Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yayılması

11.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51953

⸱

25 Eylül 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Texas at Tyler, 2U. S. Horticultural Research Laboratory, USDA ARS

Bu makalede

Özet

Burada in vitro Homalodisca vitripennis hücreleri ve HoCV-1 yaymak için bir protokol mevcut. Orta HoCV-1 pozitif kültürlerden çıkarıldı ve RNA 168 saat süre ile, her 24 saat ekstre edilmiştir. Hücre yaşayabilirliği tripan mavi ile nicelendirildi. Tüm virüs parçacıkları sonrası enfeksiyon ekstre edildi. Çıkarılan RNA QRT-PCR ile belirlenmiştir.

Özet

Camsı kanatlı keskin nişancı (Homalodisca vitripennis) güneybatı Amerika Birleşik Devletleri boyunca bulunan bir çok vagile ve polifag böcek türüdür. Bu böcekler Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) baskın vektörleri, asmanın Pierce hastalığı (PH) nedensel ajan bir ksilem sınırlı bakteri vardır. Pierce'ın hastalığı ekonomik zarar olduğunu; Bu şekilde, H vitripennis patojen yönetimi stratejileri için bir hedef haline gelmiştir. Homalodisca coagulata virüs-01 (HoCV-01) olarak tanımlanan bir dicistrovirus H. mortalite artışı ile ilişkili olduğu vitripennis popülasyonları. Bir konakçı hücre HoCV-01 replikasyonu için gerekli olduğundan, hücre kültürü lojistik ve biyolojik böcek öldürücü soyu üretimi için ekonomik açıdan önemli olan çoğaltma hedef için tek tip bir ortam sağlar. Bu çalışmada, H. büyük ölçekli üretimi için bir sistemde Doku kültürü ile vitripennis hücreleri geliştirildi, sViral replikasyon mekanizması roviding. HoCV-01 tüm vücut böceklerden çıkarılabilir ve kültür H'yi inoküle etmek için kullanıldı çeşitli seviyelerde vitripennis hücreleri. Kültür ortamı 168 saat, RNA ekstre edilmiş ve QRT-PCR ile analiz için her 24 saatte uzaklaştırılmıştır. Hücreler, tripan mavisi ile boyandı ve ışık mikroskopisi kullanılarak hücre hayatta kalma ölçmek için sayıldı. Tüm virüs parçacıkların toplam hücre kültürü çöküşü oluşmadan önce olduğu tespit edilen bir zaman noktasında olduğu enfeksiyondan sonra 96 ​​saat, kadar ekstre edilmiştir. Hücreler aynı zamanda floresan boyama tabi ve F-aktin bağlanma ve çekirdekler bütünlüğü viral aktivitesini araştırmak için konfokal mikroskopi kullanılarak incelendi. Bu çalışmanın sonuç olduğunu H. vitripennis hücreleri kültive edilip, bir biyolojik zararlı öldürücünün üretimine olanak sağlamak üzere müsait bir seviyede HoCV-01 kitle üretimi için kullanılan olma yeteneğine sahiptirler.

Giriş

Camsı kanatlı keskin nişancı (Homalodisca vitripennis Germar 1821), Kuzey Amerika'da 1, Xylella fastidiosa (X fastidiosa) baskın bir vektör olarak asma (PD) Pierce hastalığının nedensel ajanı tespit edilmiştir. Böcek nüfus yönetim hızla Kaliforniya ve güney Amerika Birleşik Devletleri genelinde bağcılık sektöründe bu yıkıcı sorunla mücadele için araştırma odağı haline gelmiştir. Familyasına ait olan bir pozitif sens, tek iplikçikli bir RNA virüsü Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virüs 01 (HoCV-01), vahşi H. saptanmıştır vitripennis popülasyonları ve böcek için böceğin direncini düşürürken, bu toplumlarda 2-4 ölümleri arttırdığı gösterilmiştir.

