Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Takip inişi, Apoptosisi tersine Cep Survival Fenomeni için Stratejiler

18.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51964

⸱

16 Şubat 2015

 ,  ,  , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Anastaz terimi, ölmekte olan hücrelerin geç bir aşamada hücre intihar sürecini tersine çevirdiği, kendilerini onardığı ve nihayetinde hayatta kaldığı fenomeni ifade eder. Burada, anastaz geçiren hücreleri tespit etmek ve izlemek için protokoller gösteriyoruz.

Özet

Anastasis ("hayata yükselen" Yunanca) ölen hücrelerin iyileşme anlamına gelir. Bu hücreler kurtarmak önce, mitokondriyal parçalanma, sitozolüne mitokondriyal sitokrom c salınımı, kaspaz aktivasyonu, kromatin yoğunlaşması, DNA hasarı, nükleer parçalanma, plazma zar kabarmasını, hücre büzülmesi, hücre yüzeyi maruz kalma dahil olmak üzere apoptoz önemli kontrol noktaları aracılığıyla geçti fosfatidilserin ve apoptotik cisimlerin oluşumu. Apoptotik uyaranlara böylece ölen hücrelerin apoptoz ve potansiyel diğer ölüm mekanizmaları ters izin ölüm öncesinde kaldırıldığında Anastasis oluşabilir. Bu nedenle, inişi de uygunsuz hasarlı hücreleri sürdürmek olabilir fizyolojik iyileşme süreçleri dahil görünüyor. fonksiyonları ve inişi mekanizmaları görünüşte sağlıklı hücrelerin kurtarma sonra geçmiş olayları algılamak için sınırlı araçları tarafından kısmen engel, hala belirsiz. Stratejiler Anasta tespit etmek içinsis Anastasis modüle fizyolojik mekanizmaların çalışmalarını, hastalık patoloji ölümsüz hücre tehlikeleri ve potansiyel terapötik sağlayacaktır. Burada, canlı hücre mikroskopi ve memeli hücrelerinde Anastasis tespit ve takip etmek için, memeli bir kaspaz bio-sensor aracılığıyla etkili stratejiler açıklanmaktadır.

Giriş

Apoptoz ("ölüme düşen" Yunanca), genellikle hücre intihar 1-7 biten tek yönlü bir süreç olarak kabul edilir. Zaten apoptoz yolu 8,9 başlatmış bulunuyoruz hücreleri dahil aksi takdirde bütün hayvanlarda öleceğini ekstra hücrelerin, hayatta yanlısı ölüm genleri sonuçları Genetik bozulması. Benzer şekilde, genetik manipülasyonlar yapay görüntüler sinyalleri "Bana yemek" ya da hücre dışı matriks yapışma kaybetmek sağlıklı memeli hücreleri tam hücre fagositozu veya entosis, sırasıyla 10,11 ölümü kaçmasına izin. Ancak bizler ve başkaları da apoptoz 12-15 erken aşamalarında kurtulabilir Genetik manipülasyon, normal, sağlıklı, memeli hücreleri ve hücre çizgileri olmadan göstermiştir. Hücreler tipik önemli kontrol noktaları geçtikten sonra tek tek hücrelerin izlemek için araçlar kullanarak, daha fazla, apoptoz 12,13 geç aşamalarında kurtarma göstermiştirly 2-6 "dönüşü olmayan noktaya" işaretleyin. Geç evre apoptoz Bu kontrol noktaları mitokondriyal sitokrom c salınımını, kaspaz aktivasyonu, nükleer parçalanma ve apoptotik cisimlerin oluşumunu içerir. Biz hücre ölümü 2-6 eşiğinde apoptoz bu ters tanımlamak için, "hayata yükselen" anlamına gelen Yunanca bir bileşik sözcük "inişi", kabul.

Tüm ölüyor-kurtarma işlemi canlı hücre görüntüleme tarafından gözlemlenen sürece, bu apopitozisin yaşamamış hücrelerden Anastasis geçiren hücreleri ayırt etmek zordur. Iş Yılların apoptoz hücre intihar morfolojik özellikleri evrimsel olarak korunmuş biyokimyasal ve moleküler olayların 16-19 tarafından tahrik olduğunu ortaya koymuştur. Bu olaylar hasarlı veya d ortadan kaldırarak ile tek hücreli ve çok hücreli organizmalarda gelişimsel ve homoeostatic süreçleri düzenleyen hücrelerin kendini imha teşvikangerous hücreler 16-19. Apoptotik hücreler hali hazırda apoptoz 1,5,6,16,20 standart, morfolojik, biyokimyasal ve moleküler belirtileri ile ayırt edilebilir olsa da, şu anda inişi 12,13 özgü bilinen bir işaretleyici yoktur. Önemlisi, Anastasis geçirmiş hücreler normal sağlıklı hücreler, sadece apoptoz ters başlayın hücreleri görünür olarak apoptotik hücreler ölüyor 12,13 olduğu görülmektedir. Böylece, yeni araçlar belirli bir hayatta hücre önce aktif apoptotik süreçleri yaşamış kesinlikle sonuçlandırmak için gerekli.

