Iskemik beyin hasarı birçok açıdan üreyen veriyor entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri için bir protokol, sunulmuştur. Nöronlarda değişikliklere ek olarak neurovasculature değişiklikleri inceleyerek, bu protokol yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araçtır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler
Bu makalede
Özet
Özet
İskemik beyin hasarı uygun beyin işlevini kaybetmesine en yaygın ve yıkıcı koşullar arasında ve genellikle etkilenen hastalarda fonksiyon kaybı devam eden yol açar. Yoğun araştırmalara rağmen, halen nöronal hasarı azaltır ve geciktirilmiş ikinci ölüm iskemik alanlarda nöronları korur hiçbir etkili bir tedavi seçeneği yoktur. Bu alanda yapılan araştırmalar, tipik olarak karmaşık ve sorunlu hayvan modellerinin kullanımını içerir. Oksijen ve glikoz mahrumiyet (OGD) ile meydan Entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri serebral iskemi taklit in vitro modellerinde kurulmuştur. Bu çalışmada yeni veçhesi, beyin kan damarları ile karşılaştırılır değişiklikler korele edilebilir, nöronal ve nöronal değişiklikler bölmesi ve vasküler bölmesinin her iki reaksiyona ek olarak incelenmiştir olmasıdır. Bu protokol sunulan yöntemler ölçüde potansiyel uygulamalarını genişletmek veyaganotypic dilim kültür yaklaşım. OGD'ye ya da tek başına Hypoxia organotipik kesit kültürlerinde oldukça basit bir yöntem ile uygulanabilir ve nöronal dokuda, güvenilir ve tekrarlanabilir bir hasara neden olabilir. Bu in vivo inme ve iskemi teşvik karmaşık ve sorunlu hayvan deneylerinde tezat olduğunu. Analizini genişleterek korumak ve beyin fonksiyonlarını geri nasıl yeni yollar sağlayabilir damar reaksiyonu çalışma dahil. Burada sunulan dilim kültür yaklaşımı iskemik beyin hasarının çalışma için cazip ve önemli bir araç haline olabilir ve nöro yönelik potansiyel terapötik önlemlerin test edilmesi için yararlı olabilir.
Giriş
Merkezi sinir sistemi, damar ile kayıp ya da oksijen ve glükoz stokunda azaltılmasına özellikle duyarlıdır. Beyne kan sağlayan bile çok kısa bir kesinti tipik inme sendromu yol, ilgili beyin alanlarında fonksiyonunun bir şekilde kaybolmasına neden olabilir. Birincil etkilenen bölgelerde nöron kaybına ek olarak, tipik olarak ikincil zararlar yoluyla ek geciktirilmiş nöron kaybı bulunmaktadır. Ne yazık ki, şu ana kadar ikincil nöronal ölümün azaltılması için bir nöro-koruyucu bir tedavi 1 kullanılabilir. Ikincil hasar mekanizmalarının incelenmesi için gösterilen araştırma çabaları arasında orta serebral arter oklüzyonu ve çeşitli trombotik oklüzyon teknikleri gibi serebral iskemi ile ilgili deneysel modellerinin kullanımına dayalı (güncel bir değerlendirme için bakınız 2). Buna paralel olarak,, aynı zamanda, sınırlama ve hayvan modellerinde, çeşitli merkezi sinir sistemi dokuların Organotipik kesit kültürünün kullanımı ile etik kaygılar Stu izin veren kullanılmıştıryaralanma 3-5 çeşitli tip nöronal reaksiyonların dy.
