Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Tüm Kan gerçek zamanlı sitotoksisite deneyleri

12K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51941

⸱

7 Kasım 2014

 ,  ,  , 
1Research and Development, Adheren, Inc, 2Research and Development, Eureka Therapeutics

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Tam kan sitotoksisite deneyi (WCA), flüoresans mikroskopisi ve otomatik görüntü işleme ile yüksek verimli hücre konumlandırma teknolojisini içeren tarafından geliştirilmiş bir sitotoksisite analizidir. Burada, bir anti-CD20 antikoru ile tedavi edilen lenfoma hücrelerinin enfekte hücre sitotoksisitesi analiz sağlamak için insan kanında gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir açıklar.

Özet

Genel hücre sitotoksisite zamansal bilgilere erişim sağlayan bir canlı hücre tabanlı tüm kan sitotoksisite deneyi (WCA) yüksek verimli hücre konumlandırma teknolojisi ile geliştirilmiştir. Hedef, tümör hücresi popülasyonu bir dizi formatında halinde immobilizasyon için önceden programlandığı ve yeşil flüoresan sitosolik boya ile etiketlenir. Hücre dizisi kurulmasından sonra, antikor, ilaç insan tam kan ile kombinasyon halinde ilave edilir. Propidyum iyodür (PI) hücre ölümünün değerlendirmek için ilave edilir. Hücre dizisi otomatik bir görüntüleme sistemi ile analiz edilir. Sitozolik boya hedeflenen tümör hücre popülasyonlarının etiket iken, PI ölü tümör hücre popülasyonları etiketler. Bu nedenle, hedef kanserli hücre öldürme oranı ölü hedef hücrelerin sayısı hedefleyen yaşamda kalan hücrelerin sayısının hesaplanması ile belirlenebilir. Bu yöntemle, araştırmacılar, zamana bağlı ve doza bağımlı hücre sitotoksisitesi bilgileri için erişebilir. Dikkate değer, hiçbir zararlı radyokimyasallar kullanılmaktadır. Burada sunulan WCA lenfoma, lösemi ve katı tümör hücre çizgileri ile test edilmiştir. Bu nedenle, WCA araştırmacılar son derece alakalı ex vivo durumda ilaç etkinliğini değerlendirmek için izin verir.

Giriş

Ilaç sektöründe son gelişmeler tümör hücre antikorları ve kişiselleştirilmiş kanser tedavilerinin özel kimlik hayata artan bir ilginin yol açmıştır; Bununla birlikte, çeşitli engeller işleminde karşılaşılan. Klinik öncesi gelişim antikanser aktiviteye sahip maddelerin sadece% 5 faz II-III test 1,2 yeterince etkinlik gösteren sonra lisanslı. Birçok örnek nedeniyle, farklı kan bileşiklerinin 3-5 bu antitümör ilaçlar insan ve esas olarak, laboratuar hayvanlarında farklı davranır gösterildiği gibi klinik öncesi stratejileri (in vitro ve hem de in vivo) istenen düzeyde değildir.

Bir anti-tümör ilaç tarama platformun gerekliliği karşılamak amacıyla ve pahalı hayvan deneylerinde ve klinik deneylerde, daha önce bir kontrol noktası sağlamak için, bir insan tam kan sitotoksisite deneyi (WCA) daha ilişkili bir biyolojik ortam içinde bir antitümör madde etkinliğini değerlendirmek için önerilmiştir.Tam kan sitotoksisite tahlili antikorlar ve insan tam kan içindeki diğer ilaç adayları tek tek hücrelerinin tepkisini değerlendirmek için de kullanılabilir.

WCA yüksek verimli ve yüksek içerik görüntüleme 6 yüksek verimli hücre konumlandırma teknolojisini içeren tarafından geliştirilmiştir. Otomatik bir görüntüleme sistemi kullanarak, hem de canlı ve ölü hücrelerin sayısı, hassas, yüksek bir derecesi ile tespit edilebilir. Nedeniyle hedef hücreler aynı odak düzlemi üzerine sabit bir şekilde nedeniyle, WCA, kırmızı kan hücrelerinin çıkartılmadan gerçek zamanlı kantitatif sitotoksisite analizi verebilmektedir. Ayrıca, otomatik görüntüleme sistemi, öyle ki, belirli kriterleri ulaşmış, sadece hedef hücreler (örn., Flüoresan etiketli hücreler ve hücre morfolojisi) gibi birçok avantaj kapı ve işlenir içerir. Ayrıca, gün başına 144 plakaların üretilmesine izin verir. Sonuç olarak, bu görüntüleme yeteneği ve verimlilik, yüksek c çalışmasını sağlarontent ve aynı zamanda yüksek verim deneyleri. WCA ve otomatik görüntüleme sistemi birleştirerek, yüksek miktarda niceliksel hücre sitotoksisite analizi, bir çok biyolojik uygun bir ortam içinde elde edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hedef hücrelerin hazırlanması

