinatoryal yaklaşım, farklı fiziko-kimyasal özelliklere sahip, basit ve kolayca erişilebilir moleküllerinin küçük bir numara kullanarak sürülmüştür (negatif yüklü bir nötr, pozitif yüklü, hidrofilik, hidrofobik, vb.) Yapı blokları (BB) 9 gibi. Ile karışımlar değişen BBS ve kontrollü oranlarda karıştırılması ve izin vererek bir altın yüzey tarafından monteprizma, protein bağlanması için uygun özelliklere sahip birleşik yüzeyler bir dizi oluşturuldu. Özellikle, bu sistem üzerindeki kendinden düzenlenen tek tabakalar, hızlı ve verimli bir şekilde üretilebilir olması için çeşitli birleştirici çapraz-reaktif reseptörleri (CoCRRs) sağlayacak şekilde, son derece farklı bir şekilde yüzey özellikleri, bir dizi kolay bir ayarlama sağlar. Protein algılama optik tespit sistemi kullanılarak gerçekleştirildi, plazmon rezonans görüntüleme (SPRI) yüzey. Kısaca, bir LED'den gelen geniş bir ışın, polarize ışık monokromatik prizma yüzeyi üzerindeki bütün CoCRR dizi aydınlatır. Bir yüksek çözünürlüklü CCD video kamera CoCRR dizinin bütün noktalar arasında gerçek-zamanlı farkı görüntüler sağlar. Bu bağlayıcı olaylar ve kinetik süreçler 10 hakkında detaylı bilgi veren CoCRR dizinin yüzeyinde yerel tüm değişiklikleri yakalar. Bu arada, görüntüleme yazılımı yardımı ile, noktalar karşılık SPR görüntüleri otomatik olarak yansıtma Versu varyasyonları dönüştürülürSensogramlar adı verilen kinetik bağlanma eğrileri, bir dizi üreten bir zaman. Bu nedenle, bağlama SPRI etkinlikleri etiketi içermeyen, eş zamanlı, paralel ve gerçek zamanlı gözlem sağlar. Ayrıca, elde edilen CoCRR dizi protein analizi için yeniden üretilebilir ve tekrar kullanılabilir.

Bu protokol, yapı blokları olarak sadece iki küçük molekülleri kullanarak elektronik dil birlikteliğinin yapımını da açıklar ve SPRI ile elde edilen kesintisiz tanıma kalıpları temel alan ortak proteinlerin analizi için uygulanmasını göstermektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli Çözümleri ve Protein Örneklerinin 1. Hazırlık

  1. , 50 mM NaH 2 PO 4, 50 mM NaCl ihtiva eden fosfat tampon çözeltisi (PBS-G) 100 mi, pH 6.8 'de% 10 gliserol hazırlayın.
  2. PH 7.4 olan 10 mM HEPES, 150 mM NaCl,% 0.005 Tween 20 içeren HEPES tampon çözeltisi 250 ml hazırlayın.
  3. PBS-G 0.2 mM'de laktoz (Şekil 1) sülfatlanmış yapı bloğunun 1 (BB1), laktoz ve yapı taşı 2 (BB2) içinde bir stok çözelti hazırlayın.
  4. 1 uM A rakis hypogaea lektin (AHL) 500 nM, miyoglobin de ve 500 nM'de lisozim: HEPES, protein çözeltisinin 1 ml hazırlayın.
  5. Ultra-saf su içinde% 1 SDS ile 20 ml hazırlayın.