Bu hızlı ve kitlesel imha süreci olduğundan Apoptoz genellikle geri dönüşümsüz kaskad olarak kabul edilir. Mitokondri gibi sitozolüne 21,22 içine sitokrom-c gibi apoptogenic faktörler yayımlandı kez bazı hücreler, apoptoz başlatmak için bu güne dakika sürebilir iken, kaspazlar, 5 dakika içinde aktif 23,24 sitoplazmik tarafından takip edilebilir veNükleer 10 dakika 25-27 içinde yoğuşma ve hücre ölümü kısa bir süre sonra 25-27. Aktif kaspazlar yarılması ve endonukleaz inhibitörü DFF45 / ICAD 29,30 olarak hücresel yıkım 2,28, amacıyla önemli yapısal ve işlevsel bileşenleri inaktive ederek apoptozu düzenlemişlerdir. Kaspazlar ayrıca 31,32 c sitokrom mitokondriyal serbest teşvik etmek mitokondri translocates BCL-2 aile üyesi BID, pro-apoptotik faktörler, etkinleştirin. Kaspaz aktivitesi fagositoz 33 ile makrofajlar veya komşu hücreleri hücreleri ölüyor yutulmasına teşvik etmek için bir "beni ye" sinyali olarak fosfatidilserin hücre yüzey maruz sonuçlanır. Ayrıca, apoptotik olaylar hücresel biyoenerjitiklerinin ve metabolizma 34,35,36 bozarak işlevsiz mitokondri, hale. Dolayısıyla, bu tür imha kurtarma sezgisel olası görünüyor.

Orijinal aksine bekliyoruzations, hücreler bile geç bir aşamada apoptotik hücre ölümü sürecini tersine çevirebilirsiniz. Sürekli kültür içinde ölen hücrelerden kaderi izleyerek, primer hücreler ve hücre çizgileri 12,13 bir dizi son evre apoptoz geri döndürülme oranı gözlendi. Ölüm uyaran kaldırılması gibi mitokondriyal parçalanma, kromatin yoğunlaşması, DNA hasarı, plazma zar kabarmasını, fosfatidilserin hücre yüzey maruz, mitokondriyal sitokrom c salınımı, kaspaz aktivasyonu, nükleer parçalanma, hücre büzülmesi gibi apoptoz açık özelliklerinden, kurtarma izin apoptotik cisimlerin ve oluşumu. Bu gözlemler inişi fonksiyonları, sonuçları ve mekanizmaları ile ilgili cevapsız soruları gündeme. Bu sorulara yanıt için, bir ön güvenilir Anastasis geçiren hücreleri tespit etmektir. Burada, biz canlı mikroskopi yöntemleri ve daha önce geç evre apoptoz ve th tersine çevirdi hücreleri tespit için bir kaspaz biyosensör tariftr kurtuldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Canlı Hücre Görüntüleme için Hücreleri 1. Hazırlık

  1. Morfolojik değişikliklerin saptanmasını kolaylaştırmak için, örneğin HeLa (insan servikal karsinom), daha iyi bir plazma zarı ve hücre içi organellerin değişiklik görselleştirmek için alt-tabaka ile düz olan hücreleri gibi yapışkan hücreleri seçin.
    Not: apoptoz Ters primer fare karaciğer hücreleri, primer fare makrofaj primer Sıçan kardiyomiyositlerinde de dahil olmak üzere, çeşitli memeli hücreleri 12,13, gözlenen ve ayrıca, insan embriyonik böbrek HEK-293T hücreleri, Afrika yeşil maymunu böbrek epitelyal COS gibi hücre hatlarına olan -7 hücreleri, fare kalp kası HL-1 hücreleri, fare NIH 3T3 fibroblastlar, gelincik beyin CRL1656 hücreleri, insan deri kanseri A375 hücrelerini, insan testis kanseri CRL1973 hücreleri, insan küçük hücre akciğer karsinoması H446 hücreleri, insan karaciğer kanseri (Mustela -furo putoris) HepG2 hücreleri, insan göğüs kanseri, MCF7 hücreleri, insan prostat kanseri PC3 hücreleri ve insan nöroblastom SH-SY5Y hücreleri.
  2. Temizlik ve sterilizasyon için mutlak etanol ile cam alt hücre kültürü yemekleri Ön yıkama cam lamelleri.
    Not 1: cam alt yemekleri kullanımı yüksek kaliteli diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi ve yüksek büyütme konfokal veya epi-floresan mikroskobu (Tartışma bakınız) için tavsiye edilir.
    Not 2: yüksek büyütme (40X, 60 / 63X veya 100X hedefleri ve yüksek sayısal delikler 1.3 veya 1.4) için, ince cam alt (kalınlık 0,085-,16 mm) hücre kültürü yemekleri kullanılması görüntüleme mesafeleri daha uzun çalışma sağlar (Protokol 3 Bkz ).
  3. Hücre tipine bağlı olarak, cam alt kültür tabakları, poli-D-lisin (0.1 mg / ml), kolajen (0.01 M asetik asit içinde% 0.01 çözelti) ve / veya fibronektin (5 ug / ml) önceden tohumlanma ile kaplama gerektirebilir Hücreler.
    Not: Çeşidi ve kaplama maddesinin konsantrasyonu optimizasyonu farklı hücre hatları için gereklidir. HeLa hücreleri kaplama olmadan doğrudan camın üzerine yapışabilir. Bununla birlikte, bazı hücreler, such fare kalp kası HL-1 hücreleri gibi, cam yüzeylere doğrudan bağlı, ancak belirli bir kültür ve kaplama protokolleri 37 gerektirir olamaz.
  4. Tohum ~ 35 mm önceden kaplanmış cam alt hücre kültür tabaklarında 2-3 x 10 5 hücre ve% 80 ortak akışkanlığa elde etmek için bir gün boyunca% 5 CO2 ile (° C) 37 derece Celsius'ta inkübe edilir.
    Not 1: hücre yoğunluğu, kuluçka süresi, kültür durumun Optimal koşullar hücre tipine bağlı olarak değişebilir. Hücre birleşmesi hücreleri (Protokol 2 bakınız) apoptotik yanıtı etkileyebilir. Yüksek Akışların birleştiği yerde hücreler, hücreler, apoptotik uyarıcının aynı konsantrasyonlarda daha az duyarlı olabilir.
    Yüksek hücre yoğunluğu, bireysel hücrelerin ve organellerin morfolojik değişiklikler belirsiz gibi, birleşik hücreler üzerinde kaçının: Not 2.

2. Uygulama ve Apopitotik Hücre Uyaranlara çıkarılması

  1. Kullanımdan hemen önce, 37 ° C hücre kültürü ortamı ile apoptosis teşvik edici ajan, önceden karıştırın. Etanol (3,6-4,5% Hac / hac), mevcut gösteri apoptoz indükleyici olarak görev yaptı.
    Not 1: yayınlanmış ve yayınlanmamış veri hücreleri, aynı zamanda, örneğin dimetil sülfoksit (DMSO, 24 saat süre ile% 8 hacim / hacim), staurosporin (STS, 0.5 uM olduğu gibi, diğer apoptotik uyarıcılar 12,13 tarafından tetiklenen apoptozu ters olduğunu göstermektedir 1 saat) ve taksol (12 saat boyunca 1 uM). Tetikleme apoptosis için dozunun optimizasyonu, apoptosise maruz popülasyonda hücrelerin çoğunluğu tetikleyebilir en düşük doz elde etmek için farklı hücre çeşitleri için gereklidir.
    Not 2: hücre kültür ortamı ile apoptosis teşvik edici maddeler Ön karıştırma uyaranlara apoptotik hücrelerin düzensiz maruz kalmasını önlemek için önemlidir.
  2. Resim temel morfolojileri kurmak için apoptosis teşvik edici ajan uygulanmadan önce, hücre kültürü çanağı içinde sağlık hücreleri grubu.
  3. Hücre kültürü kabı orijinal orta çıkarın ve çanak ile önceden karıştırılmış apoptosis teşvik edici madde 2 ml uygulamakapoptosise maruz hücrelerin tetikler. % 5 CO2 (ya da diğer normal kültür koşulları) ile 37 ° C'de inkübe hücreleri.
  4. Inkübasyondan sonra, apoptotik özelliklere ilerlemesini izlemek için ışık, epi-floresan veya konfokal mikroskobu ile hücrelerin dikkate alınmalıdır.
    Not 1: apoptoza hücreler mikroskop ve floresans bazlı biyosensör ile tespit edilebilir apoptozun morfolojik, biyokimyasal ve moleküler ayırt edici görüntüler (bkz Protokoller 3 ve 4).
    Not 2: farklı apoptosis teşvik ediciler hücrelerin İnkübasyon süresi, hücre tipi (örneğin, konfluansa ve besin durum gibi) hücre koşulları ve uygulanan ölüm uyarıcı dozuna bağlı olarak farklılaşacaktır. Dikkatli titrasyon gerekebilir.
  5. Hücreler apoptoz ayırt edici görüntüler zaman, sıcak (37 ° C, ya da diğer normal kültür sıcaklığı), taze hücre kültürü ortamı ile bir kez hücreler yıkanarak apoptosis teşvik edici ajan çıkarın.
    Not 1: apoptotik hücreler daha gevşek takılı olduğundankültürü plakası, tatbik edilmesi ve bu hücreler yıkanır olmayacak şekilde dikkatli orta kaldırmak için önemlidir.
    Not 2: Canlı süspansiyon hücreler yavaşça santrifüj (160 x g 1 dakika) ile yüzer kısımdan geri kazanılmasını ve kültür kaplarına eklenebilir.
  6. 2 ml /% 5 CO2 taze hücre kültür ortamı içinde 35 mm çanak ile 37 ° C'de inkübe hücreleri. Seçenek olarak ise, kullanım koşullu ortam (sağlıklı hücrelerinden toplanan hücre içermeyen kültür ortamı), ayrıca, apoptotik hücrelerin hayatta kalmasını geliştirmek için.
    Not: Yıkama ve taze ortam ile inkübe edilmesi, hücrelerin büyük çoğunluğunun etanol maruz 12,13 sonra etanol-kaynaklı apoptosisi tersine izin verir. Bununla birlikte, hücreler, diğer apoptotic uyaranlara maruz kaldıkları zaman, bu yıkama aşaması gerekli olabilir tekrar (tartışmaya bakınız).

