Bu yazıda, erişkin sıçanlarda homolog kan pıhtıları (fibrin açısından zengin) ile embolik orta serebral arter tıkanıklığı oluşturmak için standart bir yöntem gösteriliyor. Bu model, insan iskemik inmesini yakından taklit eder ve iskemik inme için trombolitik tedavinin klinik öncesi çalışması için uygundur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sıçanlar Homolog Kan pıhtısı ile İskemik İnme emboli Orta Serebral Arter Tıkanıklığı (MCAO)
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Rekombinant doku plazminojen aktivatörü (tPA) kullanımı ile Klinik, trombolitik tedavi akut iskemik inme için en etkili tedavi yöntemidir. Bununla birlikte, tPA ve kullanımı bu yakın tedavi açısı ile ve hemorajik transformasyon riski ile sınırlıdır. Iskemik inme tedavisi için yeni trombolitik ajanlar ve stratejiler incelemek için uygun inme modeller geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. Intraluminal sütür MCAO'dan ve embolik MCAO'dan: Şu anda, iskemik inme modelleri başlıca iki türü sıçanlar ve farelerde geliştirilmiştir. Intraluminal sütür tekniği ile MCAO modeller yaygın mekanizması odaklı inme araştırmalarında kullanılan rağmen, bu sütür modelleri klinik durumu taklit değil ve trombolitik çalışmalar için uygun değillerdir. Bu modeller arasında, emboli MCAO modeli yakından insan iskemik inme taklit ve trombolitik tedavinin klinik öncesi araştırma için uygundur. Bu emboli modelin ilk Ov tarafından sıçanlarda geliştirilen1992 yılında diğ. 1 ergaard ve ayrıca Zhang ve arkadaşları tarafından karakterize edilir. 1997 2'de. embolik MCAO artan ilgi kazanmış olmasına rağmen, çok sayıda laboratuarlar tarafından karşılaşılan sorunlar vardır. Trombolitik araştırma için artan ihtiyaçlarını karşılamak için, biz MCA topraklarında öngörülebilir bir enfarktüs hacmini geliştirmek sıçan, embolik MCAO'dan son derece tekrarlanabilir model sunuyoruz. Kısaca, bir tadil edilmiş 50-PE tüp hafifçe MCA kökenini ulaşır kateterin ucuna kadar iç karotid arterin (ICA) lümenine dış karotid arter (ECA) ilerletilir. Kateter sayesinde, tek bir homolog kan pıhtısı MCA kökeni yerleştirilir. MCA tıkanıklığının başarısını belirlemek için, bölgesel serebral kan akımı izlendi, nörolojik açıkları ve enfarktüs hacimleri ölçüldü. Bu çalışmada sunulan teknikler inme araştırma için bu modeli kurulması için teknik sorunların üstesinden gelmek için araştırmacılara yardımcı olmalıdır. </ P>
Giriş
İnme ABD'de ölüm üçüncü önde gelen nedenidir, ancak akut inme için tedavi seçenekleri sınırlı kalmıştır. Şu anda, kan pıhtıları çözmek için yeniden birleştirici doku plazminojen aktivatörü (tPA) intravenöz infüzyon akut iskemik inmenin en etkili yöntemdir. Bununla birlikte, tPA ve kullanımı bu yakın tedavi açısı ile ve intraserebral kanama riski ile sınırlıdır. Bu nedenle, trombolitik araştırma için uygun inme bir modeli acilen ihtiyaç vardır.
Orta serebral arter (OSA) en sık insanlarda inme tıkalı arter olduğunu. Bu arter üzerinde duruldu, iskemik inme birçok hayvan modelleri kurulmuştur. Şu anda, MCA tıkanarak kemirgen fokal iskemi modelleri başlıca iki tip geliştirilmiştir: sütür MCAO modeli ve embolik MCAO modeli. Intraluminal sütür tekniği ile MCAO modeller yaygın mekanizması odaklı inme araştırmalarında kullanılan olmasına rağmen, bu dikiş modelleri yokİnsan strok% 80'ine kadar olan mimik insan felç, tromboz veya embolizmden kaynaklanır. Ancak, kan pıhtıları kullanarak embolik inme modeli yakından insan inme taklit ve trombolitik çalışma için uygun kabul edilir. Bu model, embolik ilk olarak 1992 yılında Overgaard ve ark. 1 ile sıçanlarda geliştirilmiş ve Zhang ve arkadaşları tarafından karakterize edildi. 1997 2 ve Dinapoli ve ark. 2006 3'te. Embolik MCAO artan bir ilgi kaynağı haline gelmiş olmasına rağmen, karşılaşılan sorunlar vardır, birçok laboratuvar.
