Yöntem makalesi

Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın

21.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51954

⸱

22 Aralık 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, UMR_S 968, Institut de la Vision, 2Department of Visual Information, UMR_S 968, Institut de la Vision, 3Exploratory Team, UMR_S 968, Institut de la Vision, 4Sorbonne Universités, Paris 06, UMR_S 968, Institut de la Vision, 5INSERM, U968, Institut de la Vision, 6CNRS, UMR_7210, Institut de la Vision

Bu makalede

Özet

8 gün yaşlı bir fare Sinir retina% 4 jelatin bloğunun üstünde olduğunu. Vibratome ile fotoreseptör tabakası (200 um), izole edildikten sonra, fotoreseptör kültür mekanik ve enzimatik ayrışma sonrasında tohumlanır. fotoreseptör moleküler ve biyokimyasal analizler ya da transplantasyon için kullanılabilir.

Özet

Retina ışığın yönünü dikkate retina en uzak kısmında retina pigmente epitel ile, fotoreseptör gelen katmanlar nöronlar ile temas halinde her iki çubuklar ve koniler mimarisi düzenledi santral sinir sisteminin bir parçasıdır ve En yakın mesafe ganglion hücreleri. Bu mimari vibratome kesit tarafından fotoreseptör tabakasının ayrılmasına izin verir. 8 gün yaşlı bir fare disseke nöral retina düz gömülü aşağı bakacak% 20 jelatin fotoreseptör tabakasının bir dilimin üstüne% 4 jelatin. Bir Vibratome ve iki ucu keskin jilet kullanarak, 100 mikron kalınlığında iç retina kesilir. Bu bölüm, gangliyon hücreleri ve özellikle iki kutuplu hücreler üzerindeki iç katman içermektedir. Fotoreseptörleri içeren dış retina 200 mikron kurtarıldı önce 15 mikron bir aracı bölümü atılır. jelatin, 37 ° C'de ısıtma ile ayrılmaktadır. Dış tabakanın adet doğmuş iyileşmesini olan37 ° C'de 20 dakika boyunca aktive edilmiş papain 2 birimleri ile Ringer çözeltisi 500 ul monte edilir. Reaksiyon Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde 500 ul% 10 fetal dana serumu (FCS) eklenerek durdurulur, DNAz I daha sonra 25 adet serum çıkarmak için oda sıcaklığında santrfuj birkaç kez yıkanır ilave edilir ve hücreler içinde tekrar süspansiyon haline getirilmiştir 500 DMEM ul / cm2, 1 x 10 5 hücre tohumlanır. in vitro olarak 5 gün büyütülür ve bunların canlılığı ölü / canlı deney kullanılarak atılır. Kültür saflığı ilk deney sırasında mikroskop altında incelenmesi ile belirlenir. saflık sonra tohumlama ve histolojik slayt üzerinde hücreleri tespit ve bir tavşan poliklonal anti-SAG, bir fotoreseptör işaretleyici ve fare monoklonal anti-RHO, bir çubuk fotoreseptör spesifik marker kullanarak analiz tarafından onaylanmıştır. Seçenek olarak ise, fotoreseptör (% 97 çubuklar) geni veya protein ifadesi analizi için ve nakli için de kullanılabilir.

Giriş

Retina omurgalılar arasında korunmuş mimarisi vardır, merkezi sinir sisteminin bir parçasıdır. nöral retina nöronlar gelen ışığın, gözün arkasındaki retina pigment epiteli (RPE) ile yakın temas içinde fotoreseptör tabakası için en uzak olan, tabakalar halinde düzenlenmiştir. Çubuk ve koni photorecptors foton yakalama opsin duyarlı moleküller güveniyor ışığa duyarlı hücreler vardır. Bu moleküller, RPE 1 yönünde işaret fotoreseptör dış kesiminde bulunan, hücresel bir yapıya disk membranları üzerine sarılmaktadır. Genellikle çok erken fotoreseptör dejenerasyonlar durumlarında etkilenir bu yapı,% 10, her gün oranında yenilenir. yani söz konusu iç tabaka fotoreseptör, çift kutuplu, amakrin ve yatay hücrelerde olarak ganglion hücrelerinde alınan sinyal hesaplamak diğer nöronların çoğunu içerir. Onların akson ile bu sonOptik sinir olan bir kiriş oluşturur. Bu katman hücreleri, iç pleksiform tabakası 2 dışında bulunduğunda biyologlar vadeli yerinden amacrine hücrelerini kullandık o kadar korunmuş olduğunu. Nöronların Katmanlar radyal Müller glial hücreler bir armatürün içinde dağıtılır. Bipolar hücreler ganglion hücrelerinin fotoreseptörleri bağlantı. Bunlar, dış pleksiform katman ve iç pleksiform katman arasında yer alır. ganglion hücrelerinin iki kutuplu hücreler ile bağlantılı olarak iç pleksiform tabakasını oluşturur. amacrin hücreler iki kutuplu hücreler ve gangliyon hücreleri arasındaki iç pleksiform tabakasındaki bulunan ilişki hücre olarak adlandırılmaktadır. dış pleksiform tabakasını yatay hücreleri içerir. Merkezi sinir sisteminin nöronal tabakaların Bu yararlı düzenleme bir vibratome kullanarak düz monte retina dilme iç hücre tabakasından fotoreseptör tabakasının ayrılmasına izin verir.