Yöntemlerin geliştirilmesi etkili arka H. enfekte etmek Bir laboratuar ortamında yetişkinliğe vitripennis çünkü zor olmuştur H. vitripennis ana bitkilerin 5-8 çeşitli gerektiren farklı sahne özgü beslenme ihtiyaçları var. Belirli tesisleri arka canlı H. gerekmektedir Amerika Birleşik Devletleri vitripennis; Bu nedenle hücre kültürü daha ekonomik ve etkili bir alternatif, hem de HoCV-01 tespiti ve çoğaltılması 2,9 giderek önem taşımaktadır. H. hücre kültürlerinin kurulması için temel yöntem ise vitripennis, virüsler 2 gibi, bu yöntemler, yine biyolojik kontrol maddelerinin ticari üretimi için normal olarak kullanılmamış olan, tarif edilmektedir.

Aşağıdaki prosedürler genel amacı, biyolojik kontrol maddesi olarak kullanım için müsait HoCV-01 gibi yüksek bir konsantrasyonunun üretmektir. Viral replikasyon neden başarılı H. yetiştirilmesi ve optimize bir canlı hücre gerektirir vitripennis kültürler virüs karlı seviyelerini üretme ilerleme için hayati önem taşımaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre Kültürü

Not: USDA Agricultural Research Service (ft. Pierce, FL ABD) Dr Wayne Hunter laboratuvar tarafından Homalodisca vitripennis hücre çizgileri, ilk ve fibroblast hücre mono tabakaları içeren karışık aşamadan oluşan bir laboratuar stok başlatmak için kullanılmıştır.

  1. 25 cm2, kültür şişelerinden ile 20-24 ° C'lik bir sıcaklık aralığında muhafaza steril bir laboratuar ortamında, aşağıdaki işlemleri gerçekleştirmek.
  2. Yetiştirmek ve H2G + yaprak piresi ortamı, bir tadil edilmiş WH2 bal ortam 10 (Tablo 1) ile 25 cm2 doku kültürü şişeleri içinde kültürleri korumak.
  3. 53 nem oranı% ~ 24 ° C 'de kültür şişeleri inkübe edin.
  4. , Herhangi bir anormal hücre büyümesi kontrol, örneğin kültür büyümesini izlemek, herhangi bir potansiyel kirletici için monitör ve kültürleriyle arasında büyüme ilerlemeyi kontrol etmek için toplam büyütme 100X (TM) bir ters mikroskop kullanınTure yüzey.
  5. Kültür yüzeyini bozmadan 10 gün - her 7 tam orta değişikliği (şişesi ortalama ~ 4 ml kültür ortamı) gerçekleştirin.
  6. Kültür yüzey hücreleri ayırmak etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva eden,% 0.25 tripsin kullanılarak hücre büyümesi (konfluent) kapsamındaki yaklaşık% 80 olduğu zaman kültür geçirin. Her kültür şişesine tripsin 3 ml ve kısa bir süre için enzime kültür (ler) maruz - ~ 2 Ekle - tam hücre ayrışmasını sağlamak için (5 10 dk).
  7. Enzim aktivitesini durdurmak için santrifüj ve konik tüp bütün çözüm aktarmak için - kültür şişesine (lar) (3 mi ~ 2) taze ortamın eşit miktarda ekleyin.
  8. 350 x g hızında 6 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj ile pelet hücreleri.
  9. Hücre topaklarını bozmadan Süpernatantı ve her bir tüpe ~ taze ortam 8 ml ekleyin. Yavaşça bir pipet kullanarak hücreleri homojenize.
  10. 1 Split kültürler: 2 oranı için 25 cm 2 şişeler (~ hücre soluti 4 mlkap başına üzerinde) ve ayrılmak taze kültür geçirilen süspansiyon halindeki hücreler şişenin yüzeyine sağlam bir şekilde tutunmasını sağlayacak, 48 saat boyunca rahatsız.
    Not: 1 cm2 'lik bir büyüme yüzeyi ile 48-çukurlu steril doku kültürü plakaları içindeki hücrelerin yetiştirilmesi mümkündür ve ~ 250 ul kültür ortamı hacimde bir azalma ile birlikte kültür şişelerinde aynı şekilde elde edilebilir.

