Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

15.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51958

⸱

28 Eylül 2014

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Centre for Brain Research, University of Auckland, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Çift kayıtlar, tek tek nöronlar arasındaki sinapsların hassas elektrofizyolojik ve farmakolojik karakterizasyonunu sağlayan, sinaptik olarak bağlı iki nörondan eşzamanlı tam hücre yama kelepçe kayıtlarıdır. Burada, elektrofizyoloji için donatılmış herhangi bir laboratuvarda organotipik hipokampal dilim kültürlerinde bu tekniği oluşturmak için ayrıntılı metodolojiyi ve gereksinimleri açıklıyoruz.

Özet

Çift kayıtlar, sinaptik olarak bağlı iki nörondan eşzamanlı tam hücre yama kelepçe kayıtlarını içerir, bu da yalnızca bireysel nöronlar arasındaki sinaptik bağlantıların doğrudan elektrofizyolojik karakterizasyonunu değil, aynı zamanda presinaptik veya postsinaptik nöronun farmakolojik manipülasyonunu da sağlar. Organotipik hipokampal dilim kültürlerinde gerçekleştirildiğinde, iki nöronun sinaptik olarak bağlanma olasılığı önemli ölçüde artar. Bu hazırlık, hücre tiplerinin tanımlanmasını kolayca sağlar ve nöronlar, doğal beyin dokusundakine benzer şekilde morfolojilerini ve sinaptik fonksiyon özelliklerini korurlar. Eşleştirilmiş tüm hücre kayıtlarının önemli bir avantajı, hücre dışı aksonal stimülasyonu kullanan diğer daha kaba tekniklerle mümkün olmayan sinaptik iletim ve plastisite özellikleri hakkında sağlayabileceği son derece kesin bilgilerdir. Eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları genellikle gerçekleştirilemeyecek kadar zor olarak algılanır. Bu tekniğin zorlu yönleri olsa da, belirli donanım ve metodolojik kriterlere uyulması koşuluyla, tüm hücre yama klempleme konusunda eğitim almış herkes tarafından eşleştirilmiş kayıtlar gerçekleştirilebilir. Sinaptik olarak bağlı eşleştirilmiş kayıtlara ulaşma olasılığı, sağlıklı organotipik dilimler ve stabil mikromanipülasyon ile önemli ölçüde artar ve pre- ve postsinaptik tüm hücre kayıtlarının bağımsız olarak elde edilmesine izin verir. CA3-CA3 piramidal hücre çiftleri en yaygın olarak organotipik dilim hipokampal hazırlığında kullanılırken, bu teknik CA3-CA1 çiftlerinde de başarılı olmuştur ve aynı dilim hazırlığında sinaptik olarak bağlı herhangi bir nörona uyarlanabilir. Bu yazıda, elektrofizyoloji için donatılmış herhangi bir laboratuvarda bu tekniği oluşturmak için ayrıntılı metodoloji ve gereksinimleri sunuyoruz.

Giriş

Glutamat reseptörlerinin, merkezi sinir sistemi sinapslarda uyarıcı sinirsel iletimin çoğunluğu aracılık eder. Postsinaptik zar omurga başında lokalize iyonotropik glutamat reseptörlerinin iki ana alt tipi, N-metil-D-aspartat (NMDA) ve α-amino-3-hidroksi-5-4-proprionik-metilizoksazol asit (AMPA) reseptörleridir. Membran potansiyelleri istirahat, AMPA reseptörleri sinaptik iletimi sırasında postsinaptik akımının en taşımak. Hipokampta, NMDA reseptör postsinaptik zar içindeki AMPA alıcılarının sayısındaki değişiklikler tetiklenmesinde önemli bir rol oynar: bir "tesadüf detektörü" olarak hareket eden 1 sinaptik gücü 1 değişiklikleri başlatmak için, NMDA reseptör sinaptik mekanizmalar dahildir bir alt hücresel düzeyde öğrenme ve hafıza destekleyecek düşünülmektedir. Presinaptik iletici salıverilmesi paralel olarak sinaptik sonrası nöronu depolorizasyonun yanıt olarak, kalsiyum NMDA vasıtası ile içeri girenreseptör AMPA reseptörü ekleme veya kaldırma 2 başlatmak için. Bu reseptör dinamikleri sinaps plastisite temelini oluşturur: sinaptik kuvvetinde bir azalma uzun süreli depresyon 4 (LTD) ise, sinaptik mukavemetinde bir artış, uzun süreli potansiyasyon 2,3 (LTP) 'dir. NMDA reseptörleri, kendi indüksiyon kontrol edildiği düşünülmektedir sırasında nedenle AMPA reseptörü hareketi, sinaptik plastisite ifadesinden sorumlu olduğu düşünülmektedir.