Başlangıçta, bu teknik, aktarma için fotoreseptörleri izole etmek için kullanılmıştırrd1 farede insan retinitis pigmentosa (RP) 3'ün bir model göz splantation. rd1 fare çubuk-spesifik fosfodiesteraz p alt-birimi için kodlayan Pde6b geninde bir resesif mutasyonu taşır. İnsanlarda 4 RP bu gen sonucu Resesif mutasyonlar. Çubuk fotoreseptör dejenere sonra, hasta gece görüş kaybeder, ve, mutasyona uğramış gen ifade ikinci adım olarak dejenere yok şaşırtıcı koni fotoreseptör. Kozalak renkli görme ve görme keskinliği için gerekli olduğundan, hastalar giderek kör olur ve hastalık için etkili bir tedavi henüz gelişmemiştir. Vahşi tip fare, konakçı fare koni dejenerasyonu fotoreseptör tabaka aşılanmasıyla, 3,5 geciktirilir. çubuklar ve iki kutuplu hücreler arasındaki sinaptik bağlantı sadece r belirli bir aşamasında elde edilebilir, çünkü rod-koni dejeneratif modelinde kayıp çubuklar nakli ile ikame edilmiş olabilirNRL ifade 6 başlangıcı ile işaretlenmiş etinal gelişme. Fotoreseptörlerin tabakası RPE ve fotoreseptör kalan, koni sadece% 3 tekabül dış retina arasında, çubuk-az rd1 retinanın alt-retinal cerrahi alanda tarafından tanıtıldı. İki hafta ameliyat sonrası, normal bir fotoreseptör tabakası ile nakledilen hayvandan koni% 40, ya da sahte-işletilen hayvan iç retina hücrelerinin normal bir tabaka ile nakledilen hayvan kıyasla hayatta. koni hayatta kalma topografisi, yayılmış, aşılanmış dokunun pozisyonunda bulunan mutasyona uğramış retinanın, tüm yüzey üzerinde bir koruyucu etki yayılabilir molekül 7 bağlı olduğunu gösterir.

Sonra, koruyucu etkisi çubuklar 8,9 ile proteinin sekresyonunu alır hale geldiğini doğrulamak için, bir ko-kültür sistemi olarak koşullandırılmış kültür ortamları kullanmışlardır. Biz bu proteinin expre olacağını varsayımındaolmayan bir hücre özerk bir şekilde 10 çubuklar koruyucu sinyal kaybı ile ikincil koni dejenerasyon tetikleyecek hastalığın ilk aşamasında kendi ölüm çubuklar tarafından ve sürekli ve özellikle popülasyonunda ifade. Çünkü primatlarda koni aracılı merkezi görme önemi bu varsayılan protein RP için son derece alakalı tedavi aracı olacaktır. RP konileri korunması teorik 11 kör olmak, dünya çapında 1,5 milyon hastanın toplam önleyecektir. Bir retina cDNA kütüphanesinden 12 Çubuk türetilmiş Koni Canlılık Faktörü (RdCVF) kodlayan bir cDNA'nın belirlenmesi için yüksek içerik tarama yaklaşımı ve bir koni zenginleştirilmiş kültür modeli kullandık. RdCVF, ilginç bir şekilde, redoks homeostazı 13 yer alan, söz konusu tioredoksin proteinleri için kodlayan genin homolog olan NXNL1 geninin splayslanmış ürünüdür. genin ikinci eklenmiş bir ürün RdCVFL hedefine oksidatif d karşı Tau proteini koruyan bir enzimdir14 Amage. RdCVF İdaresi koni ikincil dejenerasyonu ve bir resesif onların görme fonksiyonunun kaybı ve RP 12,15 baskın modelini önler. Bu, yenilikçi tedavi stratejisinin 16 iki önemli yönlerini gösterir. İlk olarak, bir gen, bağımsız bir şekilde, RP vakaların çoğunda uygulanabilir. İkincisi, rekabet faktörü aksine CNTF, RdCVF sağkalım görme fonksiyonunun 17 bakım ile ilişkilidir. Fonksiyonel etkisinin olmaması RP hastalara 18 CNTF'nin yönetiminin klinik yarar yokluğu nedeni açıklayabilir. RdCVF in vitro koni kurtarma RdCVF bağışıklık sistemindeki 12 inhibe beri çubuk ve koni arasındaki önemli yaşam sinyalinin bir büyük olasılıkla. Buna ek olarak, çubuk-türevli koni canlılığı geninin bozulması, oksidatif stres 19 disfonksiyon ve duyarlılık fotoseptör yol açar.