2. Tüm virüs Ekstraksiyon

  1. Virüs pozitif H. tüm organları homojenize ~ 10 saniye aralıklarla girdap% 0.02 sodyum dietilditiyokarbamat trihidrat (DETCA) ile fosfat tamponu içinde vitripennis, pH-7.2, mevcut bir dokusunun daha büyük topaklar kalmayana kadar. 4 ° C de 4 saat ya da 4 ° C 'de 16 saat süre ile 22.000 x g boyunca 124.500 x g'de santrifüj ile SuperSpeed ​​virüs ekstrakte edin. Üstünde bir çökelti ortaya çıkarsa, steril pamuklu çubuk 11 ile çıkarın.
  2. Süpernatant atın.
  3. Pelet toplayın ve% 0.4 Na-deoksikolik asit ve% 4 polietilen glikol heksadesil eter (Brij 52) ihtiva eden, 5 mi 10 mM fosfat tampon maddesi (yok DETCA), pH değeri, 7.2 ile çözülür.
    1. De pelet karıştırmak için, tüpün yanından pelet kaldırmak ve gerekirse çözelti içinde kadar ezmek.
    2. Topak gerekirse çözelti haline ve 2 tüpler 11 birleştirmek yardımcı olmak için ~ 5 mi artışlarla daha 10 mM fosfat tamponu ilave edin.
  4. 15 dakika için 11 300 x g'de çözümü santrifüj.
  5. Süpernatantı ve bir 0.45 um filtre içinden çözeltisinin, ve büyük bir toplama tüpü 11 Süzüntüyü toplamak.
  6. Bir moleküler ağırlığa sahip bir diyaliz zarı transfer süzülen madde 10 mM'lik 11 gerekirse herhangi bir DETCA ihtiva eden fosfat tamponu (pH 7), küçük miktarları kullanılarak, 3.5 kD (MWCO) kesilir.
  7. 4 ° C'de GKD 2 O dolu olan büyük bir beher içinde diyaliz membranı yerleştirin. GKD 2 O her saat f değiştirinveya 5-6 saat sonra, zar 11, beyaz bir çökelti oluşana kadar.
  8. Zarı içinde saflaştırılmış virüsü toplamak ve GKD 2 O 90 ul solüsyon 10 ul ekleyerek 10-kat seyreltme serisi için% 100 virüs çözeltinin çok 100.000: Daha sonra 1 bir seyreltme ulaşana kadar GKD 2 O başka bir 90 ul seyreltme 10 ul ekleyin.
  9. -80 ° C'de saklayın virüs çözümü.