CoCRR Array 2. Hazırlık

  1. % 75 oksijen,% 25 argon, 0.6 mbar, gücü 40 W: Bu koşullar altında 3 dakika boyunca plazma temizleyici ile kullanımdan önce 48 saat prizma altın yüzeyini temizleyin
  2. Onbir saf ve karışık Solutio hazırlayın[BB1] / ile BB1 ​​ve BB2 ns ([BB1] + [BB2]), PBS-G içinde 0,1 mM toplam bb konsantrasyonda% 10 artışlar ile, 0 ile% 100 arasında oranları.
  3. Depozit toplam 44 noktanın (Şekil 2), her oran için dört kat olarak temassız bir gözcü kullanılarak prizma yüzeyi üzerindeki bu saf ve karışık çözümler 8 nl damlacıkları.
    Not: PBS-G çözeltisine,% 10 gliserol, solvent buharlaşması ve çökelme sonrası bb konsantrasyon değişimini azaltmak için çok önemlidir.
  4. Ultra saf su 1 ml içeren bir Petri kabı içinde prizma yerleştirin ve altın yüzeyde BB1 ​​ve BB2 kendini düzenlemesinden RT'de göre O / N bırakın. Burada, bu karışık SAM ortalama yüzey bileşimi yerleştirme karıştırılmış çözeltisinin bileşimi (Şekil 3) 11 yansıttığı varsayılmaktadır.
  5. Ultra-saf su ile iyice yıkayın ve daha sonra prizmanın bir argon akışı altında kurutun.

3. Protein Algılama SPRI tarafından

  1. Incubato ayarlayınR'nin SPRI cihaz, protein algılama sırasında sıcaklık değişiminin neden olduğu kırılma indeksi değişiklikleri önlemek için 25 ° C sıcaklıkta yerleştirilir.
  2. (PEEK), bir bilgisayar kontrollü bir şırınga pompası, gaz alıcı ve 6 bağlantı noktası, orta basınçlı enjeksiyon valfına bağlanan akış hücresinin (Şekil 4) 10 ul polieter eter keton olmayan bir işlevselleştirilmiş durulama prizma yerleştirin. Taze süzülmüş ve tampon HEPES çalışan degaze ile akış sistemi doldurun.
  3. Durulama prizma çıkarın ve akış hücresi CoCRR dizi içeren prizma yerleştirin. 100 ul / dakika akış hızında, HEPES. CCD kamera yardımı ile hızlı çalışan tampon geçirilerek prizma yüzeyi üzerinde mevcut olan hava kabarcıklarını.
  4. Dizinin iyi bir tezat görüntü ve SPRI sistemine entegre yazılım yardımı ile esaslı ilgi alanı için aynı çapa sahip bir daire çizerek, her nokta için çalışma alanı tanımlayın.
  5. Yansıtan temsil plazmon eğrileri, İztüm noktalar için olay açısı, fonksiyonunda ivity eğrileri.
  6. Yansıtma eğrilerinin en yüksek yamacında çalışma açısının (kinetik eğrileri kaydedilmiş olacak hangi pozisyon) seçin. Kinetik ölçümleri için seçilen çalışma açısına düzeltmek için tarama ayna döndürün.
  7. Tüm noktalar için yansıma sinyal istikrarlı ve sürekli kadar akış sisteminde HEPES çalışmaya devam eder.
  8. Konumu "yük" enjeksiyon valfi ile numune döngü (500 ul) içine şırınga ile 1 ml AHL çözüm enjekte. Ardından "enjeksiyon" konumuna enjeksiyon valfi koydu. Tüm protein enjeksiyonu için kullanılan akış hızı 100 ml / dak idi.
  9. Tüm noktalar aynı anda zamana karşı yansıtma değişimlerini izleyerek kinetik ölçümler başlayın.
  10. Proteini enjekte sonunda, 8 dakika boyunca tampon maddesi ile dizi yıkayın. Son olarak, yeniden 1 ml% 1 SDS ile enjekte edilir.
  11. Diğer p için aynı prosedürü tekrarlayınroteinler.

4. Veri İşleme ve Analizi

  1. Akış hücreye protein çözeltisi girişi sonra, bağlayıcı molekül ortaya çıkar ve plazmon eğrilerinin bir kayma ve yansıtma bir varyasyonunu neden olur. Adı geçen görüntü edinim program sensogramlarını (Şekil 5B) vererek SPR görsel Şekil 5A verir gri skala seviyelerinin, ölçülen ışık şiddeti değerleri dönüştürür ve zamana karşı yansıtma değişimini üretir.
  2. [BB1] karşı her proteini enjekte sonunda yansıtma (R%) çizmek için bir matematik bilgisayar yazılımını kullanın / ([BB1] + [BB2]) Her bir numune için 2D sürekli evrim profili (CEP) oluşturmak için oranı (Şekil 5C).
  3. [BB1] / ([BB1] + [BB2]) sensörgramlar içinde oranı Ekle (Şekil 5B) her proteinin (Şekil 5D) için 3D sürekli evrim manzara (CEL) oluşturmak için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ortak protein analizi için elektronik dil yeteneğini prob, üç proteinler kullanıldı: AHL, miyoglobin ve lizozomunu. Şekil 6'da gösterildiği gibi, her bir protein için, ayrı bir 2D sürekli bir gelişim profil CEP, ve arkadaşları tarafından elde edilmiştir.