Sinaptik iletim ve plastisite altında yatan kesin mekanizmaları belirlenmesi ideal sinapsların küçük nüfus, tek sinaps eğitim gerektirir. Bazı sinapslar oldukça nedeniyle sinaptik bağlantıların küçük ve dağınık doğası bu son derece zordur çoğu sinaptik popülasyonlarının bu seviyede, örneğin, 5 Tutulacak kaliks, eğitim için uygundur iken. İki büyük elektrofizyoloji teknikleri tek sinaptik bağlantıları incelemek için geliştirilmiştir: İlk minimal stimülasyon, nereyeBir presinaptik lif kabul edilir E ekstrahücresel uyarılmış. İkinci teknik synaptically bağlı nöronlardan gelen eş zamanlı iki tam hücre kayıtları yapılır kayıtları, eşleştirilmiş. Minimum uyarım önemli bir avantajı, aynı zamanda, bir sinaptik sonrası nöronu kayıt sırasında aksonal yolu içine, hücre dışı bir uyarıcı elektrot yerleştirme içeren gerçekleştirmek için hızlı ve nispeten basit olmasıdır. Bu tekniği kullanarak temel kaygısı, tek bir hücrenin güvenilir uyarılması nadiren yargılamadan sonra deneme garanti edilebilir olmasıdır.

Son on beş yıl içinde biz rutin iki synaptically bağlı piramidal nöronlar 6-17 gelen tüm hücre kayıtları paired var. Bu tekniğin önemli avantajı, yalnızca bir presinaptik sinir tutarlı ve güvenilir şekilde uyarılır olmasıdır. Ayrıca, elektrofizyolojik karakterizasyon değil, aynı zamanda presinaptik nöron 6,18 işleme izin vermemekte,/ Sup>. Bununla birlikte, nöronlar arasındaki sinaptik bağlantı olasılığı 19 elde etmek için çift bağlantılı zorlaştırır düşüktür. Organotipik beyin dilim kültürlerinin kullanımı sinaptik bağlantı olarak bu engel, in vitro olarak yeniden tesis ve ayrıca elde edilen bağlantı yapısı doğal beyin dokusunda 20 benzerdir aşılmaktadır. Ayrıca, organotipik kültürler için plastisite mekanizmalar sağlayan, LTP, LTD 7-10,12-15,21 ve eşleştirilmiş-darbe kolaylaştırma (KOF) ve depresyon (PPD) 6,22,23 dahil kısa vadeli sinaptik plastisite ek form ifade nöronların çiftleri olarak incelenebilir. Burada bunu başarılı bir şekilde in vitro sistemde eşleştirilmiş kayıtları elde katılan ayrıntılı yöntemler tarifedilmiştir. Bu bilgiler kolaylıkla akut dilimleri ve diğer beyin bölgeleri de dahil olmak üzere diğer deney sistemlerinde, adapte edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan Etik Beyanı:

Bu yazıda anlatılan protokoller Auckland ve Stanford Üniversitesi Üniversitesi tarafından kurulan hayvan bakım yönergeleri izleyin. P7 sıçan yavrular hızlı dekapitasyon ötenazi edildi. Hipokampal diseksiyon hemen sonra aşağıda tarif edildiği gibi gerçekleştirilir.