  1. 37 C 'de (% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 4nM L-glutamin, 500 IU / ml penisilin / streptomisin ile RPMI 1640 kültür ortamı), büyüme ortamı içinde, hedef hücreler (örn., Raji lenfoma hücreleri) korumak % 5 CO2 inkübatörde kuluçkalaşmıştır.
  2. 15 ml'lik bir tüp içinde hedef hücrelerini pellet haline getirmek santrifüjleyin. Santrifüj, zaman farklı hücre tiplerine göre değişir; Raji hücreleri için 468 xg'de 3 dakika boyunca santrifüj.
  3. İlk olarak, süpernatan yüzeyinde oluşan kabarcıkları aspire ve tüm süpernatant kaldırmak.
  4. Tüpe PBS, 10 ml ilave edilir. Hücre tutam kırmak için çözüm pipetleme ve birkaç kez aşağı hücreleri yeniden askıya.
  5. Santrifüj 468 x g'de 3 dakika boyunca numune.
  6. Üstte kalan sıvı kısmın yüzeyi üzerinde oluşan kabarcıkları aspire ve tüm süpernatant kaldırmak.

Hücre Mikroarray'ler 2. hazırlanması

  1. Obtain hücre eki 96 plaka kitleri veya tek hücreli dizi 8 iyi odasının slaytlar (malzeme / reaktiflerin tabloya bakınız).
  2. Kiti DNA reaktife Aktivatkörünün 1.2 ul uygulayın. , Şişeyi kap ters çevirin ve yavaşça çözüm karıştırmak için sallayın.
  3. Çözelti oda sıcaklığında 20 dakika reaksiyona girmesine izin verilir.
  4. (15 ml tüp içinde) hedef hücreler pelet karışık bir çözelti uygulanır.
  5. 500 nM'lik bir nihai konsantrasyonda yeşil floresan sitosolik boyalar ekleyin.
  6. Orbital bir karıştırıcı üzerinde, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karıştırılmış çözeltisi ve boya ile hedef hücreler inkübe edin.
  7. 5 ml PBS ile iki kez hücreler yıkanır ve 10 mi büyüme ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  8. Her bir oyuğa adım 2.7 solüsyonundan 100 ul uygulayın. Hemasitometre ile hücre sayısı. Emin hücre sayıları kuyu başına 6 10 × 4-01 Ekim × 5 arasında hücreleri değişir olun.
  9. Oda sıcaklığında kuluçkalama, 10-15 dakika sonra, yavaşça 200-30 ile iki kez örnekleri yıkayın0 ul büyüme ortamı herhangi bir bağlanmamış hücreleri çıkartmak için.
    Not: yaklaşık 5-10 ul büyüme ortamı yıkamadan sonra her bir kuyu kalır.

3. Tam Kan sitotoksisite deneyleri

  1. Her bir numune için, insan tüm kanının 180 ul ekleyin.
  2. ML / 5 mg anti-CD20 antikoru bir çözüm elde edilir ve yapmak için bir seri seyreltme yerine 50, 20, 10, 5, 2, 1, 1.5 ml tüpler içinde anti-CD20 antikoru çözeltiden 0.5 ug / ml olmuştur. Her bir numune de triplicates hale getirmek için anti-CD20 antikorunun her konsantrasyonu 20 ul ekle.
  3. Her bir oyuğa, 500 nM'lik bir nihai konsantrasyonda propidyum iyodür ekleyin.
  4. 16 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C 'de elde edilen plaka inkübe edin.
  5. Görüntü slaytlar veya 8 x büyütme ile otomatik bir görüntüleme sistemi ile 96 yuvalı plakalar üzerinde hücreleri.
  6. Sonuçlarını ölçmek için otomatik görüntüleme sisteminin hücre sayım programı kullanın.
    NOT: Otomatik görüntüleme sistemi yazılımı sağlayan basitadım adım hücre sayımı için işlemleri. Bu yazılımı kullanarak protokol sağlayıcının web sitesinde bulunabilir.
  7. Yazılımın ana sayfasından [İnceleme Sonuçları] seçin.
  8. [Örnekleri için kaydedilmiş Dosyası] seçin.
  9. İlk kapı FITC yoğunluk> 50, sonra kapı TxRed yoğunluk> 20 ile ortalama.
  10. [Plaka Genel Bakış] seçin.
  11. [Export Tabloları] seçin.
    Not: Programın yüzdesi hücre öldürme formülü aşağıda gösterilmiştir:
    % Hedef hücre öldürme = (yeşil ve kırmızı lekeli hücrelerin # / hücrelerinin # yeşil lekeli) *% 100

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Anti-CD20 antikorları ve lenfoma hücreleri (Raji hücreleri ve MC / ARAÇ) bütün kan sitotoksite deneyi (WCA) 7,8 göstermek için bir model sistem olarak seçilmiştir. MC / ARAÇ hücreler zar üzerinde CD20 düşük kopya sayısı vardı Raji hücreleri, hücre yüzeyi üzerinde CD20 yüksek kopya sayısı vardı. Hedeflenen hücreler, ilk olarak yeşil floresan sitosolik boyalarla yeşil boyandı ve 96 oyuklu bir plaka üzerinde düzenlendi. 10,000 - 50,000 hedef lenfoma hücreler her immobilize edildi. Taze çekilmiş insan tüm kanının...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

WCA ideal CDC ve ADCC deneylerinde 9-11 olarak ve klinik öncesi hayvan deneylerinden önce geleneksel hedef gösterimleri sonrasında kullanılan tek hücreli çözünürlükte 12-16, in vitro anti-kanser tarama aracında bir önem taşımaktadır. Şu anda, CDC veya ADCC deneylerinde birincil hedef tarama deneyleri, tüm basitleştirilmiş bir medya ya da bir tampon sisteminde yapılmaktadır. Bununla birlikte, bu basitleştirilmiş tampon sisteminde bir etkinlik ortaya koymaktadır ilaç adayları, her z...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var.

Teşekkürler

Biz bu işi [R33 CA174616-01A1] finansmanı için NIH Ulusal Kanser Enstitüsü IMAT programı teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre bağlantısı 96 kuyulu plaka kitleri AdherenAP9601
Süspansiyon Tek hücre dizisi 8 kuyulu oda sürgüsüAdherenSS0801
Yapışkan Tek hücre dizisi 8 kuyulu oda sürgüsüAdherenSS0802
Lenfoma hücre hattı CD20 +ATCCCCL-86Raji hücreleri
Lenfoma hücre hattı CD20-ATCCCRL-8083MC / CAR
RPMI 1640 L-glutamin ileYaşam Teknolojileri11875-119
Fetal Sığır SerumuTermoSH30070.01HI
Peni/StrepYaşam Teknolojileri15070063
Sitozolik boyaYaşam TeknolojileriC7025Hücre İzleyici Yeşil
Rituxan (Biyobenzer) Eureka Therapeutics
İnsan tam kanıAllcellsWB001
Propidium İyodürSigmaP4170-10MG
Otomatik görüntüleme sistemiMoleküler CihazlarSatıcıyla İletişime GeçinHücre Raportörü
Hücre sayma programıMoleküler CihazlarSatıcıyla İletişime GeçinHücre Raportörü

Kaynaklar

  1. Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
  2. Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
  3. Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
  4. Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
  5. Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
  6. Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
  7. Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
  8. Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
  9. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  10. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
  11. Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
  12. Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
  13. Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
  14. Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580(2009).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
  16. Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
  17. Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47(2000).
  18. Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Tam Kan SitotoksisitesiHedef Kanser HücreleriPropidyum İyodürOtomatik Görüntüleme SistemiHücre Dizisi OluşturmaAnti-CD20 AntikoruFloresan Sitozolik Boyalarİlaç Sitotoksisite Etkinliği
İnsan Tüm Kan gerçek zamanlı sitotoksisite deneyleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.