Yöntem makalesi

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

DOI:

10.3791/51963

⸱

5 Ekim 2014

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Immunology & Experimental Oncology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Witten/Herdecke University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre göçü, bir kanser gibi yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin ve patofizyolojik süreçler gibi, fizyolojik bir bolluk dahil bir biyolojik bir olgudur. 3D-kollajen matris göç deneyi 3D fizyolojik gibi bir ortamda içinde farklı hücre tipleri göç özelliklerini analiz etmek için çok yönlü bir araçtır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Göç etme yeteneği, çeşitli hücre tiplerinin ayırt edici bir özelliği olup, embriyonik gelişmesi, yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar. Fakat, hücre göçü aynı zamanda yayılma metastatik başlatmak için primer tümörün ayırmak için, bu kanser hücrelerini etkinleştirerek kanserinde önemli bir mekanizmadır. Geçen yıllar içinde çeşitli hücre göçü deneyler, farklı hücre tiplerinin göç davranışlarını analiz için geliştirilmiştir. Hücrelerin lokomotor davranışı belirgin bir iki boyutlu (2D) arasında değişmektedir ve üç boyutlu (3D) ortamında 3 boyutlu bir ortamda gömülü olan hücrelerin göç analizi daha önemli hücre göçü olarak verim olacağını kabul edilebilir, çünkü Veri. Tarif edilen 3D kollajen matris, göç deneyi avantajı hücreler, hücre dışı matrisin başlıca bileşenini temsil eden kolajen liflerinin ve fizyolojik bir 3 boyutlu bir ağ içinde gömülü olmasıdır. Nedeniylezaman atlamalı görüntü mikroskopi gerçek Hücre göçü, ön-göç faktörleri veya inhibitörlerine tepki olarak çeşitli geçiş parametrelerine ve bunların değişikliklerinin tespitine imkan ölçülür. Çeşitli hücre tipleri hücreleri ve tümör hücreleri, lenfositler / lökositler de dahil olmak üzere, bu teknik kullanılarak kök incelenebilir. Benzer şekilde, aynı zamanda hücre kümeleri veya sferoidler kolajen kafes içine hücre kümesi / sfero ikinci tek hücrelerin göç analizi ile kollajen matris, eşlik eden gömülü olabilir. Biz 3D kollajen matris göç deneyi fizyolojik-benzeri 3D ortamında hücrelerin göçünü analiz için çok yönlü bir yöntem olduğu sonucuna varıldı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre füzyonu (genel bir bakış için bakınız 1,2) Hücre göçü, embriyonik gelişmesi, yara iyileşmesi ve bağışıklık (inceleme için 3 bakınız) dahil olmak üzere, fizyolojik süreçlerin bir bolluk katılır başka bir biyolojik fenomen gibi. Ancak, göç yeteneği tümör hücreleri (inceleme için 3,4 bakınız) metastaz için bir önkoşul da.

Hücre göçü, bir kompleksi, çeşitli ligand (örneğin, sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri, hormonlar, hücre dışı matris bileşenleri) reseptör (örneğin, reseptör tirozin kinazlar tarafından başlatılan çeşitli sinyal transdüksiyon yollarının etkileşimiyle yönlendirilir henüz tam olarak anlaşılmamıştır süreçtir sonuçta de- ve fokal yapışma kompleksleri tekrar takılmasıyla ile aktin hücre iskeleti eşlik eden yeniden yapılanmasını neden kemokin reseptörleri, integrinleri) etkileşimler 5 6 sinyalizasyon integrin'in-aracılı.

in vitro ve in vivo çeşitli hücre göç deneyleri, hücre göçü analiz etmek tahlil 8-10, üç boyutlu (şifa Boyden odası / Transwell tahlilinde 7, çizilmeye tahlil / yara dahil, geçmiş yıllarda geliştirilmiştir 3D) kollajen matris, göç deneyi 11 yanı sıra, intravital görüntüleme / mikroskop (inceleme için 12 bakınız). Bu hücre göç deneyleri her artılarını ve eksilerini, örneğin, ilgili maliyetleri ve ekipman ihtiyacını, taşıma veya elde edilen verilerin güvenilirliği vardır.