3. Canlı Hücre Mikroskopi

  1. Biz, çevre kontrolü ile ters konfokal veya epi-floresan mikroskop (37 ° C kullanmanızı öneririzCanlı hücreler mikroskopi için% 5 CO 2).
    Not: Aynı zamanda bir su daldırma hedefi ile dik mikroskoplar kullanılarak hücrelerin görüntüye mümkündür. Görüntü hücrelere kültür ortamına doğrudan objektif batırın. Ancak, hücre odaklama sırasında daldırma hedefi ile ezilebilir.
  2. Ön-sıcak (örneğin çevre kontrol odasına, sahne kuvöz ve objektif ısıtıcı gibi) mikroskop görüntüleme önce en az 2 saat.
    Not: Bu odak ve xy düzleminin vardiya sapmasını önlemek, böylece mikroskop bileşenleri nedeniyle bileşenlerin ısıl genleşme ve daralma, termo-dengeye ulaşmasını sağlar.
  3. Kültür hücrelerinin bir 35 mm cam alt çanak yerleştirin ters bir mikroskop sahnede (Protokol 1 bakınız) ve hücreleri görüntüleme için bir sayısal açıklık (NA) 1.3 veya 1.4 ile 40X veya 63X plan Apochromat objektif kullanılarak hücre görüntüleri yakalayabilir Cam lamelleri ile çanak alt.
    Not: orta 2 yılı ml uygulamaktan kaçınınorta ağırlığı aynı odak düzlemi görüntü zor hücrelerin bir alan yapım, cam alt eğrilik neden olabilir gibi 35 mm cam alt çanak için.
  4. Tüm görüntüleme işlemi sırasında 37 ° C veya ilgili normal sıcaklıkta hücreleri koruyun.
    Not: apoptoz bir işlem, ve apoptozun muhtemelen ters, sıcaklığa duyarlı olan enzimatik aktivitelerin bağlıdır. Bu nedenle, (a mikroskop aşamasında üst kuluçka örn), 37 ° C'de hücreler muhafaza deney boyunca önemlidir. Azalmış sıcaklık apoptotik yanıtı ve apoptotik uyaran çıkarıldıktan sonra kurtarma yanıtı yavaşlatabilir.
  5. Orta buharlaşma yoluyla su kaybını azaltmak için kültür çanak şeffaf folyo (Bkz Malzemeleri) bir nem cihazı kullanın veya yatıyordu.
    Not: folyo DIC mikroskopi için ışık kutuplarını bozabilir. Işık yolda polarize ayarlayarak polarite geri yükleyin.
  6. PH muhafazaMikroskop bir çevresel kontrol gözü ile% 5 CO2 içinde inkübe edilerek, hücre kültür ortamı (pH 6.8 -7.3).
    Not: kültür ortamı içinde, pH, aynı zamanda, HEPES tamponu ilave edilerek sağlanabilir bakım ya da ticari CO2-bağımsız ortamı kullanılarak (Malzeme bakınız). Optimal koşullar hücre tipine bağlı olarak değişebilir.
  7. Hücre / hücre içi yapılar veya ifade biyosensörler (Protokolü 4 Ayrıntılar) yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için gerekli en düşük floresan yoğunluğu azaltarak fototoksisite önlemek için görüntüleme işlemi sırasında hücrelere floresan / lazer (uyarma ışık yoğunluğu) maruziyetini en aza indirin.