kullanımıfotoreseptör tabakası RdCVF belirlenmesi kökeni ve nörodejeneratif hastalıklar 20 katılan yeni redoks sinyali olduğunu. Bu yazıda izole etmek ve fotoreseptör tabakadan kültür hücreleri RdCVF bölgesinin aktivitesinin karakterize edilmesi için kullanılan bir protokol açıklar. fotoreseptör 5-7 gün 21 kültür içinde muhafaza edilebilir. Bu teknik aynı zamanda fotoreseptör spesifik genlerin ekspresyonunu incelemek için kullanılabilir.

Protokol

NOT: yordam Üniversite Pierre ve Marie Curie (/ 2009/048 CE5) den etik komitesi Darwin tarafından onaylanmış

Jelatin Çözüm, Aletler, Vibratome, Kültür Medya ve Kültür Plate 1. Hazırlık

  1. En az bir gün önce deney bir% 20 jelatin çözeltisi hazırlayın.
    1. Kapağın altında, CO2 bağımsız ortamı ihtiva eden 500 ml'lik bir şişe (CO2 i) için gentamisin [10 mg / ml], 500 ul ilave edin.
    2. Ayrı bir kabta 15 dakika boyunca sürekli karıştırma ile bir ısıtma bloğu üzerinde 95 ° C 'de ve ısı (aşama 1.1.1), CO2-I 20 ilave edin. Çözelti daha sonra kullanılmak üzere hazır olduğuna işaret ederek, sarı bir renk almasına neden dikkate alınmalıdır.
    3. San renkli bir çözelti elde etmek, 45 dakika boyunca 95 ° C 'de daha fazla bir karıştırma ve ısıtma ile yukarıda hazırlanan çözelti (aşama 1.1.2) 4 jelatin g ve yavaş yavaş zayıf tartılır. Jelatin çözüm altına soğumasını bekleyinYaklaşık 5 dakika kaput.
    4. Hava baloncuklarının oluşumunu olmayan bir 35 mm çaplı kültür tabakalarına jelatin solüsyonu 4 ml dökün. 30 dakika boyunca 21 ° C 'de çanak tutun. Plastik film ile yemekleri Kapak ve baş aşağı çevirin yemekleri. İsteğe bağlı olarak, kullanım öncesi, 2 ay için 4 ° C'de yemekler saklayın.
  2. % 4 jelatin çözeltisi hazırlayın.
    1. Kapağın altında bir ısıtma bloğu üzerinde 42 ° C'de CO2 -i steril plastik bir kap içinde orta ve ısı 25 ilave edin. Isıtma bloğu orta çıkarın ve yavaş yavaş sıcak orta ve heyecan için jelatin 1 g ekleyin. Hızla ısıtma bloğu (42 ° C) kabı dönmek ve sürecinde sıcak tutmak.
  3. Ayarlama makyaj vibratome cihazı:
    1. 4 ° C'de saklandı% 20 jelatin çözeltisi içeren yemekler çıkarın. Bir neşter ile jelatin kesin. Jelatin dilim çevirin ve s bir damla kullanarak vibratome siyah destek disk üzerinde sopauper tutkal.
    2. Ikiye bir jilet kırın ve vibratome tutan yuvaya yarısı yerleştirin. Vibratome aparat üzerine siyah destek diski takın. Sağ tarafına siyah topuzu açın. Vibratome başkanı tutarak yuvasını Fix. Jelatin blok kapsayacak vibratome tankında CO2 -i ortamın yeterli miktarda ekleyin.
    3. Vibratome açın ve jelatin bloğun üç 100 mikron dilim kesti. Daha fazla kullanım için jelatin blok tutun.
  4. Kültür ortamında 40 ml hazırlayın:
    1. Başlık ile fetal dana serumu (FCS) ve% 10 Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) hazırlayın. 1 mg / mL poli-D-Lisin ile fosfat tampon tuzlu su (PBS), pH 7.4 hazırlanır.
    2. 96 oyuklu bir plaka içerisinde, kaplamak için kuyu alt Poly-D-Lizin 2 ug / cm 2 ekleyin. CO2 kuluçka% 5 içinde 37 ° C 'de 45 dakika boyunca plaka inkübe edin. İnkübasyondan sonra, PBS kaldırmak ve 200 ul yerine/ Kullanmadan önce% 5 CO 2 inkübatör 37 ° C'de tekrar iyi DMEM ve yer.

