Yöntem makalesi

Gelişmekte Embriyonik Fare Kalp Vana Bölgesi'nde Protein İzolasyonu

DOI:

10.3791/51911

⸱

23 Eylül 2014

 ,  , 
1McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 2New York-Presbyterian Hospital/Weill-Cornell Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genç embriyonik fare kapakçıklarında protein ekspresyonunun analizi, mevcut sınırlı doku nedeniyle engellenmiştir. Bu el yazması, western blot analizi için gelişmekte olan embriyonik fare valf bölgelerinden protein hazırlamak için bir protokol sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blot analizi, protein seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bununla birlikte, küçük doku örnekleri için bu analiz yöntemi, ilgilenilen bir proteini tespit etmek için yeterince hassas olmayabilir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, yetişkin insan kalp kapakçıklarından protein elde etmek için protokolleri inceledik ve bu protokolleri gelişmekte olan erken embriyonik fare meslektaşları için değiştirdik. Kısaca, aort kapağı ve çevresindeki aort duvarı dahil olmak üzere fare embriyonik aort kapak bölgeleri, proteaz inhibitörleri ile Tris bazlı bir lizis tamponunun mümkün olan minimum hacminde toplanır. Üreme stratejisine dayalı olarak gerekirse, homojenizasyon için dört embriyonik aort kapak bölgesi havuzlanmadan önce embriyolar genotiplenir. Homojenizasyondan sonra, numuneyi bir SDS-PAGE jeli ve ardından western blot analizi üzerinde çalıştırmak üzere denatüre etmek için SDS bazlı bir numune tamponu kullanılır. Protein konsantrasyonu, spektrofotometrik protein miktar tayini tahlilleri kullanılarak miktar tayini yapılamayacak kadar düşük kalmasına ve sonraki analizler için numune kalmasına rağmen, bu teknik, her biri yaklaşık 1 μg protein veren dört embriyonik gün 13.5 fare aort kapak bölgesinin havuzlanmış örneklerinden western blot yoluyla fosforile proteinleri başarılı bir şekilde tespit etmek ve yarı miktar tayini yapmak için kullanılabilir. Bu teknik, erken embriyonik fare kapak gelişimi sırasında hücre sinyal yolu aktivasyonu ve protein ekspresyon seviyelerini incelemek için faydalı olacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein ekspresyon seviyelerini belirlemek ve ölçmek için güçlü olmak bir hayvan ve hücre tabanlı deneyler için standart bir tekniktir. Ancak rağmen uzun süreli bir anda civciv ve fare hem de 1,2 immünohistokimya ile sınırlıdır gelişimi sırasında, bu özel doku içindeki protein ifadesi değerlendirilmesi, erken dönemde embriyo gelişimi kalp kapağı ilgi. En model organizmaların (örneğin, civciv ve fare) gelişmekte vanaları protein ifadesini nicel zorluk parçası elde edilebilir protein miktarını sınırlayan vanalar, küçük boyutu. Böylece, kantitatif analiz için, araştırmacılar genellikle müteakip kantitatif PCR veya mikroarray analizi 2-5 RNA ekstraksiyon ve amplifikasyon güveniyor. Bununla birlikte, RNA ve protein ekspresyon seviyeleri 6 tamamen bağıntılı değildir, bu nedenle RNA ekspresyonu odaklanan herhangi bir sinyal meydana gelen pek çok değişiklik sıkı bir hesap sağlayamazgelişmeler sırasında çeşitli zamanlarda yol. Mevcut metodolojisinde bu sınırı dayanarak, bu prosedürün amacı güvenilir önemli olan çeşitli sinyal yollarında meydana gelen değişikliklere kantitatif analiz için gelişmekte embriyonik fare kalp kapak bölgelerden proteinin yeterli miktarda elde etmek için bir protokol geliştirmek oldu Bu doku olgunlaşması.

Embriyonik vanalar zaten yaygın RNA izolasyonu ve sonraki gen ekspresyon analizi 2-5 için fareden disseke edilir. Ancak bu çalışmalar, akış aşağı sinyali etkileyebilir translasyon sonrası protein modifikasyonları yer tespit algılanmasını izin vermez yolu aktivasyonunun, bir sinyalleme okuma olarak gen ekspresyonu ile sınırlı kalmıştır. Bir başlangıç ​​noktası olarak RNA izolasyon teknikleri kullanarak, ilgi konusu bölgelerin kesme ile başladı. Bizim faiz fosforillenmiş proteinleri tespit Çünkü sinyalizasyon pat göstergesidir olduğunuaort kapak geliştirme (E13.5-14.5) belirli bir süre boyunca Hway aktivitesi, bu fosfat içermeyen Tris tamponu içinde bütün tahlil yapıldı ve fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile bir Tris-bazlı liziz tamponunda valfleri toplanır. Bizim özel durumda, sadece aort kapak bölgeleri toplandı, ancak pulmoner kapak bölgesi kolaylıkla aynı anda elde edilebilir. Valf bölgeleri, homojenize edilir ve şu anda yetişkin kalp valf 7 protein ifadesini incelemek için kullanılan bir numune tampon maddesi ile birleştirildi. Küçük örnek hacimleri (örneğin, 2 ul) kullanılarak ve aynı genotipi ile embriyolardan valf bölgeleri bir araya getirerek, biz embriyonik günde 13.5 8 de fosforlu ve fosforillenmemiş proteinleri tespit başardık. Valf bölgeler dondurulmuş ve lizis tamponunda saklanabilir için araya önce gerekirse, embriyolar genotiplenmiştir edilebilir.

