Gelişmekte Embriyonik Fare Kalp Vana Bölgesi'nde Protein İzolasyonu

Summary

Genç embriyonik fare kapakçıklarında protein ekspresyonunun analizi, mevcut sınırlı doku nedeniyle engellenmiştir. Bu el yazması, western blot analizi için gelişmekte olan embriyonik fare valf bölgelerinden protein hazırlamak için bir protokol sağlar.

Abstract

Western blot analizi, protein seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bununla birlikte, küçük doku örnekleri için bu analiz yöntemi, ilgilenilen bir proteini tespit etmek için yeterince hassas olmayabilir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, yetişkin insan kalp kapakçıklarından protein elde etmek için protokolleri inceledik ve bu protokolleri gelişmekte olan erken embriyonik fare meslektaşları için değiştirdik. Kısaca, aort kapağı ve çevresindeki aort duvarı dahil olmak üzere fare embriyonik aort kapak bölgeleri, proteaz inhibitörleri ile Tris bazlı bir lizis tamponunun mümkün olan minimum hacminde toplanır. Üreme stratejisine dayalı olarak gerekirse, homojenizasyon için dört embriyonik aort kapak bölgesi havuzlanmadan önce embriyolar genotiplenir. Homojenizasyondan sonra, numuneyi bir SDS-PAGE jeli ve ardından western blot analizi üzerinde çalıştırmak üzere denatüre etmek için SDS bazlı bir numune tamponu kullanılır. Protein konsantrasyonu, spektrofotometrik protein miktar tayini tahlilleri kullanılarak miktar tayini yapılamayacak kadar düşük kalmasına ve sonraki analizler için numune kalmasına rağmen, bu teknik, her biri yaklaşık 1 μg protein veren dört embriyonik gün 13.5 fare aort kapak bölgesinin havuzlanmış örneklerinden western blot yoluyla fosforile proteinleri başarılı bir şekilde tespit etmek ve yarı miktar tayini yapmak için kullanılabilir. Bu teknik, erken embriyonik fare kapak gelişimi sırasında hücre sinyal yolu aktivasyonu ve protein ekspresyon seviyelerini incelemek için faydalı olacaktır.

Introduction

Protein ekspresyon seviyelerini belirlemek ve ölçmek için güçlü olmak bir hayvan ve hücre tabanlı deneyler için standart bir tekniktir. Ancak rağmen uzun süreli bir anda civciv ve fare hem de ^1,2 immünohistokimya ile sınırlıdır gelişimi sırasında, bu özel doku içindeki protein ifadesi değerlendirilmesi, erken dönemde embriyo gelişimi kalp kapağı ilgi. En model organizmaların (örneğin, civciv ve fare) gelişmekte vanaları protein ifadesini nicel zorluk parçası elde edilebilir protein miktarını sınırlayan vanalar, küçük boyutu. Böylece, kantitatif analiz için, araştırmacılar genellikle müteakip kantitatif PCR veya mikroarray analizi ^2-5 RN....

Protocol

NOT: Tüm deneyler Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1. Tüketim Aort Kapağı

1. Ilgi embriyonik aşaması için onaylanmış bir ötenazi tekniği kullanılarak, arzu edilen gelişme embriyonik gün (E) yavrular ile hamile bir fareyi euthanize.
2. Hamile kadın karnı sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. Uzak iç organlardan alt karın yukarı ve cilt ve kas kaldırın ve uterin boynuz erişime izin vermek için açık dişinin alt karın boşluğuna teşrih.
3. Uterin boynuzu almak için, forseps forseps ile serviks ve dikkatlice kesilmiş kaudal tutun. Yerinde....

Results

Bu hazırlık tekniği kullanarak, E13.5 embriyolar tek aort kapak bölgelerinde fosforile Smad ^1,5,8 (pSmad) tespit başardık. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, hatta bir tek valf bölgesinden izole edilmiş protein bir hafif pSmad grubu tespit etmek için yeterlidir. Sinyal yoğunluğu bir araya getirilmiş, kapak bölgelerinin sayısı artar. Önemli olarak, pSmad / β-aktin oran, farklı örnek boyutları (Şekil 1C) boyunca hemen hemen sabit kalır. Nedeniyle mevcut düşük protein seviyeleri, ay.......

Discussion

Kalp kapak bölgeleri erken embriyonik fare protein seviyelerini ölçmek ve civciv yeteneği vana gelişimi için kritik hücresel sinyal olayları anlamak için ek bir araç sağlar. Burada tarif Bizim protokol standart protein izolasyon prosedürlerinin büyük ölçüde farklı değildir. Ancak, bazı önemli adımları değiştirerek, biz başarıyla derece küçük örneklem büyüklükleri fosforile proteinleri almış. Bu sonucu elde etmek için, aşağıdaki aşamalar, özel bir önem taşımaktadır. Bu kaliteli protein elde edilir sağlamak için, buz üzer.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zamanlanmış hamile fare			İlgilenilen embriyonik aşamada diseksiyon
Stereoskopik mikroskop	Nikon	SMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
Mikromakas	Güzel Bilim Araçları	15003-08
İnce forseps, #5	Güzel Bilim Araçları	11251-30
Diseksiyon iğnesi sahipleri	Ted Pella Inc.	13560
Diseksiyon iğneleri	Ted Pella, Inc.	13561-10
Mikropipet, 20 μ l, uçlu
Lizis tamponu			50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, %1 Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	10 ml lizis tamponuna 1 tablet ekleyin
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Paslanmaz çelik boncuklar	Qiagen	69989
Mikrosantrifüj