Boyden odasının / Transwell deneyi ve çizik deney / yara iyileşme testi, hem de in vitro 7-10 hücre migrasyonun ölçülmesi için kullanımı kolay, düşük maliyetli ve gelişmiş tahliller bulunmaktadır. Olarak adlandırılan üst bölmeye 7 - Boyden odasının içinde / Transwell hücre tahlili bir uç ihtiva eden gözenek (yaklaşık 8 um çapında) üzerine ekilir. İsteğe bağlı, uç hücre dışı m ile kaplanabilirAtrix parçalar, örneğin, fibronektin, kolajen, vb daha fizyolojik ortamı taklit etmek. Benzer şekilde, endotelyal hücreler, bu şekilde bir endotelyal hücre engeli 13 taklit eden, parçanın üstüne yetiştirilebileceğini. Bu gibi büyüme faktörlerinin ve kemokinlerin medya ve takviyeleri, barındırılması alt bölmeye tanımlanan bir zaman aralığı boyunca gözeneklerin içinden geçen bu hücreler, hücre göçü (veya ekstravazasyon) ölçmek için bir okuma olarak kullanılmaktadır.

Sıfırdan deneyde / yara iyileşmesi analiz, hangi hücrelerin plakalara ekilir ve ortak akışkanlığa gelinceye kadar büyütülür 10. Deney plakaları ayar bağlı olarak örneğin fibronektin gibi hücre dışı matriks bileşenlerinin, önceden kaplanmış olabilir. Sıfırdan her tarafında hücre tek tek hücreleri kazıyarak yara çizik / oluşturduktan sonra / yara böylelikle 10 şifa / dolum, boşluğa geçirebilirsiniz. Sıfırdan / yaraların iki tarafı arasındaki mesafe belirlenirzaman bağlı olarak ve hücreler 10 göç aktivitesi için bir okuma olarak kullanılır. Ancak, time-lapse video mikroskopi ve tek hücre 10 izleme ile tahlil birleştirmek için tavsiye edilir ve hücre göçü (ayrıca çizik / yaranın dolum / iyileşmeye neden olabilir), hücre çoğalması arasındaki ayrımcılık.

Ancak, Boyden odası / Transwell tahlil ve iyileşmesi deneyini çizik tahlil / yara, hem fizyolojik bir benzeri hücresel çevre ile ilgili oldukça kusurlu. Boyden odasının içinde / Transwell hücre tahlili sıfırdan deney hücreleri iyileştirme deneyi / yara, iki boyutlu bir önceden kaplanmış plastik bir levha üzerine ekilir ise, plastik bir gözenekten geçiş gerekir. Aynı şekilde, iyi göç davranışı iki boyutlu ve 3 boyutlu bir ortamda 3 arasında belirgin farklılık olduğu kabul edilmektedir. Örneğin, fibroblastlar üç boyutlu matris adezyonlar ile karakterize edici özelliği, iki fokal ve fibriler adezyonlardan farklıdırα5β1 ve αvβ3 integrinler, paxillin, diğer hücre iskeleti bileşenleri ve fokal yapışma kinaz 14 tirosin fosforilasyonu içindeki yoğunluğu boyutlu takım alt-tabakalar. Aynı şekilde, bir 3D ortamı içinde gömülü hücreler de değişmiş bir göç davranışı 15 görüntülenir. Böylece, daha doğru bir şekilde hücre göçünü analiz etmek için göç deneyi 3B, fizyolojik veya fizyolojik gibi bir ortam içinde tek hücre göçünü ölçmek için izin önerilir.

İntravital görüntüleme / mikroskop 3D fizyolojik bağlamında hücre göçü ölçmek için altın standarttır. Bu şimdiye kadar sadece nedeniyle mümkün olduğu, ancak, aynı zamanda, lenf düğümü 17, 16 ya da içindeki ekstravazasyon lenfosit ticaretinde tümör hücreleri ve endotelyal hücreler gibi farklı hücre tipleri arasında etkileşimler, hücre dışı matris-hücre etkileşimlerinin ait değil örneğin 2-foton şeklinde geliştirilmiş bir floresan mikroskopi teknikleri,konfokal lazer tarama mikroskobu, floresan proteinleri sentezleyen türevleri 12,16,17 hayati floresan boyalar ve transgenik fare suşlarının kullanılması. Buna ek olarak, intravital görüntüleme / mikroskop indirin otomatik hücre 18 izlemek için birleştirilebilir. Bununla birlikte, bir 2-foton odaklı lazer tarama mikroskobu ihtiyacı hem de hayvanlarda (ve uygun transjenik hayvan modellerinde) intravital görüntüleme / mikroskop oldukça maliyet-yoğun bir yöntemdir.