Iskemik beyin yaralanmasının taklit koşullarda nöronal reaksiyonun incelenmesi için, oksijen glikoz yoksunluğu model sistem (OGD) geliştirilmiştir. Bu modelde, dilim kültürler geçici olarak glikoz yoksun ve oksijenin yokluğunda azot gazı ile dengeye getirilmiş olan bir ortama maruz bırakılır. Bu tür bir işlem ile, in vivo 6, 7 iskemik yaralanma sonrası gözlenen ile oldukça benzer nöronal yaralanma ve kaybını uyarmak mümkündür. Hipokampta, böyle bir tedavi olarak, özellikle CA1 nöronal kaybı uyarmaktadır ama CA3 alan veya hipokampus dentat girus. Bunun aksine, kesit kültürlerinde vasküler reaksiyonların Bu güne kadar geniş ele edilmemiştir. Bir belirgin bir neden dilim kültürü modelinde dolaşım ve kan damarı perfüzyon olmamasıdır. Bununla birlikte, bu B korumak mümkün olduğunu göstermiştikMSS lood gemiler 9, birkaç gün 8 kültürleri dilim.
Bu yöntemin genel amacı OGD'ye sonra nöronların kaderi izlemek, ancak yaralanma yanıtın önemli bir parçası olan damar kaderi ve biçimlenme çalışma genişletmek için değil sadece. Şimdiye kadar bu tür çalışmalar, hayvan deneylerinde kullanımını gerektirmiştir (. De Jong ve arkadaşları, 1999; Cavaglia ve diğerleri, 2001.). Protokol Burada yer olarak, bu tür çalışmalar, hipoksi ile birlikte ya da her ikisi nöronal hayatta kalma ve damar reaksiyonlarının analizi ile takip eksitotoksik lezyonlar ya meydan entorhino-hipokampal kesit kültürlerinde Organotipik detay yapılabilir nasıl. Bu protokol, bu konuda 10 önceden yayımlanan bir çalışmada dayanmaktadır ve MSS nörovasküler etkileşimleri ilgilenen herhangi bir laboratuvar için yararlı olabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan deneyleri 22 Eylül 2010 tarihli Avrupa Toplulukları Konsey Direktifine uygun olarak yürütülmüştür (2010/63 / AB) ve gözden ve İsviçreli yetkililer tarafından izin verildi.
1. Organotipik Entorhino-hipokampal Dilim Kültürler kurma
- Statik kuluçka yöntemi 4,11 kullanarak doğum sonrası güne 4 (P4) fare yavrularından entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri (EHOSCs) hazırlayın. Burada, C57Bl6 ve CB6F1 fareler kullanır.
- Örneğin dilim kültürlerinin hazırlanması için yavru fare başına yaklaşık olarak 30 dakika, 6 fare yavrular bir çöp 3 saat al. Steril cerrahi aletler ile bir laminer akış tezgah steril koşullar altında tüm adımları uygulayın.
- Septorinoplastiyi zamansal ekseni boyunca dilimin konumundan muhtemel müdahaleyi önlemek için, yalnızca hipokampal septal yarısı dilim kullanır. Aksi belirtilmediği sürece, oda sıcaklığında tüm adımları gerçekleştirmek.
- T kestiO cerrahi makas ile bir P4 fare yavru kafa. Resim anestezi Bu aşama için gereklidir.
- Beyin çevresinde kafatası çıkarın ve hemisferdeki ve orta beyinin kaudal ucu arasındaki fissür tespit. Dikkatle kafatasından orta beyin beynin rostral bir kısmını çıkarmak ve L-glutamin, stabilize edilmiş bir formu ile takviye edilmiş MEM oluşan buzla soğutulmuş Müstahzar ortamda yerleştirin.
- Beyin, buz gibi hazırlama ortamına daldırılmış edilir bir stereo mikroskop altında diseksiyon devam edin. Kortikal hemisferden kalan meninks çıkarın. Yarımkürenin orta kaudal yüzeyinde hipokampus belirlenmesi ve beynin geri kalanından komşu entorhinal korteks ile birlikte ayırın.
- Bir doku helikoptere doku aktarın ve hipokampus septorinoplastiyi-zamansal eksene aseptik koşullar altında çaprazlama 400 mikron kalınlığında dilimler kesilir.