1. Organotipik Hipokampal Dilim Kültür

  1. Hazırlık
    1. (Beyin diseksiyon için sadece kullanılır) diseksiyonu Orta hazırlayın. 5 ml HEPES tampon çözeltisi, 2 ml 1 M Tris stok çözeltisi (pH 7.2) (0.85% NaCl, her biri 10,000 birim) 200 ml Asgari Temel Ortam, 2 ml penisilin-streptomisin solüsyonu birleştirin ve filtre 0.22 um filtre ile sterilize . Buz-soğuk diseksiyon ortamda hipokampal diseksiyonu yürütmek.
    2. Diseksiyon orta soğutun. Yaklaşık 1 saat önce sıvı çok soğuk kadar diseksiyon başlamadan dondurucuda diseksiyon ortamı yerleştirin. Büyük buz cr izin vermeyinystals oluşturur. Gerekli kadar buz üzerinde muhafaza edin.
    3. (Hippocampi diseksiyon dışında her şey için kullanılır) kültür ortamı hazırlayın. / L-glutamin, 2 ml penisilin-streptomisin solüsyonu, w Hank tuzları w / 100 ml Asgari Temel Ortam, (1x konsantrasyonu, sıvı) birleştirin (% 0.85 sıvı, her biri 10.000 adet NaCl), 2.5 mi HEPES 1 M tamponu Çözelti, 50 mi Hank Dengeli Tuz Çözeltisi, 50 mi At Serumu (tanımlandığı gibidir, ısı ile inaktive edilmiş), ve filtre 0.22 um filtre ile sterilize edilir.
    4. Kültür yemekleri hazırlayın. 35 mm kültür tabağı başına kültür ortamı, 1 ml yerleştirin ve her bir tabağa, bir zar ek eklemek. Bir 150 mm Petri kabı içine bu yemekler yedi kadar koyun (bir 'plaka' olarak anılan). Yemekler, kültür ortamı, uygun sıcaklık ve pH doldurduğu şekilde diseksiyon başlamadan önce en az bir saat boyunca bir CO2 inkübatör plaka koyun.
  2. Postnatal Gün 7 de Rat Yavrularının gelen Hipokamplardan diseksiyonu (P7)
    1. İşlemden önce UV ışık altında tüm diseksiyonu araçları Ön sterilize.
    2. Hızlı başı kesildikten sonra, bir tabak soğutulmuş ortama beyin ve yer kaldırın ve sonra diseksiyon için nemlendirilmiş filtre kağıdı bir parça için onu kaldırın. Hipokampus açığa künt pürüzsüz plastik kaplamalı minyatür spatulası kullanarak uzak orta beyin korteksi kızdırmak. Forniksinin kesin, sonra yavaşça (Şekil 1A) dışarı çevirmek için hipokampus altında spatula çalışır.
      NOT: Başarılı dilim kültürleri P10 kadar hayvanları kullanılarak hazırlanabilir.
    3. Uzak beynin geri kalanından izole hipokampus kesin. Nemlendirilmiş yumuşak bir fırça kullanarak soğutulmuş diseksiyonu medya içeren yeni bir tabağa aktarın hippocampi (örneğin, beyaz samur # 4).
    4. Bu süngerimsi, meninge gibi dokular zor hipokampus ayırmak için yapmak gibi, diseksiyon sırasında koroid pleksus hipokampusun alt (yani düz tarafı) temizleyindaha sonra birbirinden dilimleri.
      NOT: nazikçe alay edilemez ise yerde bu dokuları bırakın.
    5. Hippocampi zarar vermeden mümkün olduğunca hızlı tüm diseksiyon.
      Not: dikkatli bir diseksiyon sürece deneysel koşullar soğutulmuş olarak, hızlı bir daha önemlidir. Aynı anda üç fareden hipokampları dilim. Kaplama dilimleri inkübatör içine gitmek dilim sağlık için kadar baştan toplam süre olarak etkilenmez 30 dakika altındadır.
  3. Dilimleme
    1. Transvers bir biçimde el doku dilicisi kullanılarak 400 um enine bölüme hipokampları dilim. Dilimleme gerçekleştirilen edildiği gibi bir yöntem, ince dokulu kağıdın aşırı zarar vermeyen ve (Ammon Boynuz kolayca dokusunda korunması gerekli görülmektedir) yani, hali hazırda görünür laminer mimarisi ile tutarlı kalınlıkta dilimler üretiyor sürece, önemli değildir.
    2. Doku sahnede hippocampi Lie# 2 filtre kağıdı üçlü kalınlığı üzerinde kıyıcı. Hipokamplar (daha ziyade bu noktada dilimlenmiş ekmek somunları gibi; Şekil 1B tüm kesimler yapılana kadar tüm hipokampus helikopterde sahnede kalan yani), her tür dilimleri çıkarmadan tamamen dilimlenmiş.
    3. Her hipokampus yanında koydu yumuşak bir fırça (2 beyaz samur #) kullanarak diseksiyon ortama hippocampi aktarın. Yavaşça hipokampus ve altta uzanan filtre kağıdı arasındaki yapışmayı kırmak için yan her hipokampus itin. Sahneden onu almak için her hipokampus altına fırçayı döndürün. Soğutulmuş diseksiyon ortamının aynı 35 mm Petri kabı içine tüm hipokampları yerleştirin. Elle saat yönünde ve saat yönünün tersine hareketleri alternatif olarak çanak ajite tek tek dilimler halinde hippocampi ayırın.
    4. Bir mikroskop altında dilimleri kontrol edin ve açıkça görünür hücre sahip değil, küçük hasarlı veya hangilerinin herhangi atınVücut katmanları.