Bu teknik, hücre signalin değerlendirmek için kullanılabilir araçları kümesi genişletmektedirg gelişimi sırasında yollar ve özellikle gelişmekte olan kalp kapakçıkları için, immünohistokimyaya nicel bir iltifat sağlar. Bu teknik gelişim kardiyoloji değil, aynı zamanda sınırlı bir doku ihtiva eden bölümleri ile ilgili erken evre embriyoları ile çalışan tüm gelişim biyolojistlere sadece yararlı olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tüm deneyler Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1. Tüketim Aort Kapağı

  1. Ilgi embriyonik aşaması için onaylanmış bir ötenazi tekniği kullanılarak, arzu edilen gelişme embriyonik gün (E) yavrular ile hamile bir fareyi euthanize.
  2. Hamile kadın karnı sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. Uzak iç organlardan alt karın yukarı ve cilt ve kas kaldırın ve uterin boynuz erişime izin vermek için açık dişinin alt karın boşluğuna teşrih.
  3. Uterin boynuzu almak için, forseps forseps ile serviks ve dikkatlice kesilmiş kaudal tutun. Yerinde boynuz tutan herhangi bir bağ dokusu kesme, uterin boynuz kaldırın ve fallop ile uterin horn kavşak keserek kaldırma işlemini tamamlamak.
  4. Bir Petri kabı içeren col disseke uterin boynuz yerleştirmekd 0.1 M Tris tamponu (pH 7.6) ve gerektiği gibi yıkayın. Sonra, açık uzunluğu-bilge embriyonik keselerinin maruz uterin boynuzu kesti.
  5. Embriyo göstermek için, plasenta ve embriyo kavşağında bir embriyonik kese kesip ve embriyo serbest göbek damarları kesilmiş. Soğuk 0.1 M Tris tampon içeren ikinci bir Petri kabındaki kesilen embriyo yerleştirin. Sonraki embriyo için hazır olana kadar buz kalan undissected embriyolar ile ilk Petri dönün.
  6. Embriyonun içinde göğüs duvarı erişimi geliştirmek için, embriyoyu başını kesmek. Genotipleme gerekli ise, kaldırma ve buz üzerine yerleştirilir, bir Eppendorf tüpü içinde ilave bir doku parçası kaydedin.
  7. Sırtında embriyo yerleştirin ve ön ayakları yakınında, göğüs kafesinin yan boyunca dikey göğüs duvarı kesti ve yatay diyafram üstü kalp görselleştirmek için. Ardından, kalp maruz göğüs duvarı açın.
  8. Büyük damarların boyunca yüksek tutmak için forseps kullanarak, forseps kullanarak kalp kaldırın ve aşağıdaki damarları kesilmiş.n kalbi boşaltmak için forseps yukarıdaki kesti. Akciğer damarlarında kesilmemiş kalırsa, akciğerler kalp ile kaldırılmış olabilir ve devam etmeden önce çıkarılmalıdır.
  9. Kesme ve valfın seviyesinden pulmoner arter çıkarmak; Burada tarif edilen embriyonik aşamada, pulmoner arter kapak bölgesinden, ayrımda yardım eden, hafif opaktır. Sadece pulmoner kapak altına indi trabeküler ventriküler miyokard kaçınarak ve bu bölge de ilgi ise adımda 1.10 açıklandığı gibi toplamak. Burada ve bir sonraki aşamada önce, liziz tamponu içinde toplama uzak ilgilenilen bölgesinde aşırı Tris tamponu çizmek için kılcal hareketi vardır.
  10. Dikkatle vananın seviyesinden, aort kapak aort distalinden kaldırmak; pulmoner arter gibi, aort, uzaklaştırılması yardım, bu embriyonik aşamada biraz opak kalır. Tekrar trabeküle ventriküler miyokard kaçınarak, sadece aort kapak altında kesilmiş ve aktarmakBuz üzerinde proteaz ve fosfataz inhibitörlerini ihtiva eden (Malzeme tabloda tarif edilmiştir) 2 ul liziz tamponu ile bir Eppendorf tüpüne, forseps kullanılarak valf.
  11. Vanalar ayrı Eppendorf tüp her bir valfi toplayarak, tüm embriyolardan kesilip edilene kadar tekrarlayın 1,6-1,10 adımları. Tüm embriyolar aynı genotipi varsa, tüm supap tek bir Eppendorf tüpü içinde toplanabilir.
  12. Genotipleme birlikte havuz valflarına belirlemek için gerçekleştirilecekse, hemen bir sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de lisis tamponu içinde örnekleri yer. Numuneler daha sonra (adım 2.1.1) genotipleme sonra toplanmış olabilir.