Tüm Retina 2. Diseksiyon

  1. Fareyi enükleasyonu:
    1. Avrupa direktifi 2010/63 uyarınca fare Kurban: servikal dislokasyon ile. Kavisli-makas ile baş kesin ve dezenfektan ile dezenfekte göz sonra 100 mm çaplı Petri kabı yerleştirin.
    2. Çok dikkatli bir kavisli tutuş kullanarak kesit ile optik sinir müstakil sonra göz çıkarın. Daha sonra 21 ° C'de steril CO2 -i ortam içeren 35 mm Petri kabındaki her iki gözü yerleştirin.
  2. Retina Çıkarma:
    1. Göz küresi içine makas tanıtmak edebilmek için 18 G iğne yardımıyla göz ekstremitenin düzeyinde bir delik açın. Deliğin içinde düz makas tanıtmak ve dikkatle siliyer cismin çıkarılması için göz dünyanın her çevre üzerinde iris altında sklera kesti.
    2. Kornea ve lens çıkarın ve sklera ile retina bitişik olan gözün arka odasına tutun. İki ince kulpları ile, retina zarar vermeden arka odasının içinde bulunan vitrözü çıkarın. Retinanın düzleşme izin için dört radyal kesimler (retina / sklera) gerçekleştirin.
    3. Oküler dünya toparlanma ve bir "turuncu" olarak soyun. Sklera ve retina pigment epiteli (RPE) retinayı ayırın. Hala optik sinirin düzeyi çok dikkatli ince kavisli-makas tutturulmuş retina ayırın.
    4. İki ince saplar ile retinanın merkezine doğru çevreden kalan vitrözü ayırın. Tüm vitreus tamamen retina düzleşme izin kaldırılır emin olun.
    5. Plastik bir pipet ekstremite kesin ve plastik bir pipet ile CO2 i ortam içeren 35 mm çapında Petri tabağına retina aktarın.

Düz Mounte 3. SızdırmazlıkJelatin Blok üzerine d Retina

  1. Düz monte retinanın sızdırmazlık izin vermek vibratome tankı (jelatin blok ücretsiz) gelen CO 2 -i orta 30 ml - 20 çıkarın.
  2. Plastik pipet kullanarak bir cam slayt retina aktarın ve 2 -i orta jelatin dilim aşağı bakacak fotoreseptör ile jelatin dilim aktarmadan önce CO bir damla ekleyin.
  3. Yavaşça diğer tarafta sıcak jelatin atılması aynı zamanda, retina ve jelatin bloğu arasındaki bloğun bir tarafı üzerinde ısıtılmış% 4 jelatin enjekte tarafından jelatin bloğuna retina takın.
  4. Bir pastör pipet ile aspire 4% jelatin. Toplam sızdırmazlık sağlamak için 10 dakika boyunca bekleyin. Blok ve tamamen bıçak sokmak için CO 2 -i orta ekleyin.

4. Retina Kesit

NOT: Bu adım, başka retinal hücreler olmaksızın fotoreseptör hücrelerin bir tabakasının elde edilmesi için kritik öneme sahiptir (Şekil 1,).

  1. Jelatin blokta üst başlayarak, retina ulaşmak için 100 mikron seri bölümleri kesmek. Iç tabakasının 120 mikron bölümleri - Sonra 100 kesti. Uygulamaya bağlı olarak, bu tabaka göz ardı edilebilir veya sıvı azot içinde saklanır. Vibratome hızı iç tabakası veya fotoreseptör katmanların kesit sırasında (1 veya 2) çok yavaş olduğundan emin olun.
  2. Iç ve dış retina arasındaki ara yüze karşılık gelen retina ara madde 15 um bölümler yapın. Bir mikroskop altında bu bölümü gözlemleyin. kan damarlarının olmaması dış retina ulaşıldığını gösterir.
  3. Jelatin, dış retina 200 um (fotoreseptör) Kesme ve CO2 -i ortam 3 ml ile dolu bir 35 mm çaplı çanak aktarın. Tüm retina tüm fotoreseptör tabakası bölümleri elde edilinceye kadar buz üzerinde tutun.

5. dissociating fotoreseptör hücreleri

  1. (Çanak alınlar) fotoreseptör katman (lar) ihtiva eden ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatör içinde (onları) koyun.
  2. Forseps yavaşça jelatinden fotoreseptör tabaka ayrılır ve Ringer solüsyonu, 3 ml ile dolu yeni bir tabağına aktarın. Her fotoreseptör tabakası hazırlanması için bu adımı (5.2) tekrarlayın.
  3. 5 ml'lik bir polipropilen steril tüp içinde ve% 5 CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de 30 dakika inkübe (60 uM β-mersaptoetanol, 5.5 mM L-sistein 1,1 mM EDTA) aktivatör solüsyon, 25 ul papain 2 adet inkübe . papain aktivasyonu 37 ° C elde edilir. Bu kuluçka sırasında, (çok küçük) 2 mm2 parçalar halinde fotoreseptör tabakası kesilmiş ve 5 ml'lik bir tüp içine bu parçaları aktarın.
  4. Yerçekimi sedimantasyon, ardından çözelti Ringer çözeltisi, 1.5 ml ile iki kez retina durulayın. Numune ile tüp kalan Ringer çözeltisini çıkarın.
  5. Aktive papain ve karışımı içeren tüp Ringer solüsyonu 475 ul ekleyin. Retinayı içeren tüp Bu çözüm ekleyin.
  6. CO2 kuluçka% 5 içinde, 37 ° C'de 20 dakika boyunca retina ile tüp inkübe edin. DMEM,% 10 FCS, 1 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun. Ölüm hücrelerinden sindirilmiş DNA deoksiribonükleaz 25 U I (DNAz I) ekleyin. Dikkatli bir şekilde 1 mL pipet kullanılarak bir hücre süspansiyonu homojen hale getirilir. Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 50 xg'de dönerler.
  7. Serum izlerini silmek ve hücre-pelet (özel reagents_equipment tablosuna bakınız) takviyeleri ile DMEM ortamı ekleyin ve dikkatlice 1 ml pipet ile hücre süspansiyonu tekrar süspansiyon süpernatant atın. Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 50 xg'de dönerler. Bu adımı (5.7) kez daha tekrarlayın.

6 Kültürleme fotoreseptör hücreleri

  1. PN8 bir fare fotoreseptör bu tekniği kullanarak yaklaşık 1-1500000 hücreleri içerir. 1 de fotoreseptör hücreleri Tohumx 10 5 hücre / kültür ortamı ve kültür% 5 CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de 5 gün boyunca hücrelerin bir kültür plakasına cm2. 5. günde, immünokimyanın ve antikor tedarikçileri tarafından sağlanan batı lekeleme çalışma aşağıdaki yöntemlerden devam edin.
    Not: Adım kültür durdurmak ve ön testler referans 21'de açıklanmaktadır.

Sonuçlar

Yanı sıra, transplantasyon, fotoreseptör tabakalar da fotoreseptör kültürleri 12,22 yapmak için tohum hücreleri tarafından hücre sinyalini incelemek için kullanılmıştır. Ek olarak, gen ekspresyonu ve sirkadyen ritim 23,24 incelemek için kullanılır. Bu% 5 Şekil 1E CO2 (bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 5 gün boyunca hücrelerin FCS yokluğunda fotoreseptör kültürleri hazırlamak için doğum sonrası 8. günde, vahşi tip fare hücre fotoreseptör tabakadır ve korumuştur ). Hücreler daha sonra% 4 paraformadehid kullanılarak bekletilir ve daha sonra her iki fare monoklonal anti-RHO antikor tedarikçi tarafından sunulan yöntemler kullanılarak imünositokimyasal analizler için devam edildi (1: 250, Millipore Mab5316) veya tavşan poliklonal anti-SAG (1: 200, cömert Igal Gery ve David Hicks) hediye. Bu kullanılan anti-RHO ve anti-SAG (her ne kadar, anti-SAG etiket koniler ve çubuklar) anti-SAG, anti-RHO daha önceki bir marker olması nedeniyle. cel oranıAnti-RHO antikoru pozitif mı, anti-SAG antikorları (Şekil 2) için pozitif daha düşüktür. Bu SAG, çubuk arrestin da retinanın doğum sonrası olgunlaşma sırasında, SAG ifadesi olduğunu önceler gerçeği ile alternatif izole katmanda fotoreseptör% 3 yapmak, ya da koni tarafından ifade gerçeği ile açıklanabilir RHO'da 25,26 arasında.