- Ce üzerinde dilimlerini yerleştirinll kültür ekleri (yaklaşık 6 uç başına dilim) ve inkübasyon ortamının (47 mi, MEM, 25 mi Eagle Medium, oyuk başına 1 mi, 25 mi at serumu, bir 1 ml Glutamax I, 1 ml 'si ile 6-yuvalı plakalar içinde inkübe bunları 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde ve steril% 10 glükoz çözeltisi, pH 7.3). Konusu orta ertesi gün ve 1 hafta sonra her gün yukarı değiştirin.
REPERFÜZYONUNDA Vitro Hipokside 2. ve Oksijen-glukoz Yoksunluk
- Prosedürün tam bir zaman çizelgesi için Tablo 1'e bakınız. Hipoksi ve OGD'ye maruz bırakılmadan önce 5 gün boyunca (DIV5) için kültür EHOSCs. Bu zaman noktasında, aşağıdaki bileşim ile serum içermeyen ortam,% 25 at serumu ihtiva eden inkübasyon ortamından orta geçiş: Neuro temelli vasat% 2 B27 takviyesi,% 1 Glutamax ve ilave% 0.1 glukoz ile birlikte.
- Referans 7 bileşenlerin .The son konsantrasyonları ayrıntılı olarak aşağıdaki gibi olacaktır OGD ortamı hazırlayın: 0.3mM CaCl2, 70 mM NaCI, 5.25 mM NaHCO 3, 70 mM KCI, pH 6.8, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM MgSO 4 ve 10 mM sukroz. Iki adet 6 oyuklu doku kültür plakalarının her bir oyuğuna OGD, ortamın 1 ml ilave edilir.
- Hipoksi bir odasında 1 saat süreyle N2 ile OGD, orta serpmek ve daha sonra sızdırmaz hale getirir ve tutmak O / 37 ° C'de bir kuluçka K.
- Hipoksik göstergeleri olarak anaerobik şeritler kullanın. Şeritlerin rengi beyaz pembeden değiştirildiğinde oksijensiz ortama düşünün.
- Hypoxia, yerine OGD, ortamın glikoz ile serumsuz ortamı kullanmaktadır. Kullanmadan önce, OGD, orta kısmında anlatıldığı şekilde bir bölme hipoksi halinde N2 ile orta serpmek.
- Dilimleri OGD'ye maruz kalan önce, 30 dakika süreyle N2 ile tekrar orta OGD, serpmek. 1 mg / ml propidyum iyodür (PI), 30 dakika boyunca dilimlerine (2 ug / ml 'lik son bir konsantrasyon için) oyuk başına çözeltisi ve seçmek, 2 uldeney için, sadece sağlıklı dilim PI pozitif hücrelerin düşük sayılar ile gösterildiği gibi.
- . OGD maruz kalma ve reperfüzyon Şekil 1'de gösterildiği zamanlamasını kullanın 15 dakika boyunca ya oksijen sadece (hipoksi) veya oksijen ve glikoz (OGD) dilimleri mahrum.
- Hipoksi ve OGD'ye indüksiyonu için OGD ortamına dilim aktarmak ve hipoksi odası içinde 15 dakika için tutun. Kültürler, orta ve arka OGD düzenli ortamından açıldığında, insertin iki tarafında kalan tüm sıvı aspire emin olun.
- Hipoksi ve OGD'ye sonra, oksijenli serum barındırmayan ortam maddesi ile OGD, orta yerine ve kültürler,% 5 CO2 ile 37 ° C 'de normal inkübatörde serum barındırmayan ortam içinde 3, 24 veya 48 saat süre ile iyileşmelerine izin verilir. Hücre ölümü tespiti için tespit için önce yeniden PI ekleyin.
Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler 3. Farmakolojik Tedaviler
- Kültürfarmakolojik tedavilere maruz bırakılmadan önce, kuluçkalama ortamı içinde 5 gün (DIV5) e EHOSCs. Farmakolojik tedaviler sırasında veya hemen OGD'ye dilim serumsuz ortama transfer zaman sonra OGD, ya başlatın.
- OGD'ye koruması için Tedaviler.