3. Viral kopyalama

  1. Hücre büyümesi (hücreler ortalama bir oranda artmaktadır, yaklaşık olarak 72 saat post-geçiş)% 80 birleşmeye kadar 48 oyuklu kültür plakaları içinde tohum hücreleri ve tüm satırları büyür.
  2. Hücre büyümesi konfluansa ulaştığında, seri halinde seyreltilmiş virüs, hücrelerin her satır inoküle, yani, 1:10 seyreltme, bir satır, bir 1 bir sıra: en üst sırasının dışında 100 seyreltme, vb. Bir kontrol olarak üst satırı kullanın ve ses kontrolü olarak her kuyuya GKD 2 O 10 ul ekleyin.
    1. Önce virüs kültürlerde herhangi bir kuyu İlk aşıdan her satırın ilk kuyu, deneysel hücre sayımları ile karşılaştırma için bir başlangıç ​​bazal hücre konsantrasyonunu kurmak ayırmak ve saymak için.
  3. Kültür plakaları, pH değişikliği gösteren bir ortam içinde herhangi bir renk değişikliği ve hücre morfolojisinde herhangi bir değişiklik için virüs aşılanmasından sonra her 24 saat izleyin.
  4. 100X TM bir ters mikroskop kullanılarak her bir zaman noktasında test plakası, görüntü bir sütun.
  5. Her bir 24 saatlik zaman noktasında görüntülenmiştir kolondan tüm Ortamı çıkarın ve -80 ° C de, viral RNA çıkartması ve miktar tayini ya da uzun bir dönem için -20 ° C 'de kısa süreli saklayın.
  6. Hücre Pelle yeniden suspande edilmesi için enzim aktivitesi ve taze ortam ~ 250 ul durdurma% 0.25 tripsin EDTA ve taze ortam arasında sadece yaklaşık 250 ul kullanılarak 1.9 - 1.6 aşamalarında daha önce tarif edildiği gibi orta çıkardıktan sonra kuyulardan hücreleri ayırmakt.
  7. Bir hafta boyunca her 24 saatlik bir süre boyunca hücre ayrılma sonra hücre sayıları gerçekleştirmek için hücreleri ihtiva eden her tüpe% 0.4 tripan mavi boyası, 10 ul ekle. Leke hücre sayımları yapmadan önce 10 dakika dinlendirin.
    1. Leke hem de cansız hücreler alımı başlar leke maruz bırakılarak ya da yaşayan hücrelerin, 1 saat içinde hücre sayar.
  8. Yavaş yavaş bir mikropipet kullanılarak standart bir hemasitometre her iki tarafına da lekeli hücre çözeltisinin 10 ul ekle. Veren çözelti, hava kabarcıklarını önlemek için kılcal hareketi ile yukarı alınır.
  9. Hemasitometre her iki tarafına uygulanabilir (non-lekeli) hücrelerin sayısını (hemositometrede 16 kareler 4 sayımları eşdeğer) sayılır. Çıkarıldı kolonun her bir oyuk için hücre sayar.
  10. Her kolondan hücre sayıları ortalama ve toplam hücre sayısı numarasını edinmek için aşağıdaki formülü kullanın: x seyreltme faktörü (hücre / 4 ortalama sayısı) = hücrelerin x 10 sayısını 4 mi. Bu, kültürdeki hücre yoğunluğu ya da yaşayan hücrelerin sayısıdır.

Hücre Kültürü 4. Virüs Ekstraksiyon

  1. Tedavi H. Kaldır Enzim aktivitesini durdurmak için% 0.25 tripsin EDTA ve taze ortam arasında sadece yaklaşık 250 ul kullanılarak 1.8 - Kültür şişelerinden alınan hücreler, vitripennis aşamalarında daha önce tarif edildiği gibi 1.6.
  2. Süpernatant atın.
  3. 2.8 - 2.3 'te, daha önce adımda tanımlanan protokol ile kültür hücrelerinden ekstrakte virüs.

5. RNA Ekstraksiyon

  1. Üreticinin protokolüne göre, sıvı örnekleri için tasarlanmış bir guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanılarak, her bir haftalık deneme sırasında toplanan virüs ortamı örnekleri RNA çıkarmak.
  2. -80 ° C'de saklayın numuneleri ekstre edilmiştir.