fotoreseptör RNA CsCI ultrasantrifüj 27 kullanılarak hazırlandı ve fare DNA yonga dizisi hibridize edildi 35 gün arası hayvanların doğal tipte, retina ve beyin fotoreseptör göre, spesifik gen ekspresyonunu izlemek için kullanıldı. Beyin (Şekil 3A) ile karşılaştırıldığında rodopsin için haberci (Rho), S-arrestin (SAG) ve koni transdusin (Gnat2) retinada spesifik olarak ifade edilmiştir. sentezleme kapsar tüm retinada fotoreseptör daha tabakası (PR) göze çarpmaktadırİç retina tabakası bu genler fotoreseptör tarafından gerçekten ifade gösteren. Gnat2 için Rho SAG ile karşılaştırıldığında görece sentezleme İzole fotoreseptör tabaka içinde ihtiva edilen koni tarafından ifade edildiğini göstermektedir. Bütün retina göre fotoreseptör tabakada recoverin ifadesi (Rcvrn) (Şekil 3B) artar.

fotoreseptör tabakası, aynı zamanda RHO ve GNAT2 antikor tedarikçi tarafından sağlanan yöntemleri takip ederek Western blotting ile ekspresyonunu izlemek ve iç retina tabakasının (Şekil 4) tespit etmek için kullanıldı. Bütün retinada ve doğum sonrası 35 günlük rd1 fare retina sırasıyla RHO ve GNAT2 28, çubuk ve koni belirteçleri olmaması dikkat edin.

figure-results-1
Fisaat'in 1. fare retinanın vibratome kesit şematik görünümü. Vibratome bıçak ile iç retina (A) jelatin dilim aşağı bakacak fotoreseptör düz monte retina montajı. (B) Bölüm. Dış retina (C) Bölüm jelatin ekledi. (D) Kontrol fotoreseptör tabakasının izolasyonundan sonra retina fragmanı kenarında fotoreseptör varlığı. Yeşil floresan için kullanılan ölçek çubuğu beyaz ışık mikroskobu kullanılmaktadır. fotoreseptör resmin kenarında yer almaktadır. (E) Yetiştirme fotoreseptör hücreleri (post-beş gün). (F) Panel E. Yükseköğretim büyütme

figure-results-2
Fare fotoreseptör kültüründe RHO ve SAG Şekil 2. Diferansiyel ifadesi. Çekirdek (A) boyanması (mavi), (B) SAG boyama (yeşil), (C) RHO boyama (kırmızı). (D) görüntü birleşti. SAG boyama önceki RHO boyama daha ifade olduğundan, yalnızca iki hücre çift SAG ve RHO (bkz *) etiketli. Ölçek çubuğu:. 23 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

figure-results-3
Beyin ve bütün retina otuz beş gün arası vahşi tip hayvanların fotoreseptör üç gen ekspresyonunun 3. Karşılaştırma Şekil. (A), rodopsin (Rho), S-arrestin (SAG) ve koni transdusin (Gnat2). (B) Kalbindin (eden: calb1) ve Recoverin (Rcvrn). Veri göreceli ifade olarak gösterilir. göreceli ifade bir ekspresyon değerdirKBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/) bilgi veritabanında mevcut yazılım Sağlam Çok dizi Ortalama (RMA) ile normaliszation sonra mikroarray verileri elde.

figure-results-4
Iç retina ve doğum sonrası gün 35. ACTB, beta de rd1 fare retinada onların ifade doğum sonrası gün 35 Yokluğunda bir yabani tip retina dış retina RHO ve GNAT2 Şekil 4. İfade aktin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Retina biyoloji bir model organdır. Retinanın incelenmesi biyoloji 6 büyük keşiflere yol açtı. İlk tümör baskılayıcı gen RB1 kökeni yer almaktadır. Bu sevenless Oğlu ile etkileşim yoluyla reseptör tirozin kinaz ve MAP kinazlar arasındaki moleküler bağlantıyı ortaya koymaktadır. Bu Pax6, organ morfogenezisi ilk ana kontrol genin bulunmasından yer aldı. Bu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD) ile Kompleman faktör H (CFH'lik) genetik dernek merkezinde genom dernek ekranında (GWAS) tarafından tanımlanan ilk hastalık yatkınlık geni olduğunu. Son olarak, Leber konjenital amaurosis için ilk başarılı gen tedavisi neden, herhangi bir insan ilk düzeltici gen terapisi deneme hastalığı kalıtsal. bu organ yapısı çoğu omurgalı türünde muhafaza edilir. In vivo manipülasyon için onun erişilebilirlik yüzde bu parçası üzerinde fonksiyonel genomik soruşturmalar erken teşvik etmiştirSinir sistemini ral.

Biz vibratome kesit ile retinanın iç tabakasından fotoreseptör tabakasını ayırmak nasıl burada göstermek. Bu adım, saf fotoreseptör kültürleri elde etmek çok önemlidir. Bizim diseksiyon protokolü RPE hücreleri tarafından kontaminasyon çok olası hale getirir.

Büyük zorluklardan biri bölümüne doğru iç ve dış retina gerekli olan retinanın düzleşme olduğunu. retinanın kesit kemirgenler gibi küçük çaplı retina iyi ve bu çap güncel mevcut malzeme ile teknik bir kısıtlamadır.

Retina bir örnek üzerinde uygulama için, biyolojik olarak anlamlı bir deney başlamadan önce önerilir. Bu mRNA ve protein, her iki ekspresyon çalışma yapmak üzere malzeme kullanılarak, kültürlenmiş fotoreseptör hücrelerinin elde edilen temsili sonuçlar yöntemini açıklamaktadır. İfade çalışmaları da sezeryan üzerinde alternatif olarak yapılabilirns lazer yakalama mikro-kesim ile elde edilen, ama kültürleri en vibratome kesitlerinin kullanılarak gerçekleştirilir. Biz tam bir farklı strateji ile mikrodiseksiyon lazer tekniği kullanılmış olabilir. Ama, kültür için mikrodiseksiyon aparatı ile fotoreseptör tabakası toplamak, bu fiksatif önlemek için gerekli olacak ve bu anlamlı mevcut metodoloji karmaşık hale olacaktır.

Biz retinitis pigmentosa modellerinde fotoreseptör dejenerasyonu sırasında vibratome bölümlerde gen ve protein ifade kinetik incelemeyi amaçlayan bir protokol geliştiriyoruz. Biz protokol ayrıntılı açıklaması retina biyoloji alanındaki araştırmacılara yararlı olabilir, ve en başta proteomik ve metabolomic çalışmalar için inanıyoruz.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Anti-SAG antikorları için Igal Gery ve David Hicks. Ram Fridlich el yazmasını okuduğu için.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cytidine 5′-difosfokolin*Sigma-AldrichC02564.7 &mikro; M Sitidin 5&asal;-difosfokolin
Cytidine 5′-difosfoetanolamin*Sigma-AldrichC04562.7 &mikro; M Sitidin 5 & prime; -difosfoetanolamin
Linol & iuml; c asit / sığır serum albümini (BSA) *Sigma-AldrichL8384100 ve mikro; g / ml linol ve iuml; c asit / sığır serum albümini (BSA)
Triiyodo-L-tironin *Sigma-AldrichT63970.03 ve mikro; M Triiyodo-L-tironin
96 kuyulu plakalarGreiner bio-one655-095
Binoküler mikroskopLeicaMZ-75
CO2< / sub> bağımsız (CO2-< / sub>i)Life Technologies18045054
DMEM Yaşam Teknolojileri41966029
Forseps n° 5 DumontBionic11254-20
Domuz derisi tipi A'dan jelatinSigma-AldrichG2500
GeneChip AffymetrixU74v2
Gentamisin çözeltisiYaşam Teknolojileri15710049
Hidrokortizon*Sigma-AldrichH08880.55 & mikro; M hidrokortizon
İnsülin* (I)Sigma-AldrichI1884 (ITS)0.86 &mikro; M insülin (I)
PapainWorthington-biyokimyaWOLS03124
Poli-D-lizinSigma-AldrichP-6407
Progesteron*Sigma-AldrichP7556 2.0 ve mikro; M progesteron
Prostaglandin *Sigma-AldrichP51720.28 ve mikro; M prostaglandin
Putrescine*Sigma-AldrichP5780182 & mikro; M putresin
Neşter AlbionEMS72000
MakasMoria15396-00
Sodyum piruvat*Sigma-AldrichS86361 mM sodyum piruvat
Sodyum selenit* (S)Sigma-AldrichI1884 (ITS)0.29 &mikro; M Na2SeO3    (S)
Taurin*Sigma-AldrichT86913 mM taurin
Transferrin*(T)Sigma-AldrichI1884 (ITS)0.07 &mikro; M transferrin (T)
Vibratom aparatıLeicaVT1000-S
* Takviyeler