Buna ek olarak, her bir protein için, zamana bağlı bir sürekli model tanıma gerçek zamanlı adsorpsiyon ve desorpsiyon kinetiğini takip edebilir SPRI, sayesinde, 3D sürekli evrim yatay (CEL) oluşturuldu denir. Şekil 7...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eT yapımı için en kritik adımlar sisteminin iyi tekrarlanabilirlik sağlamak için varız. Örneğin, BB1 ve BB2 ait on saf ve karışık solüsyonlarda gliserol% 10 unu ilave, kullanımdan önce, standart bir prosedür ile prizma altın yüzey temizleme BB prizma altın yüzey üzerinde kendi kendine montaj sırasında çözücü buharlaşmasını önlemek için, Her [BB1] için birden çok tekrar / ([BB1] + [BB2]) oranı, vs bırakılması. SPRI protein tespiti için olduğu gibi, çalışma açısının seçimi kritiktir. Genellikle, bu yansı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Laurie-Amandine Garçon'a destek için Grenoble'daki LANEF'in doktora hibesini kabul etmek istiyor. Bu çalışma, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR-grant 06-NANO-045) tarafından mali olarak desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
SPRi aparatı Horiba Scientific-GenOpticsSPRi cihazı, 25 ° C'de sıcaklık ayarlı bir inkübatöre yerleştirilir.
İnkübatörMemmert
Şırınga pompası Cavro bilimsel cihazlarCavro XLP 6000
Micro Elite Gaz Giderici AlltechAT590507
6 orta basınç enjeksiyon vanasıUpchurch ScientificKullanılan enjeksiyon döngüsünün hacmi 500
Femto plazma temizleyici (versiyon 7)Diener Elektronik2 kanallı on-line gaz giderme sistemi.
GözcüSiliflowTemassız piezoelektrik gözcüdür.
SPRi-BiochipHoriba Scientific-GenOptics36000067Prizma, ince bir altın film (45 nm) ile kaplanmış ve görüntüleme amaçlı özel olarak geliştirilmiş yüksek kırılma indisine sahip bir cam prizmadan yapılmıştır.
Erythrina cristagalli lektin Sigma-AldrichL5390
Arachis hypogaea lektin Sigma-AldrichL0881
MiyoglobinSigma-AldrichM1882
LizozimSigma-AldrichL6876
CXCL12 ve alfa;Dr. Hugues Lortat-Jacob tarafından sağlanmıştır; hazırlık ayrıntıları için, referans 9
CXCL12&gamma'daki destekleyici bilgilere bakın;  Dr. Hugues Lortat-Jacob tarafından sağlanmıştır; hazırlık detayları için, Prof
. David Bonnaffé tarafından sağlanan referans 9 Laktoz'daki
Sülfatlanmış laktozdaki; hazırlık detayları için, referans 9
Gliserol içindeki destekleyici bilgilere bakın.Sigma-AldrichG5150
SDSSigma-AldrichL4509
Tween 20Sigma-Aldrich274348
HEPESSigma-AldrichH3375
Sodyum fosfat monobazikSigma-AldrichS0751
Sodyum klorürSigma-AldrichS3014
destekleyici bilgilere bakın; hazırlık detayları için,Prof. David Bonnaff tarafından sağlanan referans 9 destekleyici bilgilere bakın

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
  2. Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
  3. Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
  4. Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
  5. Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
  6. Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
  7. You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
  8. De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
  9. Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
  10. Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
  11. Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Electronic TongueProtein AnalysisCombinatorial ApproachSurface Plasmon Resonance ImagingContinuous Evolution ProfileContinuous Evolution LandscapeCross Reactive ReceptorsSelf Assembly MonolayersBuilding Block MixturesKinetic Binding Curves

Related Articles