6. RT-PCR

  1. Kullanarak geleneksel PCR çalıştırarak RT-PCR için viral standartlar oluşturulmasıprimer çifti HoCV RT-PCR primeri 1 (ileri 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 '-ACGACGGATCTGCGTGCCAA 5'-3, ters') virüsü ile tüm vücut H. izole vitripennis.
  2. Konu PCR ürünü,% 0.1 etidyum bromid içeren bir% 2 agaroz jeli içinde, 120 V, 60 dakika boyunca jel elektroforezi için.
  3. Jelden bantları pulu ve imalatçının protokolüne göre, bir jel ekstre etme kiti kullanılarak saflaştırılması.
  4. Havuz tüm kesilmiş ve jel ile saflaştırılmıştır ve ürün ayrıca temel etanol presipitasyonu ile saflaştırılması. Genel örnek konsantrasyonunu arttırmak Tris EDTA (TE) içinde yaklaşık 30 ul çökeltme ürünü elute edin.
  5. Nükleik asit saptama için 260/230 dalga boyu ayarlarını kullanarak spektrofotometre ile toplanmış örneklerin cDNA seviyesini ölçmek.
  6. 57 ng arasında değişen saflaştırılmış örnekteki bir on-kat daha seri seyreltme serileri sonuçları / 57 ug / ul (10 -18) ul. Benzer seri seyreltme i Me tarif edilen gerçekleştirmen konsantrasyon gereksinimleri farkı için yapılan ayarlamalar 2.8.
  7. Düşük yoğunluklu transkriptlerin güvenilir bir ölçümü QRT-PCR kiti kullanılarak QRT-PCR gerçekleştirilerek seyreltme serisinin tespiti sınırlarını belirler.
    NOT: 5 x 10 -3 kopya daha Viral konsantrasyonları daha düşük tespit değildir.
  8. Adım 5.1 'de daha önce tarif edildiği gibi deneysel numunelerin RNA ekstrakte ve spektrofotometrisi kullanılarak miktarı belirlenir.
  9. Nükleaz ücretsiz su kullanarak ul / 5 ng tüm ayıklanır örnekleri normalleştirmek.
  10. Aşağıdaki gibi 25 ul reaksiyonu, düşük kopya sayısını algılamak için yeteneğine sahip tek aşamalı bir QRT-PCR kiti kullanılarak olarak, iki kopya halinde, tüm numunelerde QRT-PCR uygulaması: 50 ° C'de 10 dakika boyunca tutun; 5 dakika boyunca 95 ° C'de tutma; 10 saniye, 30 saniye için 60 ° C 95 ° C 30 döngü; Her adımda 5 saniye 99 ° C - 50 eritebilir.
    1. Her bir reaksiyon karışımı, 1 x ustalar 12.5 ul içerir, böylece ana karışımı yapmakR karışımı, ileri primerin 1.0 ul (0.3 uM), ters primer, 1.0 ul (0.3 uM), ters transkriptaz ve standardizasyon değerlerine göre şablon değişken miktarlarda 0.25 ul.
    2. RNazsız su ile 25 ul toplam reaksiyon hacmi.
    3. Her bir PCR'nin beş standart konsantrasyonlar, aşağıdaki kopya numaralarıyla birlikte çalışmasını da kapsaması: 5 x 10 -10, 5 cm x 10 -8, 5 x 5 x 10 -4 -6 10, ve 5 x 10 -2 kopyalar. Her çalışma başında erken alımı sırasında gürültüyü azaltmak için, sadece 10x -2.5 bir floresan altına her çalıştırmak için eşik ayarlayın.

7. Konfokal Mikroskopi

  1. Her iyi çapı 18 mm boyutlarındaki on iki iyi plaka içeren cam lamelleri içinde Homalodisca vitripennis hücreleri büyümek.
  2. Bir tek-tabakalı elde edildiği zaman, dört günlük bir süre boyunca levha üzerinde her 24 saatte bir sütun inoküle. Her c emin olunolumn iyi bir denetimi içeren, düşük viral seyreltme (1:10) iyi ve yüksek viral seyreltme (1: 100,000) iyi. Adım 2.8 elde virüs çözümleri kullanın.
  3. Beşinci gününde tüm ortamları çıkarın ve iki kez 1x PBS (pH 7.4) ile hücreleri yıkayın.
  4. 30 dakika boyunca 4 ° C'de soğuk% 4 paraformaldehit ile hücreleri saptamak.
  5. 1x Fosfat 500 ul hücrelere serum fizyolojik (PBS) ilave edilmeden önce ilave edin ve düşük hızda bir sallama düzeneği üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yıkayın. Hücreleri üç kez yıkayın.
  6. Bunları permeabilize hücrelerin% 0.1 Triton X-100 500 ul ilave edin. Oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
  7. Hücreler tekrar yıkama, daha önce tarif edildiği aşama 7.5.
  8. Oda sıcaklığında hücrelere engellemek için,% 5 sığır serumu albümini (BSA) çözeltisi 500 ul ilave edin. 2 saat boyunca oturup sonra çıkaralım.
  9. 1x PBS% 5 BSA içeren 250 ve F-aktin leke iyi her seyreltme 250 ul ekleyin: stok Rodamin kırmızı-konjuge Phalloidin (BİP) 1 seyreltin.
  10. Alüminyum f Kapak plakasıYağ ağartmadan boya önlenmesi ve 4 ° de CO / N inkübe hücreleri.
  11. 12 saat inkübasyondan sonra, RCP çıkarın ve hücrelerin çekirdekleri leke,% 5 BSA içeren PBS içinde 1x seyreltilmiş 6-diamidino-2-fenilindol 4 250 ul '(DAPI) (250 ug / ml) ile değiştirin .
  12. 1 saat boyunca oda sıcaklığında DAPI içeren hücreleri inkübe edin.
  13. Aşamasında önceden tarif edildiği gibi 7,5 1x PBS hücreleri üç kez yıkayın.
  14. Yavaşça kuyulardan lamelleri çıkarın ve bir anti-solmaya reaktif ile bir montaj medyayı kullanarak slaytlar mikroskop monte.
  15. Konfokal mikroskop altında inceledi kadar slaytlar kutulara lightproof kurumasını bekleyin. Boyalar hızla solmaya gibi gör kısa sürede hazırlanan slaytlar.
  16. 63X (yağ) Plan-apochromate lens içeren bir mikroskop ile donatılmış bir konfokal sistemi kullanılarak görüntü lekeli hücreler.
    1. 543 ± 10 nm uyarma ve Rhoadmine kırmızı-conjucated Phalloidin için 575 ± 10 nm emisyona lazer dalga boylarını ayarlamaDAPI'nin için, ve 369 ± 10 nm uyarma ve 450 ± 30 nm emisyon.
    2. Tüm görüntüler elde etmek için dedektör için aynı kazanç ve off-set ayarlarını kullanın.
    3. Görüntü işleme için uygun bir yazılım kullanarak bir görüntü yönetme yazılımı içine sıralama ve ithalat istenen görüntüleri Süreci görüntüler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hücre bağlanma ve büyüme primer kültürlerinde ve sürekli geçişlerinden, hem küçük hem de büyük bir kültür şişelerinde geçidinin 48 saat içinde görülmüştür. Fibroblast büyüme ve gelişme de bu süre içinde gözlenmiştir. Yeni seribaşı şişeler 48 saat önce rahatsız edildiğinde, orada, hücre eki görülür bir düşüş oldu, bazen yavaş büyüyen kültürlerde ve tüm hiçbir ek veya büyüme lider. Hücreler geçen bir hafta içinde, yaklaşık% 80 birleşmeye ve 10-14 gün (Şekil 1) bir tek tabaka oluşturulmuştur. Bu çalışmanın...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Istilacı tarımsal türlerin akını ilişkin artan endişeler gelişmekte olan zararlılara ve patojenlere karşı savunmak için yeni metodolojiler için artan bir talep yol var. Hastalık önleme ve yönetim odağı patojen vektörler yönetimini içerir ve bu çalışmanın birincil hedefi oldu. Ekonomi pratik uygulama büyük alanlar üzerinde ancak düşük bir maliyetle 12 de büyük miktarlarda olması gerekiyor, çünkü tarımda karantinası yönetmek için biyolojik zararlı öldürücünün bu tür üretmek için karar hayati bir rol oynamaktadı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Texas Pierce's Hastalığı Araştırma ve Eğitim Programına ve USDA-APHIS'e bu projeye sağladıkları finansman desteği için teşekkür ederiz. Tyler'daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'nden Hema Kothari'ye konfokal mikroskopi konusundaki yardımları için de teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Corning hücre kültürü şişeleriSigma AldrichCLS430168Yüzey alanı 25 cm2, eğimli boyun, kapak (tapa contası)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71OlympusTers mikroskop ve kamera