Kaynaklar

  1. The Organization of the Retina and Visual System. Webvision. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (2014).
  2. Perez De Sevilla Muller, L., Shelley, J., Weiler, R. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505 (2), 177-189 (2007).
  3. Mohand-Said, S., et al. Photoreceptor transplants increase host cone survival in the retinal degeneration (rd) mouse. Ophthalmic Res. 29 (5), 290-297 (1997).
  4. Daiger, S., Sullivan, L., Bowne, S. RetNet, the Retinal Information Network. , The University of Texas Health Science Center. Houston, TX. Available from: https://sph.uth.edu/retnet (2014).
  5. Mohand-Said, S., Hicks, D., Dreyfus, H., Sahel, J. A. Selective transplantation of rods delays cone loss in a retinitis pigmentosa model. Arch Ophthalmol. 118 (6), 807-811 (2000).
  6. MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444 (7116), 203-207 (2006).
  7. Yang, Y., et al. Transplantation of photoreceptor and total neural retina preserves cone function in P23H rhodopsin transgenic rat. PLoS One. 5 (10), (2010).
  8. Mohand-Said, S., et al. Normal retina releases a diffusible factor stimulating cone survival in the retinal degeneration mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (14), 8357-8362 (1998).
  9. Fintz, A. C., et al. Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (2), 818-825 (2003).
  10. Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues. Curr Gene Ther. 7 (2), 121-129 (2007).
  11. Wright, A. F. A searchlight through the fog. Nat Genet. 17 (2), 132-134 (1997).
  12. Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36 (7), 755-759 (2004).
  13. Lillig, C. H., Holmgren, A. Thioredoxin and related molecules--from biology to health and disease. Antioxid Redox Signal. 9 (1), 25-47 (2007).
  14. Fridlich, R., et al. The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina. Mol Cell Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
  15. Yang, Y., et al. Functional cone rescue by RdCVF protein in a dominant model of retinitis pigmentosa. Mol Ther. 17 (5), 787-795 (2009).
  16. Bennett, J. Strategies for delivery of rod-derived cone viability factor. Retina. 25 (8 Suppl), S47(2005).
  17. Komaromy, A. M., et al. Transient photoreceptor deconstruction by CNTF enhances rAAV-mediated cone functional rescue in late stage CNGB3-achromatopsia. Mol Ther. 21 (6), 1131-1141 (2013).
  18. Birch, D. G., Weleber, R. G., Duncan, J. L., Jaffe, G. J., Tao, W. Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. Am J Ophthalmol. 156 (2), 283-292 (2013).
  19. Cronin, T., et al. The disruption of the rod-derived cone viability gene leads to photoreceptor dysfunction and susceptibility to oxidative stress. Cell Death Differ. 17 (7), 1199-1210 (2010).
  20. Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Sci Transl Med. 2 (26), 26ps16(2010).
  21. Fontaine, V., Hicks, D., Dreyfus, H. Changes in ganglioside composition of photoreceptors during postnatal maturation of the rat retina. Glycobiology. 8 (2), 183-190 (1998).
  22. Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2. J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).
  23. Reichman, S., et al. The homeobox gene CHX10/VSX2 regulates RdCVF promoter activity in the inner retina. Hum Mol Genet. 19 (2), 250-261 (2010).
  24. Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. P. Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions. Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).
  25. Dorrell, M. I., Aguilar, E., Weber, C., Friedlander, M. Global gene expression analysis of the developing postnatal mouse retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (3), 1009-1019 (2004).
  26. Brooks, M. J., Rajasimha, H. K., Roger, J. E., Swaroop, A. Next-generation sequencing facilitates quantitative analysis of wild-type and Nrl(-/-) retinal transcriptomes. Mol Vis. 17, 3034-3054 (2011).
  27. Delyfer, M. N., et al. Transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using jouRNAI. J Vis Exp. (78), (2013).
  28. Ying, S., et al. A CAT reporter construct containing 277bp GNAT2 promoter and 214bp IRBP enhancer is specifically expressed by cone photoreceptor cells in transgenic mice. Curr Eye Res. 17 (8), 777-782 (1998).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Fotoreseptör Tabaka İzolasyonuFare Retina KültürüJelatin GömmePapain Sindirimiİmmünofloresan AnalizHücre Ekim ProtokolüRetinal Doku HazırlamaFotoreseptör Saflık DeğerlendirmesiÇomak Konu Canlılığı
Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.