Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

9.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52023

⸱

23 Ekim 2014

Bu makalede

Özet

Iskemik beyin hasarı birçok açıdan üreyen veriyor entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri için bir protokol, sunulmuştur. Nöronlarda değişikliklere ek olarak neurovasculature değişiklikleri inceleyerek, bu protokol yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araçtır.

Özet

İskemik beyin hasarı uygun beyin işlevini kaybetmesine en yaygın ve yıkıcı koşullar arasında ve genellikle etkilenen hastalarda fonksiyon kaybı devam eden yol açar. Yoğun araştırmalara rağmen, halen nöronal hasarı azaltır ve geciktirilmiş ikinci ölüm iskemik alanlarda nöronları korur hiçbir etkili bir tedavi seçeneği yoktur. Bu alanda yapılan araştırmalar, tipik olarak karmaşık ve sorunlu hayvan modellerinin kullanımını içerir. Oksijen ve glikoz mahrumiyet (OGD) ile meydan Entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri serebral iskemi taklit in vitro modellerinde kurulmuştur. Bu çalışmada yeni veçhesi, beyin kan damarları ile karşılaştırılır değişiklikler korele edilebilir, nöronal ve nöronal değişiklikler bölmesi ve vasküler bölmesinin her iki reaksiyona ek olarak incelenmiştir olmasıdır. Bu protokol sunulan yöntemler ölçüde potansiyel uygulamalarını genişletmek veyaganotypic dilim kültür yaklaşım. OGD'ye ya da tek başına Hypoxia organotipik kesit kültürlerinde oldukça basit bir yöntem ile uygulanabilir ve nöronal dokuda, güvenilir ve tekrarlanabilir bir hasara neden olabilir. Bu in vivo inme ve iskemi teşvik karmaşık ve sorunlu hayvan deneylerinde tezat olduğunu. Analizini genişleterek korumak ve beyin fonksiyonlarını geri nasıl yeni yollar sağlayabilir damar reaksiyonu çalışma dahil. Burada sunulan dilim kültür yaklaşımı iskemik beyin hasarının çalışma için cazip ve önemli bir araç haline olabilir ve nöro yönelik potansiyel terapötik önlemlerin test edilmesi için yararlı olabilir.

Giriş

Merkezi sinir sistemi, damar ile kayıp ya da oksijen ve glükoz stokunda azaltılmasına özellikle duyarlıdır. Beyne kan sağlayan bile çok kısa bir kesinti tipik inme sendromu yol, ilgili beyin alanlarında fonksiyonunun bir şekilde kaybolmasına neden olabilir. Birincil etkilenen bölgelerde nöron kaybına ek olarak, tipik olarak ikincil zararlar yoluyla ek geciktirilmiş nöron kaybı bulunmaktadır. Ne yazık ki, şu ana kadar ikincil nöronal ölümün azaltılması için bir nöro-koruyucu bir tedavi 1 kullanılabilir. Ikincil hasar mekanizmalarının incelenmesi için gösterilen araştırma çabaları arasında orta serebral arter oklüzyonu ve çeşitli trombotik oklüzyon teknikler....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan deneyleri 22 Eylül 2010 tarihli Avrupa Toplulukları Konsey Direktifine uygun olarak yürütülmüştür (2010/63 / AB) ve gözden ve İsviçreli yetkililer tarafından izin verildi.

1. Organotipik Entorhino-hipokampal Dilim Kültürler kurma

  1. Statik kuluçka yöntemi 4,11 kullanarak doğum sonrası güne 4 (P4) fare yavrularından entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri (EHOSCs) hazırlayın. Burada, C57Bl6 ve CB6F1 fareler kullanır.
    1. Örneğin dilim kültürlerinin hazırlanması için yavru fare başına yaklaşık olarak 30 dakika, 6 fare yavrular bir çöp 3 saat al. Steril cerrahi aletler ile bir laminer akış te....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Oksijen glikoz yoksunluğu ve hipoksi hipokampal CA1 bölgesinde özellikle nöronal ölüm ve kan damarı azalmaya neden.
Daha önce tarif edildiği gibi, 7 'e benzer hipokampus (Şekil 3) CA1 bölgesinde spesifik olarak, propidyum iyodür boyaması yolu ile görüldüğü gibi OGD, veya oksijen-yoksunluk sadece 15 dakika boyunca hücre ölümünün kuvvetli bir uyarımının neden olmuştur. Belirteçler kan damarlarının ağ görselleştirmek ile, damar yoğunluğu ve kurum CA1 bölgesinde hariç kültür çoğu bö.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan yöntemleri ile, hipokampal organotipik dilim kültürleri yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araç olarak kullanılabilir. Organotipik kültürler dilim damar değişikliklerinin eş zamanlı çalışma yeni özelliğine 7, iskemi 6 nöronal reaksiyonların araştırılması için geçmişte kullanılan olsa da önemli ölçüde bu yöntemin potansiyel uygulamaları artırır. OGD'ye ya da tek başına Hypoxia organotipik kesit kültürlerinde oldukça basit bir yöntem .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Hayvan deneyleri 24 Kasım 1986 (86/609 / EEC) Avrupa Toplulukları Konsey Direktifine uygun olarak yürütülmüştür ve İsviçreli yetkililer tarafından yorumlanan ve izin verildi. Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Basel Üniversitesi, Biyomedikal Bölümü ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_141007) tarafından desteklenmiştir. Markus Saxer teknik destek sağladı.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Minimum Esansiyel Orta MEMGibco11012-044
GlutamaxGibco35050-061stabilize edilmiş L-glutamin formu
Millicell hücre kültürü ekleriMillipore PICM03050
Bazal ortam Eagle Gibco41010-026
At serumuGibco26050-088
Nörobazal ortamGibco21103-049
B27 takviyesiGibco17504-044
Anaerobik şeritlerSigma-Aldrich59886
Propidium iyodür çözeltisiSigma-AldrichP4864
AMPAR& D sistemleri0169-10
CNQXAr-Ge D sistemleri0190/10
TTXAr-Ge D sistemleri1078/1
poliklonal anti-lamininSigma-AldrichL9393 & nbsp;
anti-MAP2Abcamab11267
Alexa anti-fare 350Moleküler ProblarA11045
Alexa anti-fare 488Moleküler ProblarA11001
Alexa anti-tavşan 350Moleküler ProblarA11046
Alexa anti-tavşan 488Moleküler ProblarA11008
İstatistik yazılımıGraphPad YazılımıGraphPad Prizma
McIlwain doku kıyıcıTed Pella10180
Hipoksi odasıBillups-RothenbergMIC-101

Kaynaklar

  1. Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
  2. Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Entorhino-hippocampal Dilim KültürleriOksijen Glikoz YoksunluğuNöronal Sağkalım AnaliziVasküler Değişim AnaliziKonfokal MikroskopiPropidyum İyodür BoyamasıLaminin İmmünohistokimyasıHipoksi OdasıOrganotipik Dilim Kültürü