Bu yazıda, MCA topraklarında öngörülebilir bir enfarktüs gelişebilir yetişkin sıçan homolog kan pıhtısı ile embolik MCAO'dan üretilmesi için standart bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu makalede sunulan teknikler Araştırmacılar felç araştırma için bu modeli kurulması için teknik sorunların üstesinden gelmek için yardımcı olmalıdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Etik Beyanı: (330-380 g ağırlığında) Sprague-Dawley sıçanları bu protokolde kullanılmıştır. Bu protokol LSU Sağlık Bilimleri Merkezi-Shreveport Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve (sekizinci baskı, Ulusal Bilimler Akademisi, 2011 'Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı için Kılavuz' ile uyumlu olduğunu edildi ).
Modifiye PE-50 Tube 1. Hazırlık
- Yavaş yavaş tüp yumuşatmak, El bir gaz ateş üzerinde bir 30 cm uzunluğunda PE-50 tüpü tutmak. Yavaşça tüp germek.
- Bir dijital kumpas (Şekil 1) kullanarak gerilmiş tüp üzerinde bir nokta seçin, işaretlemek ve (dış çapı: 0,30-0,34 mm) 1 cm uzunluğunda ucu 25 cm uzunluğunda segmentine modifiye PE-50 tüp kesti.
Homolog kan pıhtılaşması 2. Hazırlık
- % 70, N 2 O ve% 30 Ç izofluran (indüksiyon için 5%, bakım için 2-3%) olan sıçan anestezisi 2. Bir ayak tutam tarafından anestezi onaylayın.
- Yayımlanmış yöntemle 4 ile bir donör sıçan femoral arter kateterizasyonu gerçekleştirin ve 20 cm uzunluğunda PE-50 tüp içine doğrudan femoral arter kan aktarın. Pıhtı kan, oda sıcaklığında 2 saat boyunca Tüp, ve daha sonra 4 ° C'de 22 saat boyunca muhafaza tüpü. Not: sokulmuş adım 3.1 de tarif edildiği gibi, aseptik teknikle gerçekleştirilir. Donör sıçan başka numuneler için elde edilir.
- 50 mm'lik parçalar halinde PE-50 tüpü kesip, normal tuz içeren steril bir Petri kabı içine tüpten pıhtı dışarı floş.
- 60 mm uzunluğunda PE-10 tüpü içine 50 mm uzunluğunda bir pıhtı aktarın ve 23 G iğne ile, normal tuzlu su ihtiva eden 1 ml şırınga bağlı olan bir 20 cm uzunluğunda PE-50 tüpü için PE-10 tüp her biri ucunu (Şekil 2) .
- Kan hücreleri çıkarmak için, hangi 5 dakika boyunca diğer bir şırınga sürekli alternatif hareket ile pıhtı Shiftpıhtı ve fibrin çekirdek bozmadan, ekstravasküler pıhtılaşmış pıhtı kırılgan en aza indirmek.
- 40 mm uzunluğunda segmentine pıhtı kesin ve aseptik koşullar altında adım 1.2 de tarif edildiği gibi bir tadil edilmiş 50-PE kateter yoluyla pıhtı segmentini aktarın. Not: Tüm PE boru etilen oksit ile sterilize edilir.
3. Embolizan Orta Serebral Arter Tıkanıklığı (Şekil 3A, B)
- (En az 121 ° C, 15 dakika boyunca 15 PSI) otoklav ile tüm cerrahi aletleri sterilize. % 70 etanol kullanılarak ameliyat masası ve ilişkili cerrahi ekipmanı sterilize.
- Adım 2.1 açıklandığı gibi izofluran ile sıçan anestezisi. Her iki arka ayakları üzerinde bir ayak tutam yaparak anestezi derinliği test ve (pençe çekilmesi) gözlenen herhangi bir hareketi hayvan ameliyatı yapmak için yeterli anestezi olmadığını gösterir. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için her iki göze de veteriner merhem küçük bir miktar uygulayın. Ventral boyun ve baş re kürk Tıraşelektrik kesme makineleri ile bölgelerini cilt alanları ortaya çıkarmak için.
