Yöntem makalesi

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

DOI:

10.3791/51994

⸱

9 Ekim 2014

 ,  ,  , 
1NEST Laboratory, Scuola Normale Superiore, 2Center for Nanotechnology Innovation, Instituto Italiano di Tecnologia, 3Laboratory for Fluorescence Dynamics, Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu uzaysal dağılımı ve lipit ve protein gibi zar bileşenlerinin hareketi pek çok hücresel fonksiyonlarının düzenlenmesinde önemli bir etken olduğu giderek daha belirgin hale gelmiştir. Bununla birlikte, hızlı dinamikleri ve ilgili küçük yapılar için, çok yüksek uzay-zaman çözünürlüklü moleküllerin gerçek davranışlarını yakalamak için gereklidir. Burada yüksek uzaysal çözünürlüklü Canlı hücrelerdeki floresan etiketli plazma zar proteinleri ve lipidler dinamiğini çalışmak için deneysel protokol mevcut. Özellikle, bu yaklaşım, her bir molekülün izlendiği gerek yoktur, fakat zarın belirli bir bölgedeki tüm molekülleri kullanılarak nüfus davranışı hesaplar. Başlangıç ​​noktası, zar üzerinde belirli bir bölgenin hızlı görüntülenmesidir. Daha sonra, tam bir uzay-zaman otomatik bağıntı kurma fonksiyonu, örneğin, her biri 2, 3, n, tekrarları zaman gecikmeleri arttırmayı alınan görüntüleri ilişkilendirilmesi hesaplanır. Bu genişlik göstermek mümkündürdifüzyona bağlı parçacık hareketinin bir fonksiyonu olarak zaman gecikmesini arttırmayı mekansal otokorelasyon fonksiyonu artar pik. Bu nedenle, otokorelasyon fonksiyonların dizi montaj gerçek protein burada ortalama yer değiştirme karşı belirgin yayılma biçiminde, görüntüleme (iMSD) için ortalama kare deplasman elde etmek için olanak sağlar. Bu nanometre hassasiyetle tek moleküllerin ortalama dinamiklerinin kantitatif bir görünüm verir. Etiketli Transferin Reseptör (TfR) ve ATTO488 bir GFP etiketli varyantı kullanarak 1 Palmitoyl- 2-hidroksi sn -glisero-3-fosfoetanolamin (KKE) o üzerinde protein ve lipit difüzyon Spatiotemporal düzenlenmesini gözlemlemek mümkündür mikro kadar mili saniyelik bir zaman aralığında um boyutlu zar bölgeleri.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Singer ve Nicolson tarafından orijinal "sıvı mozaik" modeli başlayarak, hücre plazma zarı resim sürekli iskeleti ve lipit etki 1,2 yükselen rolünü kapsayacak şekilde son yıllarda güncellendi.

İlk gözlemler membran proteinlerinin önemli bir kısmı 3-5 hareketsiz olduğunu (sıkı bağlamak) açıklanması photobleaching sonra floresan iyileşme elde edilmiştir. Bu öncü çalışmalar, çok bilgilendirici olmasına rağmen, sıkı bağlamak kurulumları nispeten zayıf alan (mikron) olarak çözünürlük ve zaman (saniye) muzdarip. Ayrıca, bir topluluk ortalama ölçümü olmak, sıkı bağlamak tek molekül davranışı hakkında bilgi veren yoksun.

Bu bağlamda, spesifik olarak bir olasılık (aynı anda bir difüzyon işlemi bir molekülün çalışma sağlayan) çok parlak etiketleri ile tek bir molekül etiketlemek için oldukça başarılı olmuştur. Özellikle, iterekve mikrosaniye zaman çizelgesi, Kusumi, büyük ölçüde membran fizyolojisi 6 aktin esaslı membran iskeletinin rolünün tanınması katkıda lipid ve protein dinamikleri bilinmeyen özellikleri ark. kazandı erişim için Tek Parçacık Takibi (SPT) yaklaşımı zaman çözünürlüğü , 7. Bu bulgular, lipid ve protein difüzyon aktin bazlı bir iskelet tarafından ayarlandığı, "kazık ve çit" modeli olarak adlandırılan oluşturulur. Ancak, SPT birçok deneysel konularda sağlanan bilgilerin büyük miktarda erişimi için ele alınması gerekir. Özellikle, etiketleme prosedürü genellikle sisteme etiketli türlerin üretimi, saflaştırılması ve tanıtım gibi birçok adımlarla oluşur. Ayrıca, büyük bir etiket, kuantum noktaları veya metal nanopartiküller gibi, çoğu zaman alt-milisaniye süreler ve bir çok durumda önlenebilir edilemeyen etiket ile hedef moleküllerinin çapraz bağlanmasını ulaşmak için gereklidir. Son olarak, birçok yörüngelerİstatistiksel kriterlerine uygun kaydedilecek olan ve eş zamanlı olarak etiketin bir düşük yoğunluklu izleme izin vermek için gereklidir.