Boyden odası / Transwell tahlili ve çizik tahlil / yara iyileştirici testin sınırlamaları aşmak ve 3D kollajen matris göç deneyi 11,19 geliştirilen bir 3D ortamında farklı hücre tiplerinin göç analiz etmek. Böylece, göç edici hücrelerin 3B kolajen lif şebekesi, in vivo olarak daha fazla benzeyen, bir durum içinde gömülürler. Müştereken, time-lapse video mikroskopi gerçek hücre göçü nedeniyle saptamaya olanak ölçülürBirkaç göç parametreler yanı sıra yanlısı göçmen faktörler veya inhibitörleri tepki olarak kendi değişikliklerin ulus. Çeşitli hücre tipleri lenfosit ve lökositlerin 11,20, hematopoietik sap / 21-24 progenitör hücreleri ve tümör hücreleri dahil olmak üzere bu 5,25-29 teknik kullanılarak analiz edilebilir. Tek hücre yanı sıra, aynı zamanda, hücre kümeleri veya sferoidler 30,31 kafes kalojee Zigotun / sfero ikinci tek hücrelerin göç analizi ile kollajen matris, eşlik eden gömülü olabilir.

In vivo durumu yakın sonuçlar veren bir in vitro yöntemle - Bu protokol, 3D ortamında farklı hücre tiplerinin göç davranışlarını analiz etmek için basit, ama güçlü tekniği hakkında genel bir bakış sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Göç Odaları 1. Hazırlık

  1. Karışım kadar karışım ve ısı eridi: Bir parafin / vazelin (1 1) hazırlayın. Bir boya fırçası kullanarak parafin balmumu / petrol peltesi 2-3 katmanları çizmek (1: 1) Şekil 1B-1D uygun olarak cam slayt ortasında karıştırın.
    NOT: Biz ortak cam slaytlar kullanarak (76 x 26 x 1.0-1.5 mm (G / D / Y))
  2. Çizim sırasında katılaşma önlemek için cam slayt hızla eridi parafin / vazelin karışımı uygulayın. Parafin / vazelin tabakası uzunluğu yaklaşık 2-2.5 cm genişliğinde ve 0.3-0.5 cm olduğundan emin olun. Parafin mum / petrol jeli tabakanın kalınlığı yaklaşık 0.1-0.15 cm olmalıdır.
  3. Katılaşmış parafin / vazelin karışımı bir coverslip ekleyin ve 2-3 katmanları mum / vazelin karışımı parafin (Şekil 1E, 1F) ile kapatın. Ortak bir hücre göçü deneyi için 4-8 geçiş odaları kullanın. Yer göç odaları iBir rafa dik bir pozisyon n tane.

Kolajen Süspansiyon Hücre Mix 2. Hazırlık

  1. Hasat (örneğin,% 0.25 tripsin / EDTA) ve ilgili hücreleri sayın. Tam fetal buzağı serumu (FCS) içeren ortama, antibiyotikler hücrelerin tekrar ve ek önerilir. 4-8 1.5 ml'lik tepkime tüpleri ve 4-6 x 10 4 hücreleri (hücre toplam sayısı, analiz edilecek hücre türüne göre değişir) ihtiva eden 20 ul hücre süspansiyonu hazırlamak ve tam ortam maddesi ile 50 ul'ye kadar doldurun.
    Not: ek bileşikler (örneğin, büyüme faktörleri, kemokinler, inhibitörleri, vs), hücre süspansiyonu ilave edilir. Hücre süspansiyonunun nihai hacim 50 ul aşmayacak şekilde uygun bir stok solüsyonları kullanın.
  2. Dört hücre göçü deneyleri için 452 ul nihai kollajen süspansiyonun toplam miktar hazırlayın. 50 ul 10x MEM (pH 5,1-5,5) ve% 7.5 sodyum bikarbonat çözeltisi 27 ul (pH 9,0-9,5 ekleme), 1.5 ml'lik tepkime tüpüne ve iyice karıştırın. Yoğun mor (pH 9.0-9.5) sarı-turuncu çözüm renk dönüşü gözlemleyin. 10x MEM / sodyum bikarbonat solüsyonuna 375 ul sıvı kollajen süspansiyonu ekleyin ve iyice karıştırın. Nihai kollajen süspansiyonun pH değeri yaklaşık 7.5 olmalıdır (açık mor bir renk ile belirtilir).
    NOT:% 7.5 sodyum bikarbonat çözeltisi ile pH değeri kontrol edilir. PH, yaklaşık 7.5 bir yerde bir kuluçka makinesi içinde bir açık kapağa sodyum bikarbonat çözeltisi ise (37 ° C,% 5 CO2) CO2 ile doyurulmuş ve pH (yaklaşık 9,0-9,5) yükseltmek için. Kollajen hücre süspansiyon karışımı pH kolajen ağının istikrarı için çok önemlidir. Eğer çok düşük ise, kollajen kafes hücre göçü deneyi sırasında çökecektir.
    NOT: Bu protokol için, sığır Arkadan gelen sıvı kolajen (pH 1.9-2.2) kullanın (2.9-3.3 mg / ml kollajen,% 95 kollajen tip I,% 5 kollajen tip IV). Kullanılarak daha fazla kolajen kafes hazırlık protokolleri örnekleriBöyle domuz ya da sıçan gibi diğer kaynaklardan kollajen tip I, 32,33 verilmiştir. Bu 1.67 mg / ml kafesinin nihai kollajen konsantrasyonunu değiştirmek gibi kullanılan çözeltilerin hacimleri değiştirmez. Daha yüksek ya da daha düşük yoğunluğu kolajen, kolajen liflerinin yoğunluğu ve hücrelerin göç davranışları 34 ile birlikte bunların arasındaki ortalama mesafe üzerinde bir etkisi vardır.
  3. 50 ul hücre süspansiyonu nihai kollajen süspansiyonu 100 ul ve thoroughly.The son kollajen süspansiyonu (1,67 mg / ml kolajen) karışımı hafif ağdalıdır. Doğru miktarda (100 ul) aktarmak için, hücre süspansiyonu aktarmadan önce bir kez yukarı ve aşağı nihai kollajen çözüm pipetle.
    Not: kolajen hücre süspansiyon karışımı, pH değeri 7.5 olarak değiştirildi 10x MEM / sodyum bikarbonat çözeltisi ile bir araya sonra kolajen lifleri hemen polimerize başlar.
  4. Th nihai kollajen süspansiyon hücre karışımı aktarıngöç odalarına e reaksiyon tüpleri. Hafifçe eşit geçiş odası (Şekil 1 H) alt kollajen hücre süspansiyon karışımı dağıtmak için geçiş bölmesinin dokunun. Rafa dik bir konumda geçiş odaları yerleştirin ve yaklaşık 30 dakika inkübe edilir (37 ° C,% 5 CO2) kolajen liflerinin polimerleşmesine izin vermek.
  5. Polimerize kollajen kafes biraz bulanık ama hala açık mor renk olan dikkat edin. Ilgi takviyeleri ile, tam bir ortamda veya tam ortam ile geçiş odaları kadar doldurun ve parafin balmumu / vazelin karışımı (Şekil 1 i, 1 i) ile geçiş bölmesini sızdırmaz.

3. Kayıt ve Hücre Göç Analizi

Bu bölüm, manuel hücre takibi ile zaman atlamalı görüntü mikroskopi ve hücre göçü analizi ile hücre göçü kaydı tanımlamaktadır.

  1. Mikroskop ve mikroskop sahne Västergötland açınter. 37 ° C sıcaklık ayarlayın. 10X objektif kullanın. Mikroskop altında geçiş bölmesi yerleştirin ve görüş alanı, yaklaşık 50 ya da daha fazla hücre odaklanır.
  2. Bir çok kamera video izleme yazılımı uygulamasını kullanarak time-lapse modunda kaydedin hücre göçü. Örneğin, uygun bir formatta hücre göçü film kaydet, "* .avi" veya "* .mov". Böyle hücre tipine ve deney şartları, destekleyici bilgileri içeren bir veritabanı hücre göçü film dosyalarını bağlayın.
    NOT: time-lapse 0.75 sn gerçek zamanlı olarak 1 dakika eşit olduğu anlamına gelir 1:80 bir time-lapse faktörü kullanarak kadar 2 saat boyunca lenfositler ve HSPCs kaydediyor. Tümör hücreleri, yavaş hareket eden hücreler ve bu nedenle 1 bir zaman atlamalı faktörü kullanılarak, en az 16 saat boyunca kaydedilir: 1.800 (hızlandırılmış 0.5 sn gerçek zamanlı olarak 15 dakika eşittir).
  3. ImageJ yazılım eklentileri gibi uygun bir hücre izleme yazılımı uygulamasını kullanarak hücre göçü film Analiz(Genel 18'de verilmiştir). Tarafsız bir analiz için hücrelerin aktif ya da değil, göçmen olup olmadığını hücreleri rastgele bilgisi olmadan seçilmiş olacağı önem taşımaktadır.
    NOT: Biz manuel (çekirdeğine yerleştirilmiş) fare imleci ile doğru hareket hücrelerini takip ederek deney başına en az 30 hücre yollarını izlemek için kendi geliştirdiği yazılım uygulamasını kullanıyor. Takip ederken, izlenen hücrelerin xy koordinatları otomatik olarak kullanılan time-lapse moduna göre belirlenmektedir. Tümör hücreleri için xy-koordinatları (15 dk gerçek zamanlı eşit) her 0.5 saniyede tespit edilir ise lenfositlerin / HSPCs xy-koordinatları, (1 dk gerçek zamanlı eşit) her 0.75 sn belirlenir.
  4. Tipik bir hücre göçü deney için hücre başına 60 xy-koordinatlarının toplam belirleyin. Bu tümör hücreleri için lenfositler / HSPCs ve 15 saat için gerçek zaman 1 saat gerçek zamana eşittir. A "," hücre tw arasında taşınamaz olduğunu gösteriro zaman noktaları, bir "sayısal değer" ise "piksel" hücre 2 zaman noktalarında (Şekil 2A) arasında taşındı yılında mesafeyi gösterir.
    NOT: Manuel hücre izleme deneyimi gerektirir. Özellikle hızlı göç edici hücrelerin izlemek için zor olan ve her hücre tipi sergi takviye faktörler tarafından tetiklenebilir belirgin bir göç davranışları. Izleme sırasında hücre bölünmesi durumunda, rastgele izleme devam için bir kızı hücre seçin. Görüş alanının dışına göç veya izleme ihmal değil iken ölmek, ama analiz için kabul edilir Hücreler.

4. Veri Analizi

  1. Örneğin uygun bir yazılım uygulaması, bir elektronik tablo programı kullanılarak hücre izleme verilerini analiz edin.
    1. Bir öz-tasarlanmış elektronik tablo şablonu içine ham verileri (Şekil 2A) izleme hücreyi, kopyalayarak hücre izleme verilerini analiz edin. Temsil eden, "sayısal değerleri" toplamı çarpıntoplam mesafe bir hücre "um" içine "piksel" dönüştürmek için bir düzeltme faktörü ile göç etti.
    2. İki hücre göçü parametrelerini belirlemek: ve aktif hareket (Şekil 2C, 2D) zamanında (göç hızına eşdeğerdir) lokomotor aktivite.
    3. Hareketsiz hücreleri (yanlış-pozitif hücrelerin sayısını azaltmak için eşik değeri) 25 um den daha az göç eden hücrelerin belirlenmesi. "," Ile bu hücrelerin "sayısal değerlerini" değiştirin.
      NOT: parametre "lokomotor aktivite" (ya da göç oranı) iki kez puan (Şekil 2B) arasındaki taşındı izlenen hücre popülasyonunun hücrelerinin yüzdesini temsil eder. Bir "sayı" "," ise, hareket eden bir hücre olarak tanımlanan bir hareketsiz hücre olarak tanımlanmıştır. Parametre "aktif hareket zamanı" (zaman aktif) bir hücre yeniden göç etti toplam süre yüzdesini temsilgözlem dönemi (Şekil 2C) zaman dilimine Lation. Bir "sayısal değer" "," bir hücre hareket değil belirtirken, bir hücre, hareket ettiğini gösterir. Bu parametre, daha fazla hareket değil hücrelerin sayısını belirlemek için kullanılır.
  2. Istatistiksel olarak anlamlı ve ekran hücre göç verileri hesaplayın.
    1. Mann-Whitney U testi kullanılarak hücreler (göç oranı) ortalama lokomotor aktivite istatistiksel olarak anlamlı hesaplayın. P-değeri
    2. Xy-diyagramı, Boxplot diyagram, ya da bir çubuk grafik diyagram olarak hücrelerin ortalama lokomotor aktivitesini gösterir. Bir çubuk grafik diyagram veya bir histogram gibi aktif hareket veya hız saati gibi tek bir hücre tabanlı veri, görüntüleme.
      NOT: seçilen tablosu programı uygulaması Boxplot grafik veya çubuk grafik grafik aracı içermiyorsa bir online arama uygun TU arıyor için yapılmalıdırtorials.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaman atlamalı video mikroskobu ve bilgisayar destekli izleme hücre ile birlikte, kullanılan 3D-kollajen matris, göç deneyi popülasyon bazlı parametre (örneğin, lokomotor aktivitesi ortalama) dahil olmak üzere çeşitli hücre göçü parametreleri ve tek bir hücre bazlı parametrelerinin belirlenmesine izin verir (örneğin, aktif hareket, hız, mesafe zaman göç). Elde edilen hücre izleme veri setleri, veri işleme ve veri sunumu bir örneği Şekil 2'de verilmektedir. Veri dosyası takip eden bir h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Göç yeteneği tümör hücrelerinin 4 bir özelliğidir. Primer tümörün ayırmak ve neredeyse tüm kanser hastalarının ölüm ana nedeni olan ikincil lezyonlar, tohum mümkün olmayacaktır çevreleyen bağ dokusu tümör hücrelerine yoluyla göç yeteneği olmadan. Çünkü bu ilişkinin pek çok çalışma kanser hücresi göçü üzerinde duruluyor. Bu çalışmaların amacı, verimli bir şekilde ve böylece zarar veya metastaz oluşumu yavaşlatan, tümör hücresi göçünü bloke yeni hedef moleküllerin ve hedef yolların tanımlanmasıdır. Üç negatif m...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Fritz-Bender-Vakfı, Münih, Almanya tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Leica DM IL ters mikroskopLeica, Wetzlar, Almanya
Mikroskop sahne ısıtıcısıDistelkamp Electronic, Kaiserslautern, Almanya
JVC C1431 video kameraJVC, Bad Vilbel, Almanya
Axis 241Q video sunucusuAxis communication GmbH, Ismaning, Almanya
Mac G5 BilgisayarApple Macintosh
iMacApple Macintosh
FileMaker ProFileMaker GmbH, Unterschleiß heim, Almanya
Çok kameralı video gözetim yazılımı (Güvenlik Casusu)Bensoftware, Londra, Birleşik Krallık
Runtime Revolution Media 2.9.0RunRev Ltd., Edinburgh, Birleşik Krallık
ParafinUygulaması GmbH, Darmstadt, AlmanyaA4264
Vazelinyerel eczane
Purecol (sıvı kolajen)Nutacon BV, Leimuiden, Hollanda2.9 - 3.3 mg / ml sığır kollajeni içerir (%95 kollajen tip I, %5 kollajen tip IV)
10x MEMSigma Aldrich, Taufkirchen, AlmanyaM0275
%7,5 sodyum bikarbonat çözeltisiSigma Aldrich, Taufkirchen, AlmanyaS8761
EGFSigma Aldrich, Taufkirchen, AlmanyaE9644
U73122Merck Millipore, Darmstadt, Almanya662035önce CHCl3'da çözülür; kullanımdan hemen önce DMSO'da yeniden oluşturulur

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
  2. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
  6. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
  7. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  8. Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
  9. Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
  10. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  11. Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
  12. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  13. Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  15. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  18. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  19. Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
  20. Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
  21. Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
  22. Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
  23. Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
  24. Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
  25. Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
  26. Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711(2013).
  27. Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
  28. Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
  29. Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
  30. Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
  31. Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
  32. Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
  33. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
  34. Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
  35. Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
  36. Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
  37. Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
  38. Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
  39. Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
  40. Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
  41. Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
  42. Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
  43. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
  44. Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
  45. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
  46. Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
  47. Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
  48. Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
  49. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Zaman Atlamal MikroskopiH cre zleme3B OrtamKanser H creleriL kositlerK k H crelerEGF Stim lasyonustatistiksel Analiz

İlgili makaleler