- Bir ısıtma yastığı yatar pozisyonda sıçan yerleştirin. Bir rektal prob, kontrolü yerleştirin ve bir homotermik battaniye kontrol ünitesi kullanılarak 36.5-37.5 ° C arasında vücut ısısını korumak.
- % 70 etanol ile takip% 10 povidon-iyot ile traş cildi ve çevresindeki kürk dezenfekte edin.
- Bir mikroskop altında boyun üzerinde 2 cm uzunluğunda orta hat kesi olun. Cerrahi alanında ortaya çıkarmak ve sağ karotis arter (CCA), eksternal karotid arter (ECA), internal karotid arter (ICA) ve pterigopalatin arter (KİK) çevresindeki sinirler ve fasya (Şekil 3A) ücretsiz teşrih Ekartörleri kullanın. Not: hiçbir Yardımcısı hayvan hazırlamak için yardımcı olur Ameliyattan önce, steril eldiven değiştirmek.
- (Vagus siniri zarar vermeden) çevreleyen sinirler CCA serbest incelemek ve arterin altında steril 5-0 ipek sütür koyun. Bir kayma düğüm (# 1) kravat ve küçük HEMOS kullanarak dikiş kavramaktat ve vücuda bakan tarafta öğretilen çekin.
- ECA ve onun iki şubesi, oksipital arter (OA) ve superior tiroid arter (STA) ayır. Bir veteriner elektrocerrahi ünitesi kullanılarak iki şubesi coagulate. ECA altında steril 6-0 ipek dikişlerle iki adet yerleştirin.
- Arter, kafasına doğru tek parça (uzak ucu) ve vücuda dönük alt alta yerleştirilmiş iki ipek ayırın. (2 #) başlığına en yakın olan tarafında, küçük bir hemostat olan ipek kavrama ve çekme kafasına doğru öğretilen sıkı bitişik harfleri bağla. Daha sonra kullanmak için başka ipek ile gevşek bir düğüm (# 3) hazırlayın.
- (Vagus siniri zarar vermeden) çevreleyen sinirler ICA ve PPA parçalara ayır. 6-0 sütür (# 4) ile PPA kravat. ICA (# 5) etrafında 6-0 sütür ile bir kayma düğüm yapın. Alternatif olarak, bir mikrovasküler klibi kullanarak ICA klibi.
- Bir Vannas tarzı yaylı makas ile sıkı (# 2) ve gevşek (# 3) ligatures arasındaki ECA içine küçük bir delik (sokmak 1/2) kesin. Modifiye PE-50 küvet yerleştirinCCA çatallanma kesi ve önceden içine kan pıhtısı içeren e. (3 #) yeterli lümen etrafında içinde yaşayan tüp hareketliliğini korumak sağlamak için gevşek ligatürün sıkın.
- Güdük özgür ve ECA ve ICA çatallanma altında güdük konumlandırmak için küçük deliğin yerinde ECA kesti; Bu modifiye tüp kolayca ICA slayt sağlayacaktır. ICA açın ve kateterin ucu MCA kökenini ulaşıncaya kadar yavaşça (~ 17 mm bifurkasyondan) ICA ECA'nın lümeninden tüp önceden. Not: Önce ECA,% 70 etanol ile borunun steril dış yüzeyi borunun ucu yerleştirin ve daha sonra steril fizyolojik tuzlu su ile yıkayın.
- 100 ul Hamilton şırıngası (Şekil 3B) ile 10 saniye boyunca 10 ul tuzlu su ile birlikte modifiye edilmiş PE-50 kateterden pıhtı enjekte edilir.
- 5 dakika sonra ECA kateteri. ECA kravat ve CCA açın. Boyun kesi dikin.
4. İzleme Bölgesel Beyin Kan Akışı (bBKA)
- Önceki MCA oklüzyon, kafatası kemiği ortaya çıkarmak için kafa derisi 1.2 cm uzunluğunda orta hat kesi yapmak. Bir diş kazıyıcı ve steril pamuk swapları ile kafatası kemik üzerinde dokuları çıkartın. Not: Ameliyattan önce, maruz kafa derisi alanı ve çevresindeki kürk% 70 etanol ile takip% 10 povidon-iyot ile dezenfekte edilir.
- 2 mm posterior ve 0.7 mm'lik bir küresel paslanmaz çelik çapak (Şekil 4) kullanılarak 5 mm bregma yanal yerleştirilmiş bir 1,5 mm çapında bir çapak delik delin.
NOT: sağlam dura tutun. - Prob dura yüzeyinden 0.5 mm yerleştirin. 0 (taban çizgisi) en kan akımında, 5, 15, 30, 60, 90 Monitör, emboli ve sonra 120 dakika devam 5, 15, 30, 45, ve tPA intravenöz uygulanmasından sonra 60 dk. RCBF'nin son ölçümden sonra, kafa derisi kesi dikiş ile kapatılır. Not: boyun kesi öncesinde biz MCA occlus önce taban olarak kan akımında ölçümiyonu temsil etmektedir. Mesaj MCA tıkanıklığı biz boyun kesi dikiş kapatılmasından sonra kan akımında ölçmek. Böylece boyun kesi steril tutulur.
5. Post-operatif Bakım
- Su kaybını önlemek ve hemen cerrahi ve ağrının giderilmesi için gerektiği kadar 6-12 saat sonra Buprenex (0,05 mg / kg, sc) enjekte etmek için salin solüsyonu, deri altında, 2.5 ml enjekte edilir.
- Izofluran anestezi durdurun. 37 ° C veteriner kurtarma odasında sıçan yerleştirin (hayvan sıcak tutmak) ve gözlem tutmak. Sıçan anestezi kurtarmak için genellikle 10 dakika sürer. Ardından, steril bir kafes içine hayvan koymak kafes içinde bir Petri kabındaki bazı ıslatılmış yemek yerleştirmek, ve hayvan sterilizasyon odasına kafesi dönmek.
- Inme sonrası 24 saat, sodyum pentobarbital (100 mg / kg vücut ağırlığı, IP) aşırı dozda sıçan euthanize.
6. Nörolojik Eksikliği Puan
- Öncesi ve embolizasyon sonrası 2 saatte Bederson skoru gerçekleştirin. Bir sınıflandırma kullanabilirsiniz s0-3 cale olarak daha önce 5 açıklandığı: kuyruk sıçan yükselterek, 0, zemine hem ön ayakları uzanan ve başka hiçbir açıkları sergileyen hayvan (normal hareket); 1, kuyruk tarafından sıçan yükselterek, kontralateral ön ayakları esnetin; 2, çizerek olmadan yanal itme (ve ön ayakları fleksiyon) karşı dirençte azalma; 3, çizerek ile grade 2 aynı davranış.
NOT: embolizasyondan sonra 2 saatte Bederson skoru = 0 (yok açığını) gösteren Sıçanlar daha fazla çalışma dışında tutulmuştur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Lazerli Doppler flowmetri (LDF), serebral iskemi 6,7 indüksiyonu sırasında kan akımında izlemek için kullanıldı. Bizim laboratuvar dahil pek çok laboratuar başarılı MCA tıkanıklığı olan hayvanları tanımlamak için kan akımında kullanarak edilmiştir, ancak bazal eşikleri ölçüm site ile ilgili laboratuarlar arasında değişiyordu. LDF bir prob 2 mm'lik posterior konumlandırılmış ve daha önce 6 açıklandığı gibi 5 mm'lik bregma lateral. CBF, 0 ° C'de izlenmiştir 5, 15, 30, 60, 90 ve 120 dakika pıhtı enjek...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada, MCA kökeni, bir fibrin pıhtısı zengin tarafından kapatılan edildiği sıçan, bir embolik MCAO felç modelinde gerçekleştirmek için standart bir yöntem gösterilmiştir. Bu modelin en büyük avantajı ise: fibrin-zengin kan pıhtısı ile MCA kök tıkanıklığı insanlarda tromboembolik inme benzer, embolik inme modeli fibrinolitik tedavinin klinik öncesi soruşturma yapılması için uygundur, ve bu model geliştirmek olduğunu MCA tarafından sağlanan topraklarında bir tekrarlanabilir ve öngörülebilir enfarktüs hacmi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Açıklayacak herhangi bir potansiyel çatışan çıkarımız yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe HL087990 (G.L.) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| rh-tPA | Kimyasal | Genentech | |
| 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür | Kimyasal Sigma | T8877 | |
| Anestezi buharlaştırıcı | Ekipmanları | Soma Teknolojisi | Dräger Buharı 19.1 |
| Şarj edilebilir yüksek hızlı mikro matkap | Ekipmanları | Güzel Bilim Araçları | 18000-17 |
| Kavisli makas | Ekipmanları | Güzel Bilim Araçları | 14117-14 |
| Dumont forseps (Tıbbi # 7) | Ekipman Güzel Bilim Araçları | 11270-20 | |
| Dumont forseps (Tıbbi # 5) | Ekipman | Güzel Bilim Araçları | 11251-35 |