SPT ile karşılaştırıldığında, bu sakıncaları birçok üstesinden flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS), moleküler dinamiklerini incelemek için çok umut verici bir yaklaşımı temsil etmektedir. Aslında, FCS geçici transfekte hücrelerinde floresan protein etiketli moleküllerinin dinamiklerini incelemek sağlayan, loş ve yoğun etiketleri ile iyi de çalışıyor. Ayrıca, zaman sınırlı bir miktarda yüksek istatistikleri ulaşan verir. Son olarak, etiket "yüksek" yoğunluğuna rağmen FCS tek molekülleri bilgi sağlar. Tüm teşekkürler, bu özelliklere FCS çok düz bir yaklaşımı temsil etmektedir ve yoğun bir model membranlar ve canlı hücreler 8-10 hem lipid ve protein dinamikleri üzerinde çalışmak için uygulanmıştır. Birçok farklı yaklaşımlar moleküler difüzyon ayrıntılarını ortaya çıkarmak için FCS yeteneğini artırmak için önerilmiştir. Örneğin, sh wasKendi farklı büyüklükteki gözlem alanları FCS gerçekleştirerek bir molekül hareketlerinin 11,12 bir "FCS difüzyon yasası" aydınlatıcı gizli özellikleri tanımlayabilirsiniz. Boyutu değişmiştir olmanın yanı sıra, odak alanı da, 13 yinelenmiş oldu hızlı kameralarla 21,22 hatlarda 14-20 veya konjuge boyunca uzayda taşındı. Bu 'uzay-zamansal' korelasyon yaklaşımlar kullanılarak, çeşitli membran bileşenlerinin ilgili biyolojik parametreler nicel modeli membranlar ve gerçek biyolojik olanlar, membran mekansal organizasyon haline tutulmakta ve böylece içgörü hem tarif edildi.

Ancak, tüm FRAP ve FCS uygulamalarda şimdiye kadar tarif edilen fokal alanının boyutu aşılamayan uzamsal çözünürlüklü bir sınırı temsil eder. Çeşitli süper çözünürlüklü görüntüleme yöntemleri son zamanlarda bu sınırı aşmak için geliştirilmiştir. Bazıları böyle Stokastik optik yeniden mikroskobu (STORM) gibi, yerelleştirme hassas dayanmaktadır 23,24, foto-aktifleştirme lokalizasyon mikroskobu (PALM) 25, flöresanlı PALM (FPALM) 26 ve tek parçacık izleme PALM (sptPALM) 27: her anlık gerekli foton nispeten büyük miktarda bununla birlikte, zaman çözünürlüğü sınırlar En az birkaç milisaniye için bu yöntemler, bu nedenle in vivo olarak uygulanabilirliğini engellemektedir.

Buna karşılık, süper çözünürlük görüntüleme için umut verici bir alternatif mekansal uyarılmış emisyon tükenmesi yöntemleri (STED'in veya geri dönüşümlü doyabilen optik floresan geçişler (RESOLFT)) 28,29 ile floresan emisyonu modüle tarafından açılmıştır. Bu yaklaşımlar hızlı tarama mikroskopları ve algılama sistemleri kullanmaya imkanı ile gözlem hacminin şekillenmesini çok altında kırılma sınırını birleştirir. Flüoresan iniş-çıkışlarını analizi ile birlikte, doğrudan mikroskopi STED'in lipidler ve p nano uzaysal dinamikleri prob bırakıldıcanlı hücre membranları içinde 30,31 roteinler.

STED'in bazlı mikroskopi aynı fiziksel miktarlar Canlı hücrelerdeki floresan etiketli zar proteinleri ve / veya lipidler dinamiklerinin çalışma için uygun modifiye edilmiş bir uzay-zaman görüntü korelasyon spektroskopisi (H TATİSTİKLERİ 32,33) yöntemi ile elde edilebilir ve ticari bir mikroskop ile. Burada sunulan deneysel protokol birkaç adımda oluşur. Birincisi, zar üzerinde ilgili bölgenin hızlı bir görüntüleme gerektirir. Daha sonra, elde edilen görüntülerin yığın ortalama uzaysal ve zamansal ilişki işlevleri hesaplamak için kullanılır. Bağıntı fonksiyonlarının bir dizi montaj olarak, molekül "difüzyon kanunu 'belirgin bir difüzyon (D uygulaması) şeklinde görüntüleme şirketinden elde edilebilir - -Ortalama değiştirme grafiğinin. Bu komplo eleştirel molekülleri tarafından keşfedilmeyi ortama bağlıdır ve doğrudan gerçek difüzyon modları tanıma sağlarilgilenilen lipit / protein elde edilir.