      NOT: Bu genellikle tüm dilimleri başarıyla bu şekilde onların kardeşleri ayrılır değil böyle olacaktır. Bu durumda, kenar çevirerek ve ince forseps uçları ile kışkırtmaktansa ile ayrılabilir. "İyi" dilimler kesilir ve yangın cilalanmış Pasteur pipet (Şekil 1C-E) kullanarak soğutulmuş diseksiyon orta içeren bir başka temiz bir Petri kabı aktarılır.
  4. Depolama
    1. Membran filtre ekler üzerine tek tek dilimler yerleştirin. Pasteur pipet kullanarak kesti ve yangın, büyük bir delik vermek ayrı kültürü ekler dilimleri aktarmak için cilalı.
      NOT: Kesme ve ateş cilalı pipet önemlidir oluşturulan deliğin büyüklüğü. Çok küçük ve dilimler kolaylıkla membran için pipet bırakmaz. Çok büyük ve fazla sıvı dilim ile birlikte, zarın yüzeyi üzerine yerleştirilir. En iç çapı, tipik olarak yaklaşık yarısı olan çappipet namlunun etre. Kesme esnasında, bu çap pipet incelen uygun yerde kesilerek seçilebilir.
    2. Dilim Transferi
      1. İlk orta ile pipet doldurun, ve sonra küçük emme güçleri ile tek bir dilim kadar emmek. Bu pipet açılışına yakın dilim tutar ve dilim yerleştirmek için ekleme içine çok fazla orta çıkmaları önlenir.
      2. Küçük bir asılı damla oluşturulması için ampul hafif bir basınç uygulanır, bu dilim damlacık içine yerleşir ve daha sonra zarın bu damlacık dokunun ve zar üzerine dilim "düşüş" izin verir. Genel olarak üç dilim her zar elemanının üzerine yerleştirilir.
        Not: sıvı damlacık çok büyükse, üç dilim gelen damlacıklar, membran yüzeyinde birleştirme eğilimi ve dilimler bu nedenle tüm daha zor, daha sonra elektrofizyolojik kayıt için onları ayırmak için yapım zarın merkezi toplayacaktır.
    3. Sıvı Removal
      1. Dilimleri dalmış veya diseksiyon orta bir havuzu ile çevrili değildir, böylece o plaka tüm dilimleri (uç başına 3 dilim = plaka başına 21 dilim) için kültür plaka ucun üstünden herhangi bir aşırı orta aspire.
      2. Bu bir kesilmemiş ile olan gerçekleştirin, ancak yangın cilalı Pasteur pipet. Dilim yerleşmek ve pipetlemeden önce bir dakika membran uymak için izin verin. Yukarı pipet içine dilim emmek için özen. Dilimleri yerleşmek için yeterli zaman tanımak için, ilk ekilir uçlar için sıvı kaldırma yürütmek.
    4. Dilim Depolama
      1. 37 ° C'de% 5.0 CO2 inkübatöründe saklayın dilim kültürleri. Şekil 1 E'deki kültürlerin nihai düzenleme dikkate alınmalıdır. Her bir diliminin bir tabanı için bir gözenekli membran içeren bir kültür plakasında eki üzerine oturmaktadır ve bu uç orta küçük bir miktarı ile doldurulur ve bir Petri kabı içine yerleştirilir; Bu yolla, dilimler bana batmayankireç, sodyum, ancak kültürü plakası, parçanın alt zar içinden erişime sahip.
      2. İsteğe bağlı olarak, kültür plaka elemanını kaldırarak veya bir dilim içeren insert membran bir bölümünü keserek olabilir çalışma için ya dilimleri çıkartın.
  5. Bakım
    1. Kültürleri yaptıktan sonra bir gün Petri yemekler orta değiştirin. Transfer edilmeden önce en az bir saat boyunca inkübatör, denkleştirilmektedir taze kültür aracı maddesi 1 ml içeren yeni bir petri etmek için kültür plakası elemanını aktarın.
    2. Kültür yapıldıktan sonra üçüncü günde aynı şekilde tekrar orta değiştirin. Üçüncü gün, 34 ° C'ye ayarlanmış bir kuluçka kültürleri aktarın. Iki kez, her hafta (her 3-4 gün) orta değiştirin.
    3. Sağlıklı kültürleri tanımlamak. Eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları için sağlıklı kültürleri seçin.
      Not: Sağlıklı kültürler iyi tanımlanmış bir kenarı açık bir şekilde tanımlanmış ve piramidal hücre tabakası vardır. Kültürler zekâsaat karanlık (olasılıkla nekrotik) alanlar mevcut veya düzleştirilmiş sınırları ile bir vaküollu görünüm reddedilir. Bu kriterlere istihdam, dilim kültürlerin genellikle iki-üçte yeterince kayıt için sağlıklı.
    4. Zaman oldukça küçük bir pencere olan bu kültürleri yararlanın. Nöronlar yavaş yavaş zamanla kötüleşir biraz epilepti davranışı göstermek için başlar beri fazla iki hafta boyunca kültüre değil kullanılan dokularda yapın. Nöronal hayatta kalma kesin üst sınırı bilinmemektedir ancak kültürde piramidal hücreleri gibi geç 16 haftaya kadar çalışmasını kaydetmek mümkündür.

2. Eşli Tüm Hücre Kayıtlar

  1. ACSF ve Hücre içi Çözümleri
    1. 120 potasyum glukonat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 kadar NaATP ve 0.3 NaGTP (;: 290 mOsm ozmolarite, KOH ile pH 7.2) ile (mM olarak) karıştırılması ile presinaptik elektrot çözeltisi hazırlayın. Aynı elektrot çözeltisi ve postsinaptik nöronların, sezyum glukonat için kullanılır iken (120 mM), Başlıca postsinaptik elektrotta tuzu artı 5 mM QX314 olarak kullanılır.
      NOT: Bu postsinaptik NMDAR aracılı akımları 8-10,13 kaydetmek için olumlu potansiyelleri stabil voltaj kelepçeleme sağlar. Ayrıca Giga ohm mühür yapılmadan önce postsinaptik bir kayıt elektrotu akan iç çözelti ile presinaptik nöronların potasyum kaynaklı aşın engeller.
    2. (MM olarak) oluşturan postsinaptik elektrot çözeltisi 120 sezyum glukonat, 40 HEPES, 5 MgCl2, 5 QX314, 2 kadar NaATP ve (;: 290 mOsm ozmolarite CsOH ile pH değeri 7.2) içinde 0.3 NaGTP hazırlayın. 5-10 M? Direnci cam Mikroelektronlar çekin ve filtre iç çözümü ile doldurun.
    3. Yapay serebrospinal akışkan (ACSF) 119 NaCl, 2.4 KCl, (mM olarak) oluşturan hazırlayın MgSO 4 1.3, 2.4 CaCl2, 1 Na 2 HPO 4, 26.2 NaHCO3,% 95 O, 2, 5 ile doyurulmuş 11 glukoz, pH 7.4, % CO 2. NOT: r AMPAR aracılı iseesponses, NMDAR EPSCs incelenmesi için bloke gereken ACSF 10 mcM CNKX veya NBKX içerir.
  2. Eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar elde
    1. İki ayrı nöronlar arasındaki sinaptik iletimi incelemek için, presinaptik nöron olarak bir nöron tayin ve aksiyon potansiyelleri teşvik ve sinaptik iletimi başlatmak için geçerli kelepçe tutun.
    2. Postsinaptik nöron olarak, ikinci nöronu tayin ve araştırmacı tarafından gerekli bilgilere göre akım veya gerilim kelepçe tutun. Gerilim kelepçeye postsinaptik nöron tutarak mV 6-16 30 muayene -65 mV muayene AMPAR-aracılı EPSCs ve NMDAR-aracılı EPSCs ile Glutamaterjik akımları, ayrıntılı muayene edinin
    3. Eşleştirilmiş bir kayıt oluşturun. Eşleştirilmiş bir kayıt oluşturmak için, presinaptik bütün hücre kayıt daima çok sayıda arka arkaya ve postsinaptik nöronların sağlayan, ilk elde edilen bağlandığını sinaptik bir ürünle elde edilene kadar edilmesid elde edilir. Sinaptik plastisite deneyler, bu LTP 8,19 için gereken sitoplazmik faktörleri ile yıkama önlemek için bütün hücre kayıtları elde 10 dakika içinde başlatılmalıdır postsinaptik nöron LTP indüksiyonu ilk olarak presinaptik nöron elde edilmesi için özellikle kritiktir.
    4. Hareket ile tetiklenen hücre kaybını önlemek. Eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları gerçekleştirerek büyük bir meydan okuma titreşim ve ikinci kayıt elde ederken ilk tam hücre kayıt hareketi kaynaklı bozulmasını önler edilir.
      1. İlk tüm hücre kayıt elde ve kurulan kayıt monitör (Şekil 2A) görünen alanının kenarında yer alır, böylece daha sonra x-ekseninde mikroskop objektif 10-200 mikron taşıyın.
      2. ACSF hala lens ile temas muhafaza sağlarken ~ 5-10 mm mikroskop merceği kaldırın. İkinci elektrot takın ve (sıvı menisküste içine Şekil 2B kılavuz ).