- OGD, 30 dakika boyunca, indüksiyondan sonra hemen 100 uM 6-siyano-7-nitrokuinoksalin-2,3-dion (CNQX) ya da (15 dk) OGD, indüksiyon sırasında kültür ortamına 1 uM Tetrodotoksin (TTX) veya ekleyin. Daha sonra, tespitten önce, 48 saat boyunca normoksik, serum barındırmayan ortam içinde inkübe edilir.
- Eksitotoksik ölüme indüksiyonu için tedaviler.
- Kuluçka ortamı anahtar kültürlerinde 5 gün sonra, 30 dakika boyunca 100 uM, (RS) -α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) içeren içermeyen ortam serum.
- Aspirasyon (ekler üzerinde herhangi bir kalıntı orta kaldırmak için özen) tarafından AMPA içeren kültür ortamı çıkarın, sonra da normal serum serbest orta ve taze plakaları dilim aktarmakfiksasyon kadar 48 saat boyunca saklayın.
4. Fiksasyon ve immün Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler
- Propidium iyodür (PI) boyama.
- 2 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda canlı dilimlerin kültür ortamına PI, 30 dakika boyunca ilave edin. Floresan optik ile donatılan bir ters mikroskop ile canlı kültürler el ve daha fazla tedavi için dilim seçmek. Immünhistokimya ile birlikte PI boyama için, önce kültürlerin tespit PI boňaltılması 30 dakika ekleyin.
- Dilimleri Fiksasyon.
- 6-delikli plaka kültür Ortamı çıkarın ve her bir oyuğa taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit (PFA), 3 ml ekleyin. Daha sonra, bir buzdolabı içinde 6 oyuklu plaka yerleştirilir ve 4 ° C'de O / N düzeltin.
- PFA çözüme ertesi gün çıkarın ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile dilimleri 3-4 kez yıkayın.
- Hücre kültürü i ikinci dilim uzaklaştırılmasınsert ve serbest yüzen bölümlerinin imünohistokimya için engelleme prosedürü.
- Dikkatlice ayırın ve boyutu 0 veya daha küçük bir sanat boya fırçası kullanılarak kültürü ekler gelen dilim çıkarın. (% 3 normal keçi serumu (NGS) ve 2% Triton-X100 ile PBS) ile bloke edici tampon ile doldurulmuş bir 96 gözenekli plakanın bir kuyuya her bir dilim aktarın. Orbital bir karıştırıcı ile sabit çalkalama altında, oda sıcaklığında 2 saat için bloke edici tampon dilimleri tutun.
- Dilim kültürlerin immün
- Etiketleme için kan damarları 1 bir seyreltme poliklonal anti-laminin kullanın: 200 PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 ihtiva eden.
- PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 içeren 500: etiketleme nöronlar 1 bir seyreltme proteini 2 (MAP2) ilgili anti-mikrotübül kullanın.
- Sürekli çalkalama ile 4 ° C'de 48 saat için primer antikorlar ile inkübe dilimleri. İnkübasyon süresinden sonra, 3-4 kez,% 0.5 Triton-X100 ile PBS ile yıkayın.
- İkincil antikorlar 1 seyreltin: 500 PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 ihtiva eden. Alexa fluorofor konjüge sekonder antikor ile karanlıkta, oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe dilimleri. Alexa 350 veya 488 konjuge uygun keçi anti-tavşan veya keçi anti-fare ikincil antikoru kullanın.
- Ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve Tris-tamponlu tuzlu su (TBS) ile dilimleri üç defa yıkamak; cam slaytlar takar ve Mowiol ile slaytlar lamel.
- Lekelenmiş dilimlerin Mikroskopi
- Epifloresans donanımları ile standart bir mikroskop veya bir konfokal mikroskop ile ya lekeli dilimleri gör. Uygun bir kamera ile çektiğiniz görüntüleri. Bazı görüntüler için, parlak arka planda koyu renkte boyalı gemileri elde etmek için floresan kontrast (Şekil 5 ve 6) ters çevirin.