Daha önce 34 görüldüğü gibi ayrıntılı olarak, elde edilen görüntü serisi uzay-zamansal otomatik korelasyon fonksiyonu eleştirel toplanan resim serisi hareketli moleküllerin dinamiklerine bağlıdır (Aynı mantık bir hat satın uygulanabilir lütfen unutmayın Uzayda sadece tek boyut) olarak kabul edilir burada. Özellikle, korelasyon fonksiyonu olarak tanımlar:

figure-introduction-1 (1)

nerede figure-introduction-2 , x konumuna, ölçülen floresans yoğunluğu temsil etmektedir, y-ve t de, figure-introduction-3 ve figure-introduction-4 temsil x mesafe vesırasıyla y yönlerinde, figure-introduction-5 zaman aralığını temsil eder ve figure-introduction-6 ortalamasını temsil eder. Bu fonksiyon, şu şekilde ifade edilebilir:

figure-introduction-7 (2)

'N', gözlem alanında moleküllerin ortalama sayısı temsil ettiği, figure-introduction-8 Uzayda büklüm operasyon temsil eder ve figure-introduction-9 enstrümantal bel otokorelasyonu temsil eder. Bu ikinci durum optik / kayıt kurulum için tek bir emitörün fotonlar uzayda yayılır nasıl bir önlem olarak yorumlanabilir (sözde Noktası Yayılması Fonksiyonu, PSF, geniyi) bir Gauss fonksiyonu tarafından yaklaşık ralli. Son olarak, figure-introduction-10 bir mesafede bir parçacık bulmak için olasılığını temsil eder figure-introduction-11 ve figure-introduction-12 bir süre geçtikten sonra figure-introduction-13 . Biz parçacıkların her yöne rastgele hareket ve net tozları mevcut olmayan hangi bir uzadıya dinamikleri, düşünürsek, bu fonksiyon da iyi varyans hareketli parçacığın ortalama Meydanı Tehcirine (MSD) olarak tespit edilebilir bir Gauss fonksiyonu ile yaklaşılır . Bu durumda, korelasyon fonksiyonunun bel (ayrıca şu şekilde de ifade figure-introduction-14 ), Partikül İskelet toplamı ve enstrümantal bel olarak tanımlanabilir ve bir Gauss uyum ile ölçülebilirHer bir zaman gecikmesi için bağıntı fonksiyonunun anyonlar olabilecektir. Ölçülen ı MSD hareket eden moleküllerin belirgin bir yayılma hesaplamak için kullanılabilir figure-introduction-15 ve bir ortalama yer değiştirme figure-introduction-16 gibi:

figure-introduction-17 (3)

figure-introduction-18 (4)

Aşağıdaki bölümlerde boyunca okuyucuya rehberlik Kullanılan deney düzeneği üzerinde birkaç hususlar. Seçici ticari bir TIR floresan kullanarak, bir toplam iç yansıma (TIR) ​​aydınlatma kullanacak yaşayan hücrelerin bazal membran üzerinde florosforlar heyecanlandırmak için (TIRF) mikroskop (detaylar malzeme bölümünde bulunabilir). Ayrıca, sırayla th toplamakE floresan bir yüksek büyütmeli objektif kullanın ve (çip 16 mikron üzerinde piksel fiziksel boyutu) bir EMCCD kamera (100X NA 1.47, yüksek sayısal açıklık TIRF aydınlatma için gereklidir). 100 nm piksel boyutu ulaşmak için biz 1.6x ek bir büyütme merceği geçerlidir. Aşağıda tartışıldığı gibi, 1 ms altında bir zaman çözünürlüğü doğru 100 nm altında hızlı bir membran lipidlerinin dinamiklerini tanımlamak için gerekli olacaktır. Bu zamansal çözünürlüğe ulaşmak için biz kamera (512 x 512) bütün çip daha küçük faiz (ROI) bir bölgeyi seçmeniz gerekir. Bu şekilde, kamera zaman çözünürlüğü artırmak satır, daha az sayıda okuyacaktır. Ancak, bu okuma rejimde çerçeve zaman kamera üzerinde okuma çip maruz ücretleri değişiklikleri için gerekli ve 512 x 512 piksel EMCCD için milisaniye sırayla genellikle zaman ile sınırlı olacaktır. Bu sınırı yenmek için, gelişmekte olan bir teknoloji w, ROI-hatları, sadece yerine tüm çerçeveyi edilebiliyor(bizim EMCCD kırpılmış Sensör Modu denir) maruz çip boyutu bir pratik ve etkili azalma ITH. Bu yapılandırma, etkili olması için, dış ROI çip, optik bir yoldaki monte edilmiş delikli bir çift ile örtülmesi gerekir. Bir zaman çözünürlüğü aşağı 10 -4 saniye bu kurulum sayesinde elde edilebilir. 'Tartışma' bölümünde açıklandığı gibi bu yaklaşım, birçok farklı deney düzeneklerinin ile birleştiğinde olabilir, ancak unutmayın.