Sırasında ve Apoptotik sonrası olaylar Algılama ve Takip inişi için 4. Stratejileri

  1. Plazma membran blebbing, sitoplazmik yoğunlaşma, hücre çekme ve apoptotik vücut oluşumu (Şekil 1A izle - C, E).
    1. Time-lapse canlı hücre farklılık sorumluluk yönün gerçekleştirinrential girişim kontrast (DIC) veya faz kontrast mikroskopisi sağlık hücrelerinin bir grup izlemek için ve hücre morfolojisi (canlı hücre mikroskopi Protokolü 3 Bkz ve Tartışma bakınız) gözlemlemek.
      Not 1: hücrelerine fototoksisite önlemek için DIC / faz sözleşme görüntüleme için ışık kaynağının yoğunluğunu azaltın.
      Not 2: DIC ve faz kontrast mikroskobu mevcut değilse, konfokal veya epi-floresan mikroskopi canlı hücrelerin morfolojisi anahat ve hücre morfolojisi izlemek için sitoplazmada leke CellTracker kullanın.
    2. (Uygulama ve apoptotik uyaranlara çıkarılması için Protokol 2 bakınız) apoptosise maruz hücrelerin tetiklemek için hücre ölümü uyarıcı uygulanır.
    3. Plazma zar kabanr, sitoplazma yoğunlaştırma, hücre büzülmesi ve apoptotik vücut formasyonu (Şekil 1A, 1B, 1C, 1 E) olarak apoptosisin morfolojik özellikleri için işlenmiş hücreleri dikkate alınmalıdır.
    4. Taze orta hücreleri ile ölüm uyaranlara ve yeniden tedarik hücreleri yıkayacak displaapoptozun y morfolojik özellikleridir.
      Not 1: Hücre ölümü uyaran uygulama veya bir perfüzyon hücre kültür odası kullanılarak elde edilebilir hızlandırılmış canlı hücre görüntüleme sırasında mikroskop sahnede hücre kültür ortamı değiştirmek ya da dikkatli bir şekilde dokunmadan pipetleme hücre kültürü tabağına doğrudan yapılabilir görüntüleme arasında aralıklarla sırasında çanak.
      Not 2: kullan odak sapma telafisi sistemleri, hücre kültür ortamı (Tartışma bakınız) değiştirdikten sonra mikroskop sisteminin termo-denge kaybı nedeniyle hücrelerin odak dışına önlemek için.
    5. Sürekli time-lapse görüntüleme apoptoz işaretlerinden görüntüler hücrelerin kaderini izlemek için. Apoptoz ters Hücreler hasarı onarmak ve normal düz morfolojisi (Şekil 1A, 1B, 1C, 1E) yeniden alabilirsiniz.
  2. Mitokondriyal parçalanma, DNA / kromatin yoğunlaşması ve nükleer parçalanma (Şekil 1D, 1. Kat, 1G bakınız).
    1. Mitochond görselleştirmek içinRia, 50 nM MitoTracker kırmızı / koyu kırmızı / yeşil floresan boya ile boyama hücreleri ve aynı zamanda,% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 20 dakika süre ile kültür ortamı içinde Hoechst 33342 nükleer mavi boya, 10 ug / ml çekirdeği leke.
      Not 1: sitotoksiteyi önlemek ve zaman ihtiyaç arka plan floresan azaltmak için boyaların ve inkübasyon süresi konsantrasyonu azaltın. Boyama için boya ve inkübasyon süresi az miktarda gürültü oranı için iyi bir sinyal elde etmek için boyama koşulları optimize.
      Not 2: Bu tür apoptozis sırasında mitokondri dışarı sızmaz MitoTracker Kırmızı CMXRos, MitoTracker Derin Kırmızı FM, ya MitoTracker Yeşil FM, gibi mitokondri için floresan lekeleri kullanın. Bu apoptoz ve inişi sırasında mitokondrial morfolojisi görselleştirme sağlar. Bu lekeler hakkında ayrıntılı bilgi için malzeme ve ekipman tabloya bakın.
    2. Photobleaching önlemek için karanlıkta lekeli hücrelerin tutun.
    3. Hücreleri yıkayarak aşırı leke çıkarmakDaha sonra 1 dakika, her bir yıkama arasında yeni bir ortam içinde inkübasyon ile 37 ° C fosfat-tamponlu salin (PBS) çözeltisi ya da taze hücre kültürü ortamı ile 3 kez daha fazla izin vermek için son yıkama önce 20 dakika boyunca, taze ortam içinde inkübe lekeler görüntüleme için non-spesifik sinyal arka plan azaltmak için hücrelerin çıkmak için.
      Not: boyama görüntüleme için yüksek arka planda neden olabilir sonra hücre ortamı ile inkübasyon sürelerini kısaltın.
    4. Apoptotik indüksiyon uygulanmadan önce görüntü sağlıklı hücrelere gerçek zamanlı canlı hücre konfokal veya epi-floresan mikroskopi gerçekleştirin (canlı hücre mikroskopi Protokolü 3 bakınız).
      Not: Sağlıklı hücreler çoğu hücre tiplerinde (Şekil 1D, 1F, 1G) tübüler mitokondri ve yuvarlak çekirdekleri görüntüler.
    5. (Hücreler için uygulama ve apoptotik uyaranlara çıkarılması için Protokol 2 bakınız) apoptosise maruz hücrelerin tetikler.
    6. Mitokondriyal ve nükleer morfolojisi değişiklikleri gözlemlemek için canlı hücre mikroskopi zaman atlamalı devamölüm uyarıcı hücrelere uygulanır hemen sonra ies. Tübüler mitokondri ve yuvarlak çekirdekleri görüntüleyen sağlıklı hücrelerden farklı olarak, bu tür mitokondriyal parçalanma ve şişlik, kromatin yoğunlaşması ve nükleer parçalanma gibi apoptoz işaretlerinden görüntülemek için hücreleri gözlemleyin.
    7. Hücreler apoptoz işaretlerinden görüntüler zaman, yıkama ve taze ortam ile hücrelerin tedarik ve hücrelerin kaderini izlemek için zaman atlamalı görüntüleme devam ediyor. Apoptoz ters hücreler normal mitokondriyal ve nükleer morfolojisi (Şekil 1D, 1F, 1G) yeniden.
      Not: hücreler (DIC mikroskopi Protokolü 4.1 bakınız) aynı grupta hücre morfolojisi değişiklikleri gözlemleyerek apoptoz aşamalarını erişmek için ek bilgi almak için mümkün olduğunda paralel olarak DIC mikroskopi gerçekleştirin.
  3. Stabil bir sitokrom-c GFP füzyon pr ifade hücreleri kullanarak c sitokrom mitokondriyal sürümü Algılamaotein (Bakınız Şekil 2).
    1. Stabil MitoTracker Kırmızı ile GFP 23,24 c sitokrom ifade Leke hücreleri polarize hücre mitokondri (canlı hücre mitokondri boyama 4.2.3 için Adımları 4.2.1 bakınız) etiketlemek için.
    2. Sağlıklı hücreler (canlı hücre görüntüleme için Protokolü 3 Ayrıntılar) izlemek için gerçek zamanlı canlı hücre konfokal veya epi-floresan mikroskobu gerçekleştirin.
      Not: sitokrom-c GFP sinyali öncelikle sağlıklı hücreler (Şekil 2A i 2B) mitokondride lokalize.
    3. (Hücreler için uygulama ve apoptotik uyaranlara çıkarılması için Protokol 2 bakınız) apoptosise maruz hücrelerin tetikler. Sitoplazmada mitokondri sitokrom c GFP translokasyonuna gözlemlemek için zaman atlamalı mikroskopi Devam (Şekil 2Aii-iii, 2B).
      Not: sitozolüne sitokrom c Mitokondriyal sürümü mitokondrial dış membran permeabilization bir belirtecidir (MOMP)4, mitokondri-bağımlı apoptoz 21,22 kritik bir adım
    4. Hücreler sitoplazmada sitokrom-c GFP sinyalini görüntüler, hücre ölümü uyaran kaldırmak ve tedarik hücreleri taze ortam ile (Protokol 2 bakınız). Sitozolik GFP ile hücrelerin kaderini izlemek için zaman atlamalı görüntüleme devam edin.
      Not: Normal hücre morfolojisi yeniden apoptoz ters Hücreler ve mitokondri geri muhtemelen bozulması veya translokasyon yoluyla sitozolik sitokrom-c GFP sinyali azaltmak (Şekil 2Aiv-vii, 2B).
    5. Tek hücre veya hücre grubunun (DIC mikroskopi Protokolü 4.1 bakınız) hücre morfolojisi değişiklikleri gözlemleyerek apoptoz aşamalarını erişmek için ek bilgi almak için paralel DIC görüntüleri yakalayın.
  4. Bir kaspaz bio-sensor aracılığıyla kaspaz etkinliğinin tespiti (Şekil 3 e bakınız)
    1. Için kaspaz biyosensör NES-DEVD-YFP-NLS ile Transfect hücreleri16 apoptotik uyaran 13 onlara tabi önce saat 24.
    2. (Canlı hücre nükleer boyanma için Adımları 4.2.3 için 4.2.1 bakınız) hücre çekirdekleri etiket Hoechst 33.342 ile transfekte kültürleri Leke.
    3. Sağlıklı hücreler (canlı hücre görüntüleme için Protokolü 3 Ayrıntılar) izlemek için gerçek zamanlı canlı hücre konfokal veya epi-floresan mikroskobu gerçekleştirin.
      Not: NES-DEVD-YFP NLS biyosensör sinyali esas olarak nükleer ihracat sinyali (NES) (Şekil 3A, 3Bi ve 3C, Tartışma) bağlı sağlıklı hücrelerin sitosolünde lokalize eder.
    4. (Hücreler için uygulama ve apoptotik uyaranlara çıkarılması için Protokol 2 bakınız) apoptosise maruz hücrelerin tetikler. YFP nükleer translokasyonu gözlemlemek için zaman atlamalı mikroskopi devam edin.
      Not: kaspazlar yararak aktivasyonu çekirdeği sitoselden YFP-NLS translokasyon sonucu kaspaz biyosensör NES-DEVD-YFP-NLS DEVD motifi, (Şekil 3A, 3Bii-iv, Tartışma bakınız).
      5. , apoptotik uyaran kaldırmak ve tedarik hücreleri taze ortam ile (Protokol 2 bakınız).
      Apoptoz, normal hücre morfolojisi yeniden ters hücreler, ancak, nükleer YFP sinyali (Şekil 3Bv-x Hücreler 1, 2 ve 3 boyutlu) korumak: edin.
    5. Nükleer YFP görüntüler hücrelerin kaderini izlemek için zaman atlamalı görüntüleme devam edin.
      Not: Nükleer YFP sinyal hücreleri apoptoz ters sonra (Şekil 3B vi-x, Hücre 1, Sonuçları ve Tartışma bakınız) bozulmuş birkaç saat olmak muhtemelen böyle bir proteazom bozulması gibi normal hücre temizlenme mekanizmaları yoluyla olacaktır.
    6. Hücre tek hücreler morfolojik veya hücre grubunda değişiklik gözlenmesi ile apoptoz aşamalarını erişmek için ek bilgi elde paralel içindeki DIC görüntü yakalama. (DIC mikroskopi Protokolü 4.1 bakınız).
  5. Fosfatidilserin Hücre yüzey maruziyet (Bakınız Şekil 4)
    1. Gl Tohum hücrelerieşek% 80 hücre confluency (Protokol 1 bakınız) ulaşmak için lamelleri.
    2. (Canlı hücre mitokondrial ve nükleer boyanma için Adımları 4.2.3 için 4.2.1 bakınız) sırasıyla mitokondri ve çekirdekler için kırmızı floresan Mitotracker ve mavi Hoechst 33.342 leke hücreleri Eş-leke.
    3. Bir apoptoz indükleyici ile apoptosise maruz hücrelerin tetikler (Protokol 2).
    4. Apoptotik hücre yüzeyi üzerinde fosfatidilserin maruz kalmasını saptamak için apoptoz indükleyici ortamdan uzaklaştırılmasından önce, 37 ° C 'de apoptotik hücreler 10 dakika leke floresan etiketli anneksin V (Malzeme) uygulanır.
      Not 1: fosfatidilserin normalde hücre plazma zarı 38 iç-broşür tecrit çünkü Sağlıklı hücreler anneksin V ile boyandı değildir. Apoptotik hücreler, hücre yüzeyi (Şekil 4A ve 4B), fosfatidilserin bağlanan anneksin V ile boyanır.
      Not 2: Floresan etiketli anneksin V, apoptotik hücre imm leke uygulanabilirediately 10 dakika inkübasyon ile apoptoz indükleyici çıkarılmasından sonra.
    5. Hücre ölümü uyaran çıkarın kez sıcak PBS ya da taze ortam ile boyalı hücrelerin yıkayın ve daha sonra% 5 CO2 (Protokol 2'ye bakınız) ile, 37 ° C'de 2 saat süreyle taze ortam ile hücrelerin kaynağı.
      Not 1: apoptoz normal morfoloji yeniden normal morfoloji kazanmak sonra floresan etiketli anneksin-V sinyali muhafaza ters hücreler (Şekil 4A ve 4B).
      Not 2: anneksin V sinyal elde edilen hücreler (Tartışma bakınız) zamanla azalır.
    6. Oda sıcaklığında, karanlıkta, 20 dakika için 1 x PBS içinde% 8 sükroz içeren% 4 paraformaldehit ile seçilen zaman noktalarında hücreler saptamak, ve cam lameller üzerine hücreler monte etmeden önce paraformaldehid kalmaması için 3 kez PBS ile sabitleştirilmiş hücreler yıkama antifade mountant ile lamelleri konfokal veya epi-floresan mikroskopi için (Malzemeler bakınız) ve apoptoz indüserinin çıkarıldıktan sonra hücreler üzerinde anneksin V gözlemlemek.
      Not 1: sabitleştirici sukroz tespit sırasında hücre zarı yapısını korur.
      Not 2: bozulmasını önlemek için, 4 ° C'de karanlıkta paraformaldehit çözeltisi saklayın.
      Not 3: hücrelerine soğuk çarpmasını önlemek için sabitleme için hücrelere uygulamadan önce oda sıcaklığına paraformaldehid çözüm ısıtın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Apoptoz ters çalışma yapmak için, doku kültürü hücreleri ilk apoptoz tetiklemek için bir ölüm uyarıcıya maruz kalmaktadır. Hücreler apoptoz işaretlerinden gösterilecek zaman taze kültür ortamı daha sonra uyaran yıkayacak ve ardından kurtarma (Şekil 1A) izin ölüyor hücreleri inkübe uygulanır. Burada, ele alınan temel soru, bireysel ölüyor kültür hücreleri apoptoz doğru ilerleme ve hala Anastasis tabi ne kadar olduğunu. Bu soru kesinlikle aşağıda açıklanan yöntemler kullanılarak hücre kaderi izlemek için ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Anastasis hücre ölümü yolu aktive olan hücreler daha sonra ölüyor süreci tersine ve hayatta fenomen ifade eder. Burada, canlı hücre görüntüleme aslında aynı tek tek hücreler bir son aşamada, apoptotik hücre ölümü sürecinin tersine ve yaşam ve çoğaltmaya devam onaylamak için kullanılabileceğini göstermişlerdir. Bizim protokolleri apoptoz teşvik ve doğrulama için çeşitli biyomarkerler ile izlenen apoptoz dönüşümüne maruz hücrelerin büyük bir kısmını sağlamak için birçok optimize hücre tipine özel tedavi koşullarını açıkla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Biz kelime "Anastasis" apoptoz ters açıklamak için öne için Rev Dr Ralph Bohlmann ve Rev Dr James Voelz teşekkür; Stabil sitokrom c GFP ifade HeLa hücreleri Douglas R. Yeşil; H446 hücreleri Charles, M. Rudin ve Eric E. Gardner; Video karikatür çizim konusunda yardım almak için Heather Kuzu; Bu yazının değerli tartışma için Yee Hui Yeo. Bu çalışma Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), Dr. Walter Szeto Memorial Bursu (HLT), Fulbright hibe 007-2009 (HLT), Yaşam Bilim Araştırma Vakfı bursu (HLT) tarafından desteklenen, NIH NS037402 (JMH) verir ve NS083373 (JMH), ve Hong Kong Üniversitesi Hibeler Komitesi AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı Shurl ve Kay Curci Vakfı üyesidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
LSM780 konfokal mikroskopiCarl Zeiss
Cam alt kültür kabıMatTek CorporationP35G-0-14-C
Şeffaf CultFoiCarl Zeiss000000-1116-084
CO2 bağımsız ortamYaşam Teknolojileri18045-088
CellTrackerYaşam TeknolojileriC34552
Mitotracker Kırmızı CMXRosYaşam TeknolojileriM-7512
Hoechst 33342Yaşam TeknolojileriH1399
Floresan etiketli annexin VBiovisionK201

Kaynaklar

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680(2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Apoptozun Geri DöndürülmesiCanlı Hücre MikroskobisiKaspaz BiyosensörüMitokondriyal BoyamaNükleer BoyamaZaman Atlamalı GörüntülemeHücre Ölümü UyaranıMorfolojik İyileşmeSitokrom C Salınımı
Takip inişi, Apoptosisi tersine Cep Survival Fenomeni için Stratejiler
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.