      3. Bu lensten ışık yolu altında olduğunu, ancak hala önemli kurulan kayıt elektrot yukarıda kadar xy düzleminde elektrot hareket ettirin. Elektrot mikroskop altında görünür olduğunda, uzak ucu birinci elektroddan monitörün uzak kenarında olduğundan emin olun.
      4. Her iki elektrot, aynı odak düzleminde kadar odaklı mikroskop dizisinde ikinci elektrot aşağı doğru hareket ettirin. Bu ilk bütün hücre kayıt bozacak şekilde pozitif basınç düzeyi çok güçlü uç tıkanmayı önlemek için yeterince sağlam, ancak olması önemlidir. Bu, ilk olarak dilim girdiğinde elektrottan 2-3 nöronlarda hareket indükleyici pozitif basınç çevirir.
      5. İlk presinaptik kaydı (Şekil 2C) benzer bir odak düzleminde bir postsinaptik ortağı bulun. Kayıt genellikle ilk r bir 0-200 mm nöron CA3 piramidal nöronların ikinci tüm hücre arasındaki kayıtları eşleştirilen Obtain edilirayıt (Şekil 2C, d).
        NOT: nöronal çiftleri arasındaki Sinaptik iletim kadar 3-4 saatlik süreler boyunca stabil olan bu standart tüm hücre kayıt tekniklerini kullanırken.
  3. Sinaptik plastisite: Bir kez başarılı synaptically bağlı piramidal hücre çifti elde edilmesi üzerine (Şekil 3A, B), sinaptik iletim ve plastisite özelliklerini incelemek.
    1. LTP indüksiyon.
      1. 1 dakika boyunca 0 mV (Şekil 3C) 7-9,12-14 -10 için postsinaptik depolarizasyon ile presinaptik aksiyon potansiyelleri (1 Hz) eşleştirme tarafından LTP neden. Break-postsinaptik nörona 10 dakika içinde eşleştirme başlatın.
        Not: LTP da postsinaptik aksiyon potansiyeli ile, 1 dakika için 1 Hz presinaptik ve postsinaptik aksiyon potansiyelleri eşleyerek mevcut kelepçede tutulmuştur, her iki nöron ile indüklenebilir presinaptik nöron 8 içine enjekte edildikten sonra akım 10 msn ortaya çıkardı kadar.
    2. Bundan başka 5-10 dakika (Şekil 3C), 9 -55 mV'ye sinaptik sonrası nöronu hafif bir şekilde depolarize ile birlikte 1 Hz düşük frekansta (LFS) ile LTD neden olur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sinaptik bağlantı kayıt elektrot aracılığıyla bir depolarizan akım darbesi (20 msn için genellikle 20-50 pA) ileterek bir aksiyon potansiyeli presinaptik nörona uyararak açıktır. Postsinaptik akımı iz bu presinaptik hareket potansiyelini (Şekil 3A) ve pikten sonra kısa (<5 ms) ve tutarlı bir tepki vermişlerdir gecikmeleri olan monosinaptik bir batık EPSC varlığı açısından incelenir. Bir synaptically bağlı çifti elde edilebilir önce en deneylerde birden postsinaptik nöronlar test edilir. Genel olarak,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada Organotipik hipokampal dilim kültürlerde başarılı eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları kurulması için gereksinimleri tarif etmişlerdir. Eşli kayıtlar da akut dilimleri ve ayrışmış kültür sistemleri 26,27 dahil olmak üzere birden hazırlıkları, yapılabilir. Odak burada sinaptik plastisite (yani LTP ve LTD) uzun formları indüksiyon olmuştur ederken, kısa bu organotipik, akut dilim o eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları vurgulamak önemlidir ve hücre preparatları quantal boyutu önemli bilgiler sağladı disosiye Va...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Teşekkürler

Montgomery ve Madison laboratuvarlarının üyelerine yararlı tartışmaları için teşekkür ederiz. Bu araştırmada aşağıdaki kaynaklardan alınan finansmanı kabul ediyoruz: NFNZ, AMRF, Marsden Fonu, HRC ve NIH.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Minimum Esansiyel OrtaKararlı motorlu mikromanipülatörler 
Penisilin-Streptomisin çözeltisi Sığ doku banyosu
HEPES tampon çözeltisiDIC kamera
1 M Tris stok çözeltisiAmplifikatör
Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi
Bilgisayar At Serumu Titreşim izolasyon masası
Plastik kaplı minyatür spatulalarDik mikroskop
Yumuşak boya fırçasıVeri edinme ve analiz yazılımı
Manuel doku doğrayıcıElektrot çektirme
# 2 Filtre kağıdıFaraday
kafesi # 5 Forseps
Membran ekler
CO2 inkübatör
Diseksiyon başlığı
Sınıf II başlık

Kaynaklar

  1. Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
  2. Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation - A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
  3. Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
  4. Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
  5. Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
  6. Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
  7. Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
  8. Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
  9. Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
  10. Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48(2005).
  11. Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
  12. Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, (Pt 11) 1929-1946 (2010).
  13. Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, (Pt 18) 4491-4510 (2011).
  14. Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
  15. Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
  16. Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
  17. Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
  18. Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
  19. Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
  20. Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
  21. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  22. Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, (Pt 1) 163-176 (1996).
  23. Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
  24. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
  25. DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
  26. Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
  27. Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
  28. Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
  29. Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
  30. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  31. Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Sinaptik İletimYama Kenetleme ElektrofizyolojisiCA3-CA3 Piramidal HücreleriSinaptik PlastisiteÇift Tüm Hücre KayıtlarıMinimal Sinaptik DevreHipokampal Dilim KültürüElektrofizyoloji Düzeneği
Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.