Kültürlerin Bölgesel Gemi Yoğunluk 5. Belirlenmesi
- Vesse niceliğiniReferans 8'de tarif edildiği gibi kap geçişleri göre L. yoğunluğu.
- Bu ölçümler için laminin lekeli dilimleri kullanın. Her grid kare başına 100 x 100 mikron, 0.25 mm 2 toplam alanına eşit bir 6 x 6 ızgara ile 10X büyütme Kayıtlı görüntüleri üst üste.
- CA1, CA3, DG ve AK bölgede bindirme böyle üç ızgaraları (Şekil 2). Izgara çizgileri geçen gemileri saymak.
- İyi bir istatistik alaka ile sonuç elde etmek için, fare yavru başına 3 dilim ile 3 fare yavrular, en az 3 bağımsız deneyde dahil her veri ölçümlerini yapmak.
- Her bölge için ızgaralardan damar geçişlerinin ortalama değerini belirler ve uygun istatistik yazılımı kullanılarak (anlamlı olarak tanımlanan p <0.05) post hoc test olarak Bonferroni düzeltmeli ANOVA ile istatistiksel analiz yapmak.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Oksijen glikoz yoksunluğu ve hipoksi hipokampal CA1 bölgesinde özellikle nöronal ölüm ve kan damarı azalmaya neden.
Daha önce tarif edildiği gibi, 7 'e benzer hipokampus (Şekil 3) CA1 bölgesinde spesifik olarak, propidyum iyodür boyaması yolu ile görüldüğü gibi OGD, veya oksijen-yoksunluk sadece 15 dakika boyunca hücre ölümünün kuvvetli bir uyarımının neden olmuştur. Belirteçler kan damarlarının ağ görselleştirmek ile, damar yoğunluğu ve kurum CA1 bölgesinde hariç kültür çoğu bö...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan yöntemleri ile, hipokampal organotipik dilim kültürleri yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araç olarak kullanılabilir. Organotipik kültürler dilim damar değişikliklerinin eş zamanlı çalışma yeni özelliğine 7, iskemi 6 nöronal reaksiyonların araştırılması için geçmişte kullanılan olsa da önemli ölçüde bu yöntemin potansiyel uygulamaları artırır. OGD'ye ya da tek başına Hypoxia organotipik kesit kültürlerinde oldukça basit bir yöntem ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hayvan deneyleri 24 Kasım 1986 (86/609 / EEC) Avrupa Toplulukları Konsey Direktifine uygun olarak yürütülmüştür ve İsviçreli yetkililer tarafından yorumlanan ve izin verildi. Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Basel Üniversitesi, Biyomedikal Bölümü ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_141007) tarafından desteklenmiştir. Markus Saxer teknik destek sağladı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Minimum Esansiyel Orta MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilize edilmiş L-glutamin formu |
| Millicell hücre kültürü ekleri | Millipore PICM03050 | ||
| Bazal ortam Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| At serumu | Gibco | 26050-088 | |
| Nörobazal ortam | Gibco | 21103-049 | |
| B27 takviyesi | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobik şeritler | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iyodür çözeltisi | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R& D sistemleri | 0169-10 | |
| CNQX | Ar-Ge D sistemleri | 0190/10 | |
| TTX | Ar-Ge D sistemleri | 1078/1 | |
| poliklonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 & nbsp; | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti-fare 350 | Moleküler Problar | A11045 | |
| Alexa anti-fare 488 | Moleküler Problar | A11001 | |
| Alexa anti-tavşan 350 | Moleküler Problar | A11046 | |
| Alexa anti-tavşan 488 | Moleküler Problar | A11008 | |
| İstatistik yazılımı | GraphPad Yazılımı | GraphPad Prizma | |
| McIlwain doku kıyıcı | Ted Pella | 10180 | |
| Hipoksi odası | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
Kaynaklar
- Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
- Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia. Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).
- Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors. Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).
- Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase. C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).
- Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).
- Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier. J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).
- Camenzind, R. S., et al. