Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

Özet

Bu protokol, yüksek hücre canlılığı ve farklılaşması ve polarizasyon tam makrofaj kapasitesini muhafaza ederek, yüksek transfeksiyon verimi olan elektroporasyon ile siRNA veya plazmit DNA'sı ile insan THP-1 makrofajlar transfekte etmek için etkin ve güvenilir bir yöntem sunmaktadır.

Özet

Makrofajlar, doğuştan gelen bağışıklık yanıtının önemli oyuncuları olarak, doku homeostasis veya çeşitli patolojiler ile ilgili araştırma odağında bulunmaktadır. SiRNA ve plazmid DNA ile transfeksiyon onların işlevini incelemek için etkili bir araçtır, ancak makrofaj transfeksiyonunun önemsiz bir konu değildir. Ökaryotik hücrelerin transfeksiyonu için çok farklı yaklaşımlar mevcuttur, ancak az sayıda makrofaj güvenilir ve verimli transfeksiyona, ancak daha az hücre canlılığı ve sık görülen farklılaşma veya polarizasyon için azalmış yeteneği gibi ciddi bir şekilde değiştirilmiş bir hücre davranışını verir. Bu nedenle, bu şekilde transfeksiyon protokol, normal hücre davranış bağlamında siRNA etki ya da plazmid soruşturma izin ciddi yan etkilere neden olmadan makrofajlara siRNA ve plazmid DNA aktarma yeteneğine sahip olması gereklidir. Burada sunulan protokol güvenilir ve etkili bir insan THP-1 makrofajlar ve mo transfekte edilmesine yönelik bir metot sağlar;Yüksek hücre canlılığı, yüksek transfeksiyon verimlerine ve hücre davranışı üzerinde minimum etki nocytes. Bu yaklaşım nucleofection dayanmaktadır ve protokol transfeksiyondan sonra hücre aktivasyonu için maksimum yeteneği sağlamak için optimize edilmiştir. Protokol süspansiyon içinde ayrılması ve hücre sonra yapışık hücreler için yeterli olduğunu ve orta örnek sayı için, küçük için kullanılabilir. Bu yüzden, sunulan bu yöntem, makrofaj farklılaşması ve polarizasyon esnasında gen düzenleyici etkilerini araştırmak için yararlıdır. Apart alternatif bir kimyasal yönteme göre bu protokole göre transfekte makrofajlar karakterize sonuçlarını sunma, hücre davranışı üzerindeki transfeksiyonundan sonra hücre kültür ortamı seçimi etkisi de tartışıldı. Sunulan veriler, farklı deneysel ayarları için seçimi doğrulama önemini göstermektedir.

Giriş

İnsan bağışıklık sisteminin hücresel bileşenleri arasında, makrofajlar, doğal immun cevabın için büyük önem taşımaktadır. Onların görevleri çeşitlidir; onlar genelde patojenlere ve nekrotik malzeme fagositozu katılan, doku homeostazında önemli bir rol oynayabilir ve düzenleyen ve bağışıklık yanıtı düzenlemek için ¹ sitokinlerin çok sayıda üretmek ve salgılamak. Bu nedenle bütün olarak makrofajlar, pek çok fizyolojik ve patofizyolojik süreçler koşullarda katılmaktadırlar. Nedeniyle görevlerinin çeşitliliği, makrofajlar çok heterojen ve çok yönlü hücre tipi vardır. Bu, farklı polarizasyonlar ile elde edilmektedir; dış uyaranlara makrofajlar bağlı olarak farklı fenotipleri ² dönüşebilir. Immün yanıta makrofajlar 'değişkenliği ve etki onlara çok ilginç bir araştırma konusu yapmak. In vitro bir model, karmaşık metabolik ve düzenleme işlevini uygun makrofajlar aydınlatmak amacıyla Shawnee Nationaledinilmiş doğru makrofaj karışıklığını ve değişkenliği yansıtmaktadır.

Hücresel bir gen ekspresyonunu değiştirmek için plazmid DNA vektörleri ya da küçük müdahale edici RNA'lar (siRNA'lar) ile hücrelerin transfeksiyonu gen regülasyonu ve gen işlevini hem de incelemek için, hücre biyolojisi yaygın olarak kullanılan ve güçlü bir araç haline gelmiştir. Şu anda ökaryotik hücrelerin transfeksiyonu için mevcut farklı araçlar büyük bir seçim var. Bu araçlar hücrelere ^3, viral vektörler, (örneğin, bir gen tabancası gibi) mekanik yöntemlerle, (nükleik asit ile kompleksler oluşturabilir polimerler veya lipitler dayanan) kimyasal yaklaşımlar uygulanmasını ve elektroporasyon yer alır. Bu yaklaşımların hepsinin avantajları ve dezavantajları vardır ve belirli bir hücre tipi ve uygulama için, bu geniş diziden en uygun seçimi zor ve zaman alıcı bir süreç olabilir.

Makrofajlar hemen hemen tüm köklü transfe transfect oldukça zorduravranış yaklaşımlar büyük ölçüde makrofajlar 'canlılığı azaltmak ya da davranışları, yani farklılaşma ile ve özellikle polarizasyon müdahale. Bu yüzden, burada DNA düşük miktarda gerektiren optimum bir elektroporasyon yaklaşımı temsil elektroporasyon bazlı Nucleofector teknolojisi kullanılarak insan THP-1 makrofajlar transfekte etmek için etkili bir viral-olmayan protokol mevcut. Nucleofection, monositler ve makrofajlar gibi hassas hücrelere için çok uygundur. Bu protokol daha önce yayınlanmış sürümleri ^4,5 bir uyarlamasıdır.

Kısaca, forbol 12-miristat 13-asetat (PMA), önceden siRNA veya plazmit DNA ile transfeksiyondan erken makrofajlara 48 saat boyunca insan monositleri, THP-1 ayırt etmek için kullanılır. Transfeksiyon için predifferentiated makrofajlar Accutase Ben tedavi ile enzimatik ayrılır. Transfeksiyon hücrelerin elektroporasyonu için Nucleofector 2b cihazı kullanılarak gerçekleştirilir. Transfeksiyondan sonra, farklılıkayırt edilmesi gereken şekilde bir 24-48 saat boyunca devam edilir. Son olarak, olgun transfekte edilmiş makrofaj fonksiyonel çalışmalarda bileşiklerin çeşitleri ile inkübe edilir.

Bu yaklaşım, insan THP-1 monosit ve makrofajlar gibi hücre çizgilerinin transfeksiyonu için izin verir ve gecen ^6-10 uygulanmıştır. En çok kimyasal nakil yaklaşımların aksine, erken makrofajlar kullanılarak Modifiye Nucleofection işlem, viral vektörlerin kullanılması veya bilinmeyen yan etkiler ile daha fazla taşıyıcı madde bileşikleri eklemek gerek kalmadan, zarar görmemiş hücre yaşayabilirliği ile kombinasyon halinde, yüksek transfeksiyon verimi elde edilir. Buna ek olarak, makrofajlar ve böylece, aşağıdaki transfeksiyon ¹¹ engelsiz işlevsel incelemeleri sağlayan tam farklılaşması için potansiyel olarak polarizasyon saklayın.

Ayrıca, nucleofection sonra uygulanan hücre kültürü ortamı şiddetle fonksiyonel çalışmalar aşağıdaki tran etkilersfection; Özellikle, polarizasyon için makrofajların kapasite uygulanan kültür ortamına bağlı olarak etkilenebilir. Hücre kültür ortamının Burada, dört farklı tipte (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 ve fare T hücresi Nucleofector ortamı) ile interlökin devreden çıkartma şartları altında test edilmiştir (İL), THP-1 10. makrofajlar kullanarak, IL10 hücre tepkisi olduğu görülmüştür Fare T hücresi Nucleofector ortamı, yukarıda sözü edilen diğer kültür ortamı ile karşılaştırıldığında kullanıldığı zaman güçlü. Bu sonuçlar, önemli ölçüde deney sonuçlarını geliştirmek şekilde tüm hücre kültürü koşullarının optimizasyonu uygun transfeksiyon başarı und daha sonra fonksiyonel çalışmalar için gerekli olduğunu göstermektedir.

Makrofajlar çeşitli insan hastalıklarında rol gibi, çok daha fazla araştırma makrofaj davranışı ve makrofajlar tarafından kontrol makrofaj veya sırayla etkileyen düzenleyici mekanizmaların tanıtılması odaklanmıştır. Dolayısıyla, bu protokol geçerliliğini korumaktadırbirçok farklı araştırma alanları.

Protokol

THP-1 Makrofagların 1. Predifferentiation

1. Bir _CO2 içinde% 10 (h / h) fetal dana serumu (FCS) ve% 1 (h / h), penisilin / streptomisin / L-glutamin (PSG) ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamında, THP-1 hücrelerini yetiştirmek (% 5 37 ° C) kuluçka makinesi.
2. Transfeksiyondan önce, hücreleri bölme ve daha önce olduğu gibi taze RPMI ortamına aktarabilirsiniz. 24 saat boyunca hücrelerin kültive edilmesi.
3. Tohum 1.0-1.5 x 10, 75 cm² doku kültür şişesi içine ⁷ hücreleri veya 2.5 x 10 ^7, RPMI-1640 ortam maddesi içinde bir 150-cm² doku kültür şişesi içine hücre ve% 10 (hac / hac) FCS,% 1 (hacim ekleme / 48 saat boyunca hacim) PSG,% 1 (v / v) sodyum piruvat,% 1 (h / h) esas olmayan amino asitleri, 10 ng / ml PMA ve 50 uM β-mersaptoetanol eklenir.

Nucleofection 2. hazırlanması

1. 37 ° C sıcaklıkta su banyosu içine Accutase I ve ortam yerleştirin.
2. Şişeden bir kültür ortamı aspire ve 6 ml (75 cm² şişe) veya 12 ml (150 cm² balon) ile değiştirin bölgesininAccutase I ve hücrelerin tam ayrılması için 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir. Hücreler yuvarlak bir görünüme sahip olmasını sağlamak için Accutase ben tedaviden sonra hücre morfolojisi gözlemleyin. Bazı hücreler hala bağlı gibi görünüyorsa, dikkatli bir mikropipet ile şişeyi çalkalayın ya da hafifçe dekolmanı tamamlamak için dokunun. Bu hücre canlılığı üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olacak gibi, hücre kazıyıcılar kullanmayın. 15 ml'lik bir tüpe transfer hücre süspansiyonu.
3. Accutase Ben tedavisi sırasında, aşağıdaki ortamları hazırlamak:
   1. Transfeksiyon ortamı hazırlayın: ek hücre kültür ortamı,% 1 (h / h) PSG ile,% 1 (h / h) esansiyel olmayan amino asitler,% 1 (v / v) sodyum piruvat ve% 5 (h / h) insan serumu (plazmid DNA), insan serumu (siRNA) veya% 20 (h / h); iki adet 12 oyuklu plakalar için, bir 6-yuvalı plaka ya da 4 ml / numune için, ya 3 ml / numunenin bir son hacim hazırlar.
   2. Yetiştirme ortamı hazırlayın: ek bir kültür ortamı,% 1 (h / h) PSG ile,% 1 (h / h) temel olmayan amino asitler,% 1 (v / v) sodyum piruvat ve% 5 (h / h), HUinsan (siRNA için), kan ya da% 20 (plasmidi için) (h / h) insan serumu, 2.5 ng / ml PMA ve 50 uM β-mersaptoetanol; iki adet 12 oyuklu plakalar için, bir 6-yuvalı plaka ya da 4 ml / numune için, ya 3 ml / numunenin bir son hacim hazırlar.
4. Oda sıcaklığında 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje hücre süspansiyonu.
5. RPMI ortamında 37 ° C'ye önceden ısıtılmış, 1 ml aspire Accutase I ve tekrar süspansiyon hücreleri; hücre sayısını belirlemek için hücreleri saymak.
   NOT: hızlı otomatik hücre sayım işlemleri kullanıldığında, 2.4 ve 2.5 adımları atlanabilir ve hücreler dekolmanı Accutase I uzun süreli temastan kaçınılmalıdır şartıyla hemen sonra sayabiliriz.
6. Her bir numune için transfeksiyon 2.0-2.5 x 10 ⁶ hücre ihtiva eden santrifüj tüplerine alikotları hazırlamak.

THP-1 Makrofagların 3. Nucleofection

1. Santrifüj, oda sıcaklığında 250 x g'de 10 dakika boyunca her alikotları.
2. Nükleaz serbest plazmid DNA veya siRNA seyreltin, su veya uygun bir tampon. Mümkün olduğu kadar küçük plazmid DNA veya siRNA'nın gerekli hacmi tutun.
3. Her bir transfeksiyon için plazmid DNA siRNA 1 ug veya 0.5 ug ya da sadece bir kez Nucleofector küvet hazırlayın.
4. Her seferinde bir transfeksiyon gerçekleştirin. Hücre bölenin aspire süpernatant.
5. DNA / siRNA ve Nucleofector çözeltisi 100 ul toplam hacim elde etmek üzere çözelti içinde topak Nucleofector süspansiyon hücreleri. En az saf Nucleofector çözeltisine maruz kalma süresi 15 dakika tutmak ve aşmamasını maruz kalma süresi sağlamak.
6. Hafifçe vurmak suretiyle Nucleofector küvet içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler ve DNA / siRNA karıştırın.
7. Nucleofector 2b Aygıt program-Y-001 gerçekleştirerek transfekte hücreler.
8. Tek kullanımlık plastik pastör pipet kullanılarak bir reaksiyon şişesine transfekte hücrelerin aktarın.
9. Hemen hazırlanan transfeksiyon ortamı 500 ul ilave edin.
10. Tekrar 3.4 Her transfeksiyon numune için 3.9 için yineleyin.

4. Post-Nucleofection Bakımı

1. Transfekte edilmiş hücreler, 6-ya da 12-kuyucuklu plakalar ya hazırlayın. Pipet 2,5, 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna transfeksiyon ortamı (1 de / transfeksiyon) ml ya da 12 oyuklu plakanın her oyuğuna transfeksiyon aracı 1.75 ml (2 kuyu / transfeksiyon).
2. Bir mikropipet ile iyice hücre süspansiyonları karıştırın.
3. Hazırlanan kuyu içine transfekte edilmiş hücrelerin aktarın (bir ya da 12 oyuklu bir plaka içerisinde bir 6 yuvalı plaka ya da iki).
4. Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde (% 5 _CO2, 37 ° C) 4 saat boyunca inkübe edin.
5. Mikroskobik hücrelerin yatıştırıldı edin.
   NOT: hücrelerin çoğunluğu yine yapışık olmalıdır. Zaman zaman, 1 saat ile kuluçka süresinin uzatılması yeterli yeni yapışma durumunda yapışan hücrelerin sayısını artırır.
6. Dikkatlice bir mikropipet ile transfeksiyon orta aspirat ve yetiştirme ortamında eşit miktarda değiştirin. Her seferinde sadece bir aspire de.
7. plazmid veya siRNA'nın (24-72 saat) maksimum etki için gerekli süre boyunca inkübe hücreleri. Inkübasyon süreleri 48 saat aşarsanız, 48 saat sonra orta yerine.
8. Efektör ek tedavisi için (örneğin,., Sitokinler, agonistler, antagonistler ve inhibitörler), PMA olmadan serum içermeyen ortamda ve β-merkaptoetanol kullanın. Saat plazmid veya siRNA'nın maksimal etkinin süresi ile bir effektör İnkübasyon süresinin sonunda, orta ve buna göre efektör eklenmesi değişikliği planı. Daha uzun, 24 saat boyunca serum serbest koşullar altında hücreleri korumak etmeyin.

Sonuçlar

Genellikle hücre canlılığının önemli bir düşüş olmadan 90 Yukarıda% transfeksiyon oranları elde siRNA ile THP-1 makrofajlar transfeksiyonu için bu protokolü kullanarak. Şekil 1, 24 saat, bir transfekte edilmemiş karşı siRNA floresan etiketli ile transfeksiyondan sonra hücrelerin durumunu karakterize etmek için temsili verileri gösterir Nucleofection reaktifleri ile muamele edilmiş ve darbeli veya siRNA fakat transfekte edilmiş örnekleri gibi bir kültür ortamı tüm değişiklikleri dönmemiştir kontrolü. Şekil 1A hücresel morfoloji akım sitometri ölçümüne göre gösterilmektedir. . Mikroskopik görüntüleri Şekil 1B gösterildiği Şekil 1C ve 1D düşük apoptoz oranları (kontrol:% 1.5; Nucleofection:% 5.4) temsil edilir:;: etkilenmemiş hücre canlılık gösteren ve nekroz (% 3.2, kontrol Nucleofection% 2.0). Nakledilmiş THP-1 makrofaj daha olarak nekroz ve apoptoz transfekte numune için biraz daha yüksektiruntransfected hücreleri, dekolmanı artar sırasında hücre hasarı dolayısıyla olasılığı daha ayırmak zordur. Son transfeksiyon verimi Şekil 1 E'deki sunulmuştur. Tüm transfekte edilmiş bir popülasyondan kontrolüne karşı kaydırılır, bu tüm hücreler flüoresans mikroskopisi görüntüleri (Şekil 2B) ile teyit edildiği transfekte olduğunu gösterir. Her ikisi de tüm hücreler sürekli hücreleri arasında yanı sıra hücre içindeki siRNA'nın homojen dağılımı ile transfekte olduğunu göstermektedir sıtometrık verilerin yanı sıra floresan mikroskobik görüntüleri akar. Bu karşılaştırma için Şekiller 2A, bir çok kimyasal transfeksiyon reaktifleri aksine ve Şekil 2B, yağ bazlı bir yaklaşım kullanılarak kimyasal bir transfeksiyon maddesi için ilgili akış sitometrik veriler ve floresan mikroskopik resimleri göstermektedir. Bu rakamlar, transfekte edilmiş hücrelerin, iki farklı popülasyonlar tespit edilebileceğini göstermektedir. İlk popülasyon follo transfekte edilmiş hücrelere benzerkanat Nucleofection. Bunlar, düşük toplam floresan ve hücrelerin içinde siRNA homojen dağılımı ile karakterize edilir. Ikinci popülasyon siRNA çok parlak hücre topaklarının kaynaklanan daha şiddetli floresan ile işaretlenir. Şekil 2C'de, farklılık belirleyici kontrast ile gösterildiği gibi, her iki hücre morfolojisi transfeksiyon yaklaşımlar için etkilenmez. Etkin bir şekilde benzer sonuçlar ile plazmid DNA verimi Transfeksiyonlar, örnekler için Robenek ve ark. (2009) ⁹ ya da Xie bakınız ark. (2006) ^7.

Transfeksiyondan sonra hücre kültür ortamının seçimi büyük öneme sahiptir; bu nedenle de farklı hücre kültür ortamı kıyasla test edildi. Seçilen tüm ortam, THP-1 hücrelerinin kültivasyonu için uygun olan ve sonrası Nucleofection kültivasyonu için ortam olarak uygulanabilir Lonza'dan önerilerine göre seçilmiştir. 3 siRNA MEDIAT temsil Şekiled IL10RB (interlökin 10 reseptörü β zinciri) mRNA'ya karşı yönlendirilmiş bir siRNA kullanılarak verimi demonte. Test edilen tüm ortam için IL10RB ekspresyonunun önemli ölçüde kontrol seviyesi yaklaşık% 10-20 (Şekil 3) indirgenmiştir. Bununla birlikte transfekte edilmiş hücreler polarizasyon için potansiyeli kültür ortamına bağlı olarak değişebilir. Spesifik olmayan kontrol siRNA veya IL10RB özgü ya siRNA ile transfekte edilmiş THP-1 makrofajlar transfeksiyondan sonra farklı ortamlarda yetiştirilen ve IL10 ile tedavi edildi. IL10-indüklenmiş gen SOCS3 mRNA düzeyine (3 sitokin sinyal baskılayıcı) sonradan ekspresyon düzeyleri RT-QPCR kullanılarak ölçüldü. Kültür ortamı arasındaki farklar SOCS3 mRNA ekspresyonunun indüksiyonu ölçüde ilgili olarak ortaya çıkmaktadır (Şekil 4), test edilen ortam fare T-hücresi Nucleofector Orta her biri için indüksiyonlar, LGM3, X-VIVO 20 ve 19.5 olmuştur IMDM [17,7-21,5 ], 11.5 [8,5-15,7], 8.0 [4,6-14,2] ve 7.2 [5,6-9,5] sırasıyla katlayın.Fare T hücresi Nucleofector ortamının refore uygulama hayati önem taşımaktadır. Buna ek olarak, tedaviden sonra da IL10 SOCS3 ifadesi üzerindeki IL10RB arasında Nakavt etkisi gözlemlenebilir farklılıklar vardı SOCS3 mRNA ekspresyon seviyeleri, 9.5 [8,8-10,3] katlanması fare T-hücresi Nucleofector ortamına düşürülmüş, 2.1 [1,1-4,1] kat LGM3 yılında, 4.8 [3,2-7,2] X-VİVO 20 ve 3.3 [2,7-3,9] katlayın IMDM'de katlayın. Bu değerler sırasıyla% 49,% 18,% 60 ve% 45, en farklı ortamda SOCS3 ifade azalmalara karşılık gelmektedir. IL10RB siRNA transfeksiyonundan sonra, IL-10 ile indüklenen SOCS3 ifade azaltılması transfeksiyonu ile IL10RB başarılı infekte teyit etmektedir.

Işık mikroskopik, tarafından açıklanan ve akış sitometrik analizleri transfekte edilmemiş eş olarak transfekte edilmiş THP-1 makrofaj Şekil 1. karakterizasyonu. Hücrelerin karakteristik durumu etkilenmemiştirTHP-1 hücreleri, makrofajlar karşı ntrol sunulan protokole göre transfekte edildi. THP-1 makrofajlar 48 saat boyunca 10 ng / ml PMA ile farklılaşmış ve floresan etiketli (Alexa 488) spesifik olmayan kontrol siRNA ile transfekte edilmiştir. Transfeksiyondan sonra 24 saat ya da canlı hücre görüntüleri (B) alınmıştır, veya hücreler Accutase I muamele ile ayrılmış ve akış sitometrisi (A) ile analiz edilmiştir. Apoptoz ve nekroz boyama Annexin V-fikoeritrin (PE), (C) ve 7-aminoactinomycin (7-AAD) (D) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Transfeksiyon etkililiği, (E) siRNA bağlı floresan etiketi kullanılarak akış sitometrisi ile tespit edilmiştir. Transfekte hücreleri (siyah) floresan sinyali kontrol sinyali (gri) karşı gösterilir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil lipofeksiyon karşı nucleofection sonra siRNA hücre içi dağılımı 2. karşılaştırılması. THP-1 hücreleri Bu protokole uygun olarak 48 saat boyunca farklılaşır, sonra da nucleofection ya da lipofeksiyon yoluyla transfekte edildi. Sunulan lipofeksiyon- sonuçları 4 siRNA'nın için reaktif bir ücret oranı ile üreticinin tavsiyelerine göre Xtremegene SiRNA kiti kullanılarak elde edilmiştir: 1. Transfeksiyon hücre sonra 24 saat ya akım sitometri analizi için Accutase I ile müstakil veya canlı hücreleri ile mikroskopik değerlendirildi. Nüfus içinde (A) transfeksiyon verimi ve hücre başına siRNA dağılımı siRNA bağlı floresan etiketi kullanılarak akış sitometrisi ile tespit edilmiştir, siRNA transfekte edilmiş kontrol gri renkle gösterilir, siRNA ile transfekte edilmiş numuneler siyahlıkla gösterilmiştir. (B) Floresan mikroskopisiRNA (Alexa Fluor 488) floresan etiketli hücre içi dağılımını gösteren görüntüler; skala çubuğu 40 mm temsil eder. (C) floresan görüntüye karşılık gelen diferansiyel-interferans-kontrast bir görüntü; ölçek çubuğu 40 mikron temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. nakledilmiş THP-1 makrofajlarda IL10RB demonte siRNA aracılı., THP-1 makrofajlar özetlenen protokole göre transfekte edildi. Transfeksiyon, hücreler dört farklı kültür ortamı, yani fare T-hücresi Nucleofector ortamı (A) IMDM (B) kültive edildikten sonra Protokol bölümünde tarif edildiği gibi, LGM3 (° C) ve X-VIVO 20 (D) desteklenmiştir. Carşın ya da spesifik olmayan kontrol siRNA (CTRL) ya özgü IL10RB siRNA (IL10RB) ile transfekte edilmiştir. Darbe kontrolü, yani: Aşağıdaki örnekler alındı ​​ilave kontroller olarak. yani SiRNA (Darbe) yokluğunda, ve orta kontrolde transfeksiyon yapıldı hücreler. kültür ortamı sadece değişiklikleri alınan ama başka maruz bırakılmamıştır hücreleri. 24 saat transfeksiyondan sonra hücreler ya da daha fazla, 24 saat boyunca 50 ng / ml 'IL10 içermeyen serumsuz ortam içinde inkübe edildi. IL10RB ifadesi RT-QPCR ile ölçülmüştür; şemaları, üç bağımsız deneyin ortalaması, hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil gösterir; * P <0.05; ** P <0.01; *** Ctrl vs p <0.001. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil nakledilmiş THP-1 makrofajlarda IL10RB demonte sonra SOCS3 4. IL10-bağımlı regülasyonu., THP-1 makrofajlar tanımlanmış olan protokole göre transfekte edildi. Transfeksiyon, hücreler dört farklı kültür ortamı fare T-hücresi Nucleofector ortamı (A) IMDM (B) kültive edildikten sonra Protokol bölümünde tarif edildiği gibi, LGM3 (C) ve X-VIVO 20 (D) desteklenmiştir. Hücreler, spesifik olmayan kontrol siRNA (CTRL) ya özgü IL10RB siRNA (IL10RB) ile transfekte edilmiştir. Yani Pulse kontrolü, siNRA (Pulse) yokluğunda transfeksiyonunu uygulandı, yani hücreleri ve orta kontrolü,: ek aşağıdaki örnekler alındı ​​kontroller gibi. kültür ortamı sadece değişiklikleri alınan ama başka maruz bırakılmamıştır hücreleri. 24 saat transfeksiyondan sonra hücreler ya da daha fazla, 24 saat boyunca 50 ng / ml 'IL10 olmadan serum içermeyen ortam içinde inkübe edildi. SOCS3 Expresalgılanması RT-QPCR ile ölçülmüştür; şemaları, üç bağımsız deneyin ortalaması, hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil gösterir; *, # P <0.05; **, ## P <0.01; ***, ### Ctrl vs vs ve p <0.001 Ctrl + IL-10, sırasıyla. bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Burada özetlenen protokolü genellikle geçiştirilmesi için oldukça zor THP-1 makrofaj geçiştirilmesi için güvenilir ve verimli bir yol sunuyor. Transfeksiyon hücre canlılık önemli bir azalma olmadan siRNA için% 90 ve üzerinde transfeksiyon verimliliği ile elde edilebilir. Plazmidler için verimlilikleri genellikle elde edilebilir% 70 civarında kendi boyutu ancak transfeksiyon verimliliği nedeniyle daha az olabilir. SiRNA aracılı Nakavt verimi, uygulanan siRNA bağlı olarak 80-90% ulaşabilir. Bu protokolün önemli bir avantajı, hücre farklılaşması müdahale etmemesidir. Transfeksiyondan sonra hücreler yine ¹² farklılaşma madde PMA (1B ve Şekil 4 Şekil 1A) karşı normal cevap veremez. Bu da transfeksiyon a sonra ekimi için seçilen ortama kuvvetle bağlıdır, ancak bu IL10 veya LPS gibi sitokin uyaranlar tarafından eklenmesi hücresel kutuplaşma / IFNy, etkilenmez ^12'dirŞekil 4'te gösterilen s.

Özel gereksinimlere protokolünü uyarlamak için modifiye edilebilir prosedür dahilinde çeşitli seçenekler vardır. Şekil 4'te gösterildiği gibi, hücreler, transfeksiyondan sonra, seçilen kültür ortamına bağlı olarak aynı IL10 uyarana farklı şekilde etkiler. Bu ortam kompozisyon, hücresel davranışı üzerinde güçlü bir etkiye sahip olduğunu gösterir. Çeşitli deneysel uyarıcılar için farklı olabilir ortam tarafından uygulanan etki olarak, bu optimum ortamı değişebilir ve bu nedenle bağımsız olarak farklı deneyler için vasatın uygun olduğunu doğrulamak için bir ihtiyaç olduğu mümkündür. Ancak THP-1 hücrelerinin kültivasyonu için kullanılan varsayılan ortamı olan RPMI-1640 ortamı, hücre canlılığını önemli bir kayıp gözlendi olarak transfeksiyondan sonra kültivasyonu için kötü uygun olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca protokol, aynı zamanda önceden PMA-kaynaklı farklılaşma olmadan, THP-1 monosit uygulanabilir, butabii ki, işlem sırasında hücre ayrılması ihtiyacını ortadan kaldırır, fakat geri kalan bütün adımları ayarlanması gerekmez. Gerekirse, THP-1 monosit sonra ayırt edilebilir.

Protokolün en kritik elemanlar ilk olarak ayrılması ve ikinci transfeksiyon için gerekli olan zaman vardır. Dekolmanı yüksek hücre canlılığını muhafaza edilmesi amacıyla, yavaşça mümkün olduğu kadar gerçekleştirilmelidir. Bu nedenle Accutase Ben üzerinde bu tür tripsinizasyon oldukça agresif yöntemler ile karşılaştırmalı olarak yumuşak enzimatik dekolmanı öneririz. Lidokain gibi ya da kazıma ile işlenmesi gibi başka ayırma yöntemleri oldukça zararlı olduğu bulunmuştur ve kullanılmamalıdır. Accutase Tedaviden 30 dakika tüm hücreleri ayırmak için yeterli olmaması gerektiğini durumda doğru bu genellikle yanlış olarak depolanır ya da süresi dolmuş Accutase Ben çözümün ya da çok sayıda donma-çözülme döngüleri bir göstergesidir. Bu -20 ° C'de Accutase I az miktar depolayarak iyi sonuçlar elde ettikC dondurma-çözme döngüsü sayısını azaltmak için. Yetersiz dekolmanı olduğu ancak zaman taze Accutase ile Accutase I değiştirmek veya 1 saat inkübasyon süresi kadar artar ya. Ilave nazik dokunarak veya dekolmanı yardımcı olabilir şişesi veya plaka durulama. Transfeksiyon için gerekli süre konusunda saf Nucleofector çözüm hücrelerin maruz kalma süresi mümkün olduğunca kısa olmalıdır ve böylece hücre canlılığı yüksek etki var ve gelmiştir. Bunu başarmak için en iyi yolu bir süre paralel (adım 2,10-2,15) çok değil transfeksiyonlardan her transfeksiyonunu yapmaktır.

Demonte verimliliği düşük ise, bu genellikle düşük transfeksiyon verimliliği neden değil, ama bu kolayca akım sitometri veya floresan mikroskopi kullanılarak doğrulandı ve floresan siRNA'nın veya GFP kodlama plazmid etiketli olabilir. Çoğunlukla nedeni verimsiz bir SiRNA veya plazmid DNA. Bu koşullar altında (2-3 ug kadar) siRNA miktarını artırmak için değerlendirilmesi gereken veyaDNA (kadar 1-2 mg) veya varsa farklı bir SiRNA veya ifade vektörü kullanın. Seçenek olarak ise, tatmin edici sonuçlar, aynı hedefe yöneltilmiş birçok farklı siRNA'lar bir havuz kullanılarak elde edilebilir. Ayrıca, süre ders deneyler doğru genellikle transfeksiyonundan sonra 24 ila 72 saat sonra ulaşılır maksimal etkisi dönemini belirlemek için gerekli olabilir.

Yanı sıra transfeksiyon, elektroporasyon ile memeli hücrelerin transfeksiyonu için iyi bilinen teknikleri daha vardır. Sık uygulanan sistemler, yük nükleik asit ile kompleks oluşturulmasına ve daha sonra hücrelere taşınmasını kolaylaştırmak için kimyasal nakil maddelerdir. En sık kullanılan ayıraçlar farklı lipit türlere dayanmaktadır veya katyonik polimerlerin ³ bir dizi seçilebilir. Her iki farklı bir seçim yaklaşımlar için ticari olarak temin edilebilir. Bu transfeksiyon reaktifler bunlar genellikle avantajı sunuyoruzBöylece dekolmanı için gerekliliğini ortadan kaldıran, çok zaman gerektirir ve de yapışık hücreleri ile işe yaramazsa, kullanımı kolay. Ne yazık ki, makrofajlar onlar in vitro belirgin çoğalırlar ve yabancı sitozolik DNA'ya ^13-15 yöneltilen savunma mekanizmalarını sahip olmayan yok gibi, bu yöntemlerle geçiştirilmesi için oldukça zordur. Bu durumda, kimyasal nakil teknikler sıklıkla hücre canlılığının bir ciddi azalma ile sonuçlanır. Geçmişte başarıyla makrofajlara siRNA aktarabilir kimyasal nakil maddeleri, ancak akış sitometrik (Şekil 2A) ve floresan mikroskobik olarak (Şekil 2B) analizleri, Şekil 2'de gösterildiği gibi, ancak bunlar hücreleri içindeki siRNA ile aynı homojen dağılımı elde etmek için başarısız göstermektedir nucleofection ile elde edilmiştir. Aslında, akış sitometrik veriler, transfekte edilmiş hücrelerin iki popülasyon meydana gelmesi Nucleofecti sonra hücreler olarak benzer floresan ile ilk önce bir nüfus olduğunuüzerinde tespit edilir ve ikinci daha yoğun floresan bir nüfus bulunmaktadır. Kesin onay hala gereklidir ancak ilk popülasyon ikinci popülasyon muhtemelen çok parlak aglomeratlar ile hücrelerin tekabül ederken, sitoplazmada içinde floresan siRNA homojen bir dağılımını gösteren bu hücreler ile aynı olan floresan mikroskopi olduğunu varsayalım. Şekil 2A'da gösterilen bir akış sitometrik veriler göstermektedir ki, alternatif lipofeksiyon yaklaşıma göre, hücre başına daha az siRNA Nucleofection sonuçlanır. Bununla birlikte Şekil 3'te veri nucleofection ile bu buluşa katılan siRNA bile nispeten küçük miktarı zaten, hedef genin 80-90% demonte için yeterli olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, kimyasal transfeksiyondan sonra ikinci popülasyonuna ile bu buluşa katılan siRNA ek miktarı çok fazla ve muhtemelen daha da artmasına, yok etme etkisi için daha arzu edilmeyen yan etkilere neden olduğu, böylece daha olasıdır. Bunun dışındaBu SiRNA molekülleri olası değil fonksiyonel veya serbest siRNA'nın moleküllere göre en azından daha az verimli ve hedef etkilerini kapalı neden olabilir hücre içi aglomeralarının oluşumu zaten kendi içinde istenmeyen bir durumdur. Ayrıca bu aglomeraların gerçek doğası henüz belli değil. Bu noktalar, siRNA hücreler tarafından ancak endozomlar başarısız oldu ve siRNA tutulacağı ve bu yüzden etkisiz kalır, daha sonra ikinci serbest olduğunu gösteren endozomlar temsil mümkündür. Alternatif olarak, hücre lekeleri oluşur topaklar olabilir. Kimyasal transfeksiyonunun Fonksiyonel değerlendirmeler nedenle devirme verimliliği üzerinde hiçbir kesin ifadeler hala iki ayrı nüfus varlığı bu tüm sonuçlar, hem nüfus ortalamasını tarif demektir zaten elverişsiz olduğu, henüz yapılabilir, bekleyen, bu yüzden uyuşmuyor ya popülasyonlarının. Bu nedenle Nucleofection üstün bir yaklaşımdır.

Bununla birlikte, aynı zamanda burada tarif edilen transfeksiyon prosedüre sınırlamalar vardır. Hücreler Nucleofection yapışan hücreler, hücrelere ilave bir stres faktörü sunduğu, müstakil gereken karışımın içinde olmak zorunda beri. Ayrıca tüm protokol de oldukça zaman alıcı. Deney başına 10 - Transfeksiyonlar aynı anda gerçekleştirilir, ancak hücre hasarı önlemek için hızlı bir şekilde yapılması gereken olabilir ve bu, numune sayısı 8 ile sınırlıdır. Böylece, bu protokol, yüksek veri akışı tarama projeler için uygun değildir. Yüksek hacimli uygulamalar için farklı Nucleofector sistemleri mevcuttur. Birincisi, 16 de şerit biçimini sunan 4D-Nucleofector sistemi vardır. Daha büyük verim için, 96 gözlü Servisi sistemi ve 384 de HT Nucleofector sistemi mevcuttur. Bu şekilde yeni sistemler yerine alüminyum iletken polimer elektrot ve bu nedenle elektrik koşullarda, yani programları ve kompozisyonunun çalışma Ancak olarakNucleofector çözeltisi TV'nizi yerleştirmeden, bizim, bu sistemlerin protokol aktarılabilir halinde tespit edilmesi gerekir, buna göre değişti.

Ancak, bu sınırlamalara rağmen protokolü bütün diğer viral olmayan yaklaşımların üstün THP-1 hücrelerinin güvenilir ve etkili bir transfeksiyonunu verim vermez burada sundu. Bu protokol, tüm diğer yönden birbirinden ayrılması ve normal olarak ve böylece mümkün olduğu kadar az transfeksiyon yan etkiler gösterdikleri için polarize, THP-1 hücrelerinde gen ekspresyonu değişimlerinin etkileri inceleme sağlar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Accutase I	Sigma-Aldrich	A6964
Amino asitler, esansiyel olmayan	PAA	M11-003
Santrifüj tüpleri (15 ml)	TPP	TPP91015
Fetal buzağı serumu (FCS altın)	PAA	A15-151
İnsan Monosit Nükleofektör Kiti	Lonza	VPA-1007	Nükleofektör Çözeltisi, küvetler ve Pasteur içerir pipetler
Pıhtıdan insan serumu	Lonza	C11-020
Isove'un 25 mM HEPES ve 25 mM L-glutamin içeren Modifiye Dulbecco's Medium (IMDM)	Lonza	12-722F
Lenfosit Büyüme Ortamı 3 (LGM3)	Lonza	CC-3211
Fare T Hücre Nükleofektör Ortamı	Lonza	VZB-1001
Nükleofektör 2b	Lonza	AAD-1001
Penisilin / streptomisin / L-glutamin (100x)	Sigma-Aldrich	G1146
Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)	Fisher Scientific	BP685
Roswell Park Memorial Institute 1640 Orta (RPMI 1640)	PAA	E15-840
siRNA / plazmit
Sodyum piruvat (100 mM)	Sigma-Aldrich	S8636
THP-1 insan lösemi monositleri	CLS	300356
Doku kültürü şişeleri (75 cm²; 150 cm²)	TPP	TPP90076/TPP90151
Doku kültürü plakaları (6 oyuklu; 12 oyuklu)	TPP	TPP92406/TPP92012
Tüpler (1,5 ml)	StarLab	S 1615-5500
Su (nükleaz içermeyen) veya uygun siRNA/plazmid tamponu
X-Vivo 20, gentamisin	Lonza	BE04-448Q
β-Merkaptoetanol	ileSigma-Aldrich	M3148