| Vannas tarzı yaylı makas | Ekipman | Güzel Bilim Araçları | 15000-03 |
| Veteriner kurtarma odası | Ekipman | Peco Hizmetleri | V1200 |
| Genie plus şırınga pompası | Ekipmanları | Kent Scientific Corporation Sıçan | |
| beyin matrisi | Ekipmanları | Kent Scientific Corporation | RBMA-310C |
| Dijital kumpas ve nbsp; | Ekipman | Dünyası Hassas Aletler | 501601 |
| Diseksiyon mikroskobu | Ekipmanları | Dünya Hassas Aletler | PZMTIII-BS-LWD |
| Hamilton şırınga | Ekipmanları | Hamilton | model 710 |
| Homeotermik battaniye kontrol ünitesi | Ekipmanları | Harvard Aparatı | |
| Elektrikli kesme | makinesi Ekipmanları | Braintree Scientific | CLP-9931 |
| Veteriner elektrocerrahi ünitesi | Ekipmanları | MACAN İmalat Şirketi | MV-9 |
| Kan akış ölçer Ekipmanı | Adinstruments | ||
| PowerLab 4/30 | Ekipman | Adinstruments | |
| LabChart 7.2 | yazılımı | Adinstruments | |
| 1 ml şırınga | Sarf malzemesi | Becton, Dickinson and Company | 309659 |
| 23 G iğne | Sarf Malzemesi | Becton, Dickinson and Company | 305143 |
| 30 G iğne | Sarf malzemesi | Becton, Dickinson and Company | 305106 |
| PE-50 boru | Sarf malzemesi | Becton, Dickinson and Company | |
| 427517 PE-10 boru | Sarf Malzemesi | Becton, Dickinson and Company | 427400 |
| 6-0 İpek sütür | Sarf Malzemesi | Harvard aparatı | 723287 |
| 5-0 İpek sütür | Sarf Malzemesi | Harvard Aparatı | 517607 |
Kaynaklar
- Overgaard, K., Sereghy, T., Boysen, G., Pedersen, H., Høyer, S., Diemer, N. H. A rat model of reproducible cerebral infarction using thrombotic blood clot emboli. J Cereb Blood Flow Metab. 12 (3), 484-490 (1992).
- Zhang, R. L., Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q., Ewing, J. R. A rat model of focal embolic cerebral ischemia. Brain Res. 766 (1-2), 83-92 (1997).
- Dinapoli, V. A., Rosen, C. L., Nagamine, T., Crocco, T. Selective MCA occlusion: a precise embolic stroke model. J. Neurosci. Methods. 154 (1-2), 233-238 (2006).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J Vis Exp. 59 (3496), (2012).
- Bederson, J. B., Pitts, L. H., Tsuji, M., Nishimura, M. C., Davis, R. L., Bartkowski, H. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17 (3), 472-476 (1986).
- Henninger, N., Bouley, J., Bråtane, B. T., Bastan, B., Shea, M., Fisher, M. Laser Doppler flowmetry predicts occlusion but not tPA-mediated reperfusion success after rat embolic stroke. Exp Neurol. 215 (2), 290-297 (2009).
- Zhu, H., et al. Annexin A2 combined with low-dose tPA improves thrombolytic therapy in a rat model of focal embolic stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (6), 1137-1146 (2010).
- Cheng, T., et al. Activated protein C inhibits tissue plasminogen activator-induced brain hemorrhage. Nat Med. 2 (11), 1278-1285 (2006).
- Taniguchi, H., Andreasson, K. The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia. J Vis Exp. 21 (955), (2008).
- Sicard, K. M., Fisher, M. Animal models of focal brain ischemia. Exp Transl Stroke Med. 1 (7), (2009).
- Florian, B., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438 (2), 180-185 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
- Westendorp, W. F., Nederkoorn, P. J., Vermeij, J. D., Dijkgraaf, M. G., van de Beek, D. Post-stroke infection: a systematic review and meta-analysis. BMC Neurol. 11 (110), (2011).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats
Posted by JoVE Editors on 11/01/2014. Citeable Link.
A correction was made to Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats. The institution information was updated.
The institution "Louisiana State University Health Science Center" was changed to "Louisiana State University Health Science Center, Shreveport".