2. Protein Ekstraksiyonu

  1. 1 dakika tüpün altındaki liziz tamponunda dokuları toplamak için 13.100 x g buz ve santrifüj üzerine toplanır dokuları çözülme.
    1. Embriyolar genotiplendirilmiştir, hafifçe toplamak ve havuz lizis tamponu benzer genotipler ile embriyolar valf bölgeleri içeren bir pipet kullanın. Güçlü bir b sağlamakörnek önerilir başına, E 13.5 embriyolardan 3-4 kapak bölgeleri birleştirilmelidir.
    2. Tüm embriyolar aynı genotipi ve tüm valf bölgeler Aşama 1,10 araya getirilerek durumunda Adım 2.2 'de tarif edildiği gibi, örneğin tamamına lize.
  2. Elde edilen birleştirilmiş numune miktarını kontrol edin ve 40 ul bir toplam hacim liziz tampon eklemek; Daha sonra, bozabilir ve Eppendorf tüpleri 5 mm paslanmaz çelik boncuklar kullanarak örnekleri homojenize. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, 50 Hz'de 2-4 dakika için lize edici çalıştırın. Kısaca Spin tüpler, çözünmeyen enkaz geride bırakarak yeni tüplere (~ 13.100 1 dakika xg), ve transfer örnekleri.
  3. Hazırlama ve bu Eslami ve ark 9 gibi bir protokol izlenerek, SDS-PAGE ve Western blot analizi daha sonra aktarım için ayrı örnekler. Bir yükleme kontrol proteini için Kurutma protein miktar tayini için önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu hazırlık tekniği kullanarak, E13.5 embriyolar tek aort kapak bölgelerinde fosforile Smad 1,5,8 (pSmad) tespit başardık. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, hatta bir tek valf bölgesinden izole edilmiş protein bir hafif pSmad grubu tespit etmek için yeterlidir. Sinyal yoğunluğu bir araya getirilmiş, kapak bölgelerinin sayısı artar. Önemli olarak, pSmad / β-aktin oran, farklı örnek boyutları (Şekil 1C) boyunca hemen hemen sabit kalır. Nedeniyle mevcut düşük protein seviyeleri, ay...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalp kapak bölgeleri erken embriyonik fare protein seviyelerini ölçmek ve civciv yeteneği vana gelişimi için kritik hücresel sinyal olayları anlamak için ek bir araç sağlar. Burada tarif Bizim protokol standart protein izolasyon prosedürlerinin büyük ölçüde farklı değildir. Ancak, bazı önemli adımları değiştirerek, biz başarıyla derece küçük örneklem büyüklükleri fosforile proteinleri almış. Bu sonucu elde etmek için, aşağıdaki aşamalar, özel bir önem taşımaktadır. Bu kaliteli protein elde edilir sağlamak için, buz üzer...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Andrea Portbury ve Davin Townley-Tilson'a el yazmasının eleştirel okuması için ve NIH'ye (hibe # R01HL061656) finansman desteği için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Zamanlanmış hamile fareİlgilenilen embriyonik aşamada diseksiyon
Stereoskopik mikroskopNikonSMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
MikromakasGüzel Bilim Araçları15003-08
İnce forseps, #5Güzel Bilim Araçları11251-30
Diseksiyon iğnesi sahipleriTed Pella Inc.13560
Diseksiyon iğneleriTed Pella, Inc.13561-10
Mikropipet, 20 μ l, uçlu
Lizis tamponu50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, %1 Triton
PhosSTOPRoche490684500110 ml lizis tamponuna 1 tablet ekleyin
TissueLyser LTQiagen85600
Paslanmaz çelik boncuklarQiagen69989
Mikrosantrifüj
yapılacak

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
  2. Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
  3. Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
  4. Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
  5. Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
  6. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
  7. Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
  8. Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).
  9. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
  10. Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
  11. Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Development. 127, 1607-1616 (2000).
  12. Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
  13. Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Western Blot AnaliziDoku DiseksiyonuTris Lizis TamponuSDS PAGE JeliFosforile ProteinlerH cre Sinyal YoluAort Kapa B lgesiEmbriyonik G n 13 5

İlgili makaleler