Yöntemin Gösterme GFP- bir ATTO488 etiketli hem 1-palmitoil-2-hidroksi-SN -glisero-3-fosfoetanolamin (ATTO488-PPE) ve transferrin alıcı bir GFP-etiketli varyantı kullanarak (canlı hücrelerde sağlanacaktır TfR). Daha önce 30,35 bildirildiği gibi ATTO488-KKD'nin durumunda bu yaklaşım başarılı bir çoğunlukla ücretsiz difüzyon gösteren ortalama değiştirmesinin bir fonksiyonu olarak neredeyse sabit bir D uygulaması kurtarabilirsiniz. Buna karşılık, TfR-GFP azalan D göstermektedir 6 düşündüren ortalama değiştirmesinin bir fonksiyonu olarak b> app. Ayrıca, ikinci durumda yerel difüzyon katsayısına ve membran düzlem üzerindeki pek çok mikrona kadar ortalama bir sınırlama alanını ölçmek mümkündür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sistem Kalibrasyon

  1. Nokta yayılma fonksiyonu (PSF) kalibrasyon
    1. Damıtılmış su içinde 90 ul, 30 ile floresan boncuk çözeltisi (yaklaşık 5 uM), 10 ul seyreltilir ve daha sonra 20 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır çözeltisi. Bir kare (1 cm x 1 cm) agaroz jeli (% 3) ve depozit jel üstündeki çözeltisinin 10 ul parça kesin. 2 cm Petri kabı alt camına jel parçası devirmek ve camına damla sıkın.
    2. , Satın alma kurulum açın tutucuya örnek koymak, kamera pozlama ve EMgain set (100 msn ve 1000 sistemine göre iyi parametrelerdir ama optimize) ve kamera soğumasını bekleyin.
    3. 100 milisaniye, 1,000 kamera EMgain, edinim moduna ayarlayın kamera pozlama ayarı kaydetmek Transferi, 100 tekrarı ve otomatik Frame.
    4. Jelin sınırında mercek ve iletilen ışık odaklama kullanılarak ve daha sonra, jel merkezine amacı hareket odaklanma ve sta ayarlamaklazer hizalama prosedürü rt (LAS AF, 'TIRF kurulum' seçin ve otomatik hizalama prosedürünü izleyin).
    5. Bir referans olarak (ki genellikle boncuk bütünü temsil) parlak noktaya odaklanmak doğru, izole tek noktalar ile bir görüş alanı bulun 100 kare kazanmak ve birkaç tek noktalar kazanmak için adımı 5-6 kez tekrarlayın.
    6. Bir veri işleme programına edinilen serisi İthalat ve zaman içinde (Şekil 1A) yığını ortalama ve tek bir izole boncuk seçin. Parçacık agrega önlemek için küçük olanları seçmek için özen gösterin.
    7. (Matlab Malzemelerinde ICS-Matlab araçları) komutu "gaussfit" kullanarak bir Gauss fonksiyonu ile seçilen yoğunluk dağılımı (tek boncuk profilinin bir örneğini Şekil 1B sunulmuştur) takınız. Elde edilen artıklar inceleyerek uyum iyiliğini doğrulayın (gelen artıklar ile donatılmış Gauss profilinin bir örneği i sunulmuşturn Şekil 1B).
  2. Kamera kalibrasyonu
    1. Kamerayı açın ve kamera soğumasını bekleyin. Set kamera alma ayarı, (yani, kullanılan kamera için biz 0.5 msn, 1.000 kamera EMgain, Kesilmiş Modu, 32 x 128, 10.000 tekrarlar için ROI boyutu edinim moduna pozu ayarlamak) ve kamera arka alımı başlatabilirsiniz sinyali.
    2. İthalat bir veri işleme programı çerçeve serisi satın aldı. Hesaplayın ve kamera arka çipin seçilen bölgede yaklaşık düz olduğunu doğrulamak için her pikselin ortalama yoğunluğunu kontrol edin. Kamera plan genellikle sınır hatlarında önyargılı çünkü kırpılmış modunda, her çerçeve için ilk ve (ROI boyutuna bağlı olarak 3-10) son birkaç yatay satırları kaldırın.
    3. Değerlerinin histogramı oluşturun (Matlab komut 'hist' kullanarak) yığını elde edilen görüntü (aynı zamanda Dijital Seviye DL tanımlanan) ve logaritmasını arsafrekansını sonuçtaki (Matlab semiloloji komutunu kullanarak). Kamera arka DL dağılımının bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir.
      NOT: kamera iyi çalışıyorsa, komplo üslü (log ölçekli negatif eğimli bir çizgi izledi sıfır foton ilişkili değerlerin dağılımını temsil eden yaklaşık Gauss tepe (log-ölçekte bir parabolik profili) gösterecektir ) foton 1 (Şekil 2) ile ilişkili değerlerinin dağılımını temsil eder. Üstel kısmının çürümesi sürekli tek tek her foton kamera tarafından atanan DL bir tahmin temsil ederken, özellikle merkezi ve Gauss fonksiyonunun varyans, sırasıyla, ofset kamera ve hata temsil eder. Matlab malzemeleri destekleyen Script bölümünde "CalibrateCamera" kullanın.
    4. Tüm seçilen Kamera EMGain ve Kazancı için işlemi tekrarlayın.