Tripsin-EDTA çözeltisiSigma AldrichT4049%0,25, steril filtreli, BioReagent, hücre kültürüne uygun, 2,5 g domuz tripsin ve 0,2 g EDTA & boğa; Hanks & prime litre başına 4Na; Fenol kırmızısı ile Dengeli Tuz
Çözeltisi Greiner CELLSTAR çok kuyulu kültür plakalarıSigma AldrichM893748 kuyu (TC kapakla işlenmiş)
DETCASigma Aldrich228680Sodyum dietilditiokarbamat trihidrat
Corning şişe üstü vakum filtre sistemiSigma AldrichCLS431206Selüloz asetat membran, gözenek boyutu 0.45 μ m, membran alanı 54,5 cm2, filtre kapasitesi 500 ml
Brij 52Sigma Aldrich388831Polietilen glikol hekzadesil eter
Fosfat tampon çözeltisiSigma AldrichP5244Steril su ile 10 mM'ye seyreltilmiş 100 mM olarak alındı
TRIzol LSLife Technologies10296-028
AgaroseSigma AldrichA5304İçin elektroforez
Etidyum bromürSigma AldrichE7637BioReagent, moleküler biyoloji için, toz
QIAquickQiagen28704
QuantiTect qRT-PCR kitiQiagen204243
%4 paraformaldehitSigma AldrichP6148Reaktif sınıfı, kristal
PBSSigma AldrichP5368Fosfat tamponlu salin
Triton X-100Sigma AldrichX100
Sığır serum albümini (BSA)Sigma AldrichA2153
Rhodamine kırmızı konjuge falloidinYaşam TeknolojileriR415Rhodamine phalloidin, kırmızı-turuncu floresan boya, tetrametilrodamin DAPI Sigma Aldrich D9542 ile konjuge edilmiş yüksek afiniteli bir F-aktin probudur
ProLong Altın Antifade ReaktifiYaşam TeknolojileriP36934
LSM510 Meta Konfokal SistemCarl Zeiss
LSM Zen 2007 YazılımıCarl Zeiss
Grace' s Böcek ortamı (takviyeli, 1x)Sigma AldrichG8142H2G+ yaprak zararlısı orta bileşeni
L-histidin monohidratSigma AldrichH8125H2G+ yaprak zararlısı orta bileşen
Orta 199 (10x)Sigma AldrichM4530H2G+ yaprak zararlısı orta bileşen
Orta 1066 (1x)Sigma AldrichC0422H2G+ yaprak zararlısı orta bileşen
Hank' s Dengeli Tuzlar (1x)Sigma Aldrich51322CH2G+ yaprak zararlısı orta bileşenli
L-Glutamin (100x)Sigma AldrichG3126H2G+ yaprak zararlısı orta bileşenli
MEM, amino asit karışımı (50x)Sigma Aldrich56419CH2G+ yaprak zararlısı orta bileşen
1 M MgCl çözeltisiSigma AldrichM8266H2G+ yaprak zararlısı orta bileşenli
Pen-Strep (w/ glutamin)Sigma AldrichG6784H2G + yaprak zararlısı orta bileşen
NystatinSigma AldrichN6261H2G + yaprak
GentamisinSigma Aldrich46305H2G + yaprak zararlısı orta bileşen
DekstrozSigma AldrichD9434H2G + yaprak zararlısı orta bileşen
Fetal Sığır SerumuSigma AldrichF2442H2G+ yaprak zararlısı orta bileşen
. zararlısı orta bileşen

Kaynaklar

  1. Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
  2. Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
  3. Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
  4. Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
  5. Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
  6. Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
  7. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
  8. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
  9. Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
  10. Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
  11. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).
  12. Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
  13. Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
  14. Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
  15. Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
  16. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
  17. Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
  18. Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).
  19. Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
  20. Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Vir s PropagasyonuRNA EkstraksiyonuqRT PCR AnaliziKonfokal MikroskopiTrypan Blue BoyamaS per H zl Santrif jlemeDiyaliz Membran FiltrasyonuViral Kantifikasyon
Yayılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.