2. EtiketliHücre Hazırlanması

  1. (1,2-dioleoyl- SN -glisero-3-fosfoetanolamin), lipid dahil 36 için gerekli olan lipozomları hazırlamak DOPE ayrı ayrı olarak 1 mg giderilmesi, DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonyum propan-), 1 mg, ve kloroform, 1 ml PPE ATTO488 1 mg. 24 saat boyunca vakum altında bir araya 0,5 DOPE solüsyonu, DOTAP çözeltiden 0.5 ml ve PPE ATTO488 çözeltisi 25 ul kuru karıştırılır. 40 ° C'de 15 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır ve 15 dakika boyunca 20 mM HEPES tamponu, 0.5 ml, vorteksleyin.
  2. , Hücre hazırlanması PBS ile birleşik CHO-K1 (Çin Hamsteri Yumurtalığı) bir p 100 tabak 3 kez yıkama, 5 dakika boyunca inkübatör içinde tripsin ve mağaza 1 ml ekleyin. % 10 FBS ile desteklenmiş DMEM / F12 ortamında 9 ml ilave müstakil hücrelerin süspansiyonu ve aynı ortamın 800 ul ihtiva eden bir Petri kabındaki hücre çözeltisinin 150 ul tohum.
  3. 37 ° C'de 24 saat boyunca kuluçka makinesi içinde depolayın ve% 5 CO2. Lipid eklenmesi için, 500 hücre orta yerineserumsuz ortam ul; 30 dakika sonra, lipozomlar çözeltisi 2 ul; ve PSB 15 dakika yıkamadan sonra görüntüleme için yeni DMEM / F12 orta ekleyin.
  4. Transfaksiyon için, transfect hücreler görüntüleme önce inkübatör TfR-GFP plazmid ve mağaza 24 saat kullanarak Lipofektamin protokolü (Üretici talimatları) göre.

3. Veri Toplama

  1. Kurulum hazırlığı
    1. Mikroskop termostat amacıyla, deneyden önce 24 saat kuluçka açın.
    2. Hızlı ulaşılabilir edinimi süresi uygulamak amacıyla, Kesilmiş Sensör Modu iş (giriş) ve hücre (kamera 2) seçmek için görüntüleme (kamera 1) ve ikinci kamera için bir ilk kamera kullanmak. Kurulum yapılandırmasına bir şeması Ek Şekil S1 sunulmuştur. Ardından, mikroskop iki kamera dönüşü uyum ve kameralar soğumasını bekleyin.
    3. Iki kamera iletilen ışık görüntüleme parametreleri ayarlamak (yani , Pozlama süresi, EM Kazancı için 1) ve Aydınlık Alan modunda mikroskop koymak için 20 msn.
    4. Sadece (burada 32 x 32 piksel ROI) hücre görüntüleme için kullanılan ROI ışık sağlayan yarıklar hafifçe itin tutucu örnekleri koyun ve mercek kullanarak odak, fotoğraf makinesi 1 ışık göndermek ve.
    5. Seçilen bölgedeki bir hücreyi taşımak ve kamera 2 ışık göndermek, sonra bir başvuru olması için kamerayı 2. kontrol yazılımı bir ROI çizin.
  2. Görüntüleme (Şekil 3A)
    1. Öncelikle, sizin kurulum prosedürüne göre TIRF lazer hizalama. Bizim kurulumunda, 'TIRF kurulum' seçin ve otomatik hizalama işlemini başlatmak. Lazer hizalandığında (yaklaşık 70 °) penetrasyon derinliği 70 nm ayarlayın.
    2. Hem kamera 1 ve kamera 2 100 EMGain 70 msn ve pozlama süresi ayarlayın; Daha sonra, kamera 1 kullanarak bir hücreyi seçin, ardından kamera 2 ışık göndermek ve doğru hücre zarı odaklanın. Ca üzerinde asgari pozu ayarlamakmera 2, 1000 EMGain, Kesilmiş Sensör Modu, 10 5 tekrar ve set kaydetme dosyaları (Esnek Görüntü Nakil Sistemi, kolayca yönetilen bir biçimi) uygun olarak.
    3. Görüntü serilerini kaydetmek için satın alma başlayın. Kazanç ve sonra, yeni bir hücre almadan önce sıcaklık stabilizasyonu sağlamak 8-10 hücrelerini elde etmek için son iki adımları tekrarlayın kırpılmış Modu bırakın.

Imaging'e Mean Square Yerinden 4. Hesaplama (i MSD)

Not: Aşağıdaki protokol, doğrudan ham verilere uygulanabilir. Aynı zamanda, tüm protokol Matlab ve SimFCS hem de simüle edilmiş veri satın alma için de geçerlidir. Gelen öğreticiler için bağlantı 'Malzeme' bölümünde bulunabilir.

  1. Matlab ile Hesaplama
    1. ImportImageSeries script kullanarak Matlab'a edinilen serisi aktarın. Co kullanarak zaman içinde her görüntünün ortalama yoğunluğunu hesaplamakmmand ilk 2 boyutlarına ortalama ve elde edilen vektör görmek için arsa kullanın.
    2. Photobleaching% 10'dan fazla varsa, dizi atmak veya onların ilk kısmını kaldırın. Daha düşük ise, 37 önce gösterildiği gibi, her bir görüntü için ortalama yoğunluğunu çıkarılarak korelasyon fonksiyonu üzerinde etkisini düzeltmek için çalışın.
    3. Üçüncü boyut ortalamasını kullanarak her pikselin ortalama yoğunluğunu hesaplamak ve çıkan görüntü görüyorum.
      NOT: Özellikle dikkat artifaktüel korelasyon önlemek için gereklidir. Aslında, daha önce benzer teknikler 38, hücre sınırları yanı sıra odaklama veziküllerin üzerinden gösterildiği gibi bir güçlü bir korelasyon getirebilir. Ortalama görüntünün muayene hücre sınırları veya odak kesecikler dışında ortaya çıkarsa, aksi takdirde satın atmak dahil bölgeyi dışlamaya çalışıyorlar. Bu hareketsiz yapıların etkisini düzeltmek için her piksele 39 dan ortalama zamansal yoğunluğunu çıkarmak.
    4. T hesaplayınişlevini CalculateSTICScorrfunc kullanarak o zamanmekansal korelasyon (G (ξ, χ, τ)). G (ξ, χ, 0) nedeniyle, düşük ışık rejimi atış gürültü korelasyon G hakim çünkü (0,0,0) sökün; nedeniyle detektöre korelasyon ölçülen bel artırarak τ = 0 g (ξ, χ, τ) deforme olabilir, bu süre boyunca G (± 1,0,0), ve parçacık hareketi hakimdir (bu etki, τ kaybolur > 0) 34.
    5. Daha sonra Malzeme desteklenmesinde "LogBinStack" fonksiyonunu kullanarak gürültüyü azaltmak ve bir logaritmik zaman-bin kullanılarak Ortalama G (ξ, χ, τ> 0) (ξ, χ, τ) fonksiyonu kullanılarak "gaussfit doğan" G sığdırmak Malzemelerinde ICS-Matlab araçları i MSD (çıkan dizinin ikinci sütun) kurtarmak için.
    6. Zamanın bir fonksiyonu olarak elde edilen bel σ (τ) 2, (i MSD) çizilir. Veri çok gürültülü ise, Edinim sayısını artırmak için çalışınIRED çerçeveler, birlikte lazer gücünü, ortalama daha fazla G (ξ, χ, τ) artırmak.
  2. SimFCS tarafından Hesaplama
    1. ImageJ BioFormat ithalatçı eklentisi kullanarak edinilen dosyalarını açın ve TIFF dizisi olarak iktisap dizi kaydedebilirsiniz.
    2. Aç SimFCS seçin RICS aracı seçin ve Dosya> İçe Çoklu Görüntüler (Ek Şekil S2).
    3. Uygun pencereyi (Ek Şekil S3), Fit seçin doğru toplama parametreleri yerleştirin ve kapatın.
    4. Ekran> Ortalama Yoğunluk> CH1 seçin ve photobleaching varlığını (Ek Şekil S4) doğrulayın.
    5. Photobleaching% 10'dan fazla mevcut ATIN serisi ise veya mümkün tekrar yük serisinin ilk bölümünü kaldırarak görüntü dizisi ise.
    6. Ağartılması daha düşük% 10 Araçlar> Eğer i MSD> Set Parametreleri, sol bir on ROI panelinde set, 'kullan hareketli ortalama' kontrolmuhabir zaman karakteristik difüzyon zaman daha yüksek olduğunu hareketli ortalama ödeme İlginiz için çerçeve koyu kahverengi (1 mikron 2 sn hareketli parçacık için -1 10 saniyelik bir zaman iyi bir hareketli ortalama)
    7. Araçlar> iMSD> i MSD (Ek Şekil S5) ve zinde hesaplayın ve bloknot gelen i MSD ihracat (Ek Şekil S6).

I MSD gelen Difüzyon Kanunu 5. Hesaplama

  1. Kesişim (σ 0 2) hesaplamak için ilk birkaç puan Fit (5 puan genelde yeterli olur ama daha fazla puan onlar doğrusal bir davranış gösterir eğer takılabilir) ve daha önce ölçülen PSF 2 ile bu değeri karşılaştırın. Onlar karşılaştırılabilir iseniz, izole Flüoroforlann dinamikleri takip edilmektedir. Buna karşılık, σ 0 2 >> PSF 2 denemek sağlamak için daha hızlı elde etmek için isehiçbir gizli dinamikleri 34 mevcuttur.
  2. Belirgin yayılımını (D app) denklem ve 3 ve 4 (bkz) kullanılarak, ortalama yer değiştirme (R) hesaplayın.
  3. 12 FCS (Şekil 3D) göre yer değişimi ölçülür ile karşılaştırılabilir bir difüzyon kanunu elde etmek üzere Rl bir fonksiyonu olarak Arsa M app.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol aşama 1.1 'de tarif edildiği gibi etkili bel kalibre etmek için, tek bir floresan nano boncuk görüntü ölçü olabilir. Bu tür boncukların tipik floresan görüntü, Şekil 1 'de sunulmuştur. 2B Gauss fonksiyonuyla yoğunluğu dağılımının uygun olarak geri artıkları verir ve 270 nm'de ölçülmesi etkili bel verir. Bu değer Rayleigh denklemi tahmin beklenen kırılma sınırı ile iyi bir anlaşma olduğunu. Bu kalibrasyon parçacık dinamiği ölçümü için gerekli değildir, ancak bu durum, görünür parçacık boyutunu ö...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek parçacık izleme (SPT) moleküler dinamiklerini incelemek için en yaygın stratejilerden birini temsil ve parçacık yörüngeleri ölçüm büyük bir avantaja sahiptir. Bu da karmaşık bir sistemde bile birkaç etiketli parçacıkların davranışlarını sondalama sağlar. Bununla birlikte, tipik haliyle SPT sistemi ve çok parlak bir etiket düşük yoğunluklu ihtiyacı bu avantajı ulaşmak için. Sisteme, üretim, etiketleme ve yerleştirme karmaşık bir prosedür gerekli bu durumda: Özellikle, yüksek temporal çözünürlük (mikro saniye olduğu a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen NIH-P41 P41-RRO3155 ve NIH P50-GM076516 (EG'ye hibe) ve Fondazione Monte dei Paschi di Siena (FB'ye hibe) tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
iXon Ultra 897AndorDU-897U-CS0
SolisAndor
CHO-K1ATCCCCL-61
ATTO 488 etiketli PPEATTO-TEC GmbHAD 488-151
DOPEAvanti Polar Lipids, Inc.
DOTAPAvanti Polar Lipidler, Inc.890890
100x Penisilin-Streptomisin-GlutaminGibco10378-016
DMEM/F-12Gibco21331
FBSGibco10082147
HEPESGibco15630-106 
PBSGibco10010-023
SimFCS 3.0Globals YazılımıYazılım buradan indirilebilir: http://www.lfd.uci.edu/globals/
DMI6000 TIRF modülü ileLeica
LAS AFLeica
Lipofectamine 2000Lipofectamine11668019
MatlabMathWork
ImageJNIH
[header]
C-terminal GFP etiketli Tranferrin ReseptörüOriGeneRG200980
AgarSigma AldrichA5306
ChloroformSigma Aldrich528730
Lateks boncuklar, floresan sarı-yeşil, 30 nmSigma AldrichL5155
SONICA Ultrasonik TemizleyicilerSOLTECETH S3
Petri KaplarıWillcoGWSt-3522
http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/
için Biyo-Format ithalatçısıhttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip
Matlab Eğitimi
Simülasyon https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html SimFCS Eğitimi ile Simülasyonhttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt
850725Matlab ICS-MatLab Araçları ile

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  2. Vereb, G., et al. yet structured: The cell membrane three decades after the Singer-Nicolson model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (14), 8053-8058 (1073).
  3. Ishihara, A., Hou, Y., Jacobson, K. The Thy-1 antigen exhibits rapid lateral diffusion in the plasma membrane of rodent lymphoid cells and fibroblasts. 84 (5), 1290-1293 (1987).
  4. Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73 (12), 4594-4598 (1976).
  5. Jacobson, K., Derzko, Z., Wu, E. S., Hou, Y., Poste, G. Measurement of the lateral mobility of cell surface components in single, living cells by fluorescence recovery after photobleaching. J. Supramol. Struct. 5 (4), 10-1002 (1976).
  6. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34, 351-378 (2005).
  7. Kusumi, A., Ike, H., Nakada, C., Murase, K., Fujiwara, T. Single-molecule tracking of membrane molecules: plasma membrane compartmentalization and dynamic assembly of raft-philic signaling molecules. Semin. Immunol. 17 (1), 3-21 (2005).
  8. Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36, 176-182 (1999).
  9. Gielen, E., et al. Diffusion of sphingomyelin and myelin oligodendrocyte glycoprotein in the membrane of OLN-93 oligodendroglial cells studied by fluorescence correlation spectroscopy. C. R. Biol. 328 (12), 1057-1064 (2005).
  10. Weiss, M., Hashimoto, H., Nilsson, T. Anomalous protein diffusion in living cells as seen by fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 84, 4043-4052 (2003).
  11. Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization. Biophys. J. 89 (6), 4029-4042 (2005).
  12. Lenne, P. F., et al. Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork. EMBO J. 25 (14), 3245-3256 (2006).
  13. Ries, J., Schwille, P. Studying slow membrane dynamics with continuous wave scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 91 (5), 1915-1924 (2006).
  14. Ruan, Q., Cheng, M. A., Levi, M., Gratton, E., Mantulin, W. W. Spatial-temporal studies of membrane dynamics: scanning fluorescence correlation spectroscopy (SFCS). Biophys. J. 87 (2), 1260-1267 (2004).
  15. Berland, K. M., So, P. T., Chen, Y., Mantulin, W. W., Gratton, E. Scanning two-photon fluctuation correlation spectroscopy: particle counting measurements for detection of molecular aggregation. Biophys. J. 71, 410-420 (1996).
  16. Heinemann, F., Betaneli, V., Thomas, F. A., Schwille, P. Quantifying lipid diffusion by fluorescence correlation spectroscopy: a critical treatise. Langmuir. 28 (37), 13395-13404 (2012).
  17. Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (25), 9863-9868 (2012).
  18. Sanchez, S. A., Tricerri, M. A., Gratton, E. Laurdan generalized polarization fluctuations measures membrane packing micro-heterogeneity in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (19), 7314-7319 (2012).
  19. Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy of intact nuclear pore complexes. Biophys. J. 101 (4), 27-29 (2012).
  20. Di Rienzo, C., et al. Unveiling LOX-1 receptor interplay with nanotopography: mechanotransduction and atherosclerosis onset. Sci. Rep. 3, 10-1038 (2013).
  21. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophys. J. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  22. Kannan, B., et al. Electron multiplying charge-coupled device camera based fluorescence correlation spectroscopy. Anal. Chem. 78 (10), 3444-3451 (2006).
  23. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-508 (2011).
  24. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. 3 (10), 793-795 (2006).
  25. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  26. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  27. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  28. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  29. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).
  30. Eggeling, C., et al. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457 (7233), 1159-1162 (2009).
  31. Hedde, P. N., et al. Stimulated emission depletion-based raster image correlation spectroscopy reveals biomolecular dynamics in live cells. Nat. Commun. 4, Forthcoming.
  32. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88 (5), 3601-3614 (2005).
  33. Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. J. Cell Sci. 119, 5204-5214 (2006).
  34. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Fast spatiotemporal correlation spectroscopy to determine protein lateral diffusion laws in live cell membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (30), 12307-12312 (2013).
  35. Mueller, V., et al. STED nanoscopy reveals molecular details of cholesterol- and cytoskeleton-modulated lipid interactions in living cells. Biophys. J. 101 (7), 1651-1660 (2011).
  36. Kleusch, C., Hersch, N., Hoffmann, B., Merkel, R., Csiszar, A. Fluorescent lipids: functional parts of fusogenic liposomes and tools for cell membrane labeling and visualization. Molecules. 17 (1), 1055-1073 (2012).
  37. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophys. J. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  38. Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49 (3), 141-164 (2007).
  39. Digman, M. A., et al. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89 (2), 1317-1327 (2005).
  40. Ritchie, K., et al. Detection of non-Brownian diffusion in the cell membrane in single molecule tracking. Biophys. J. 88 (3), 2266-2277 (2005).
  41. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170, 229-236 (1993).
  42. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  43. Wohland, T., Shi, X., Sankaran, J., Stelzer, E. H. Single plane illumination fluorescence correlation spectroscopy (SPIM-FCS) probes inhomogeneous three-dimensional environments. Opt. Express. 18 (10), 10627-10641 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Toplam Yans mal Floresan MikroskopiNokta Yay l m Fonksiyonu KalibrasyonuFloresan Boncuk G r nt lemeUzay zamansal OtokorelasyonOrtalama Kare Yer De i tirmeG r n r Dif zyon Katsay sGFP etiketli Transferrin Resept r

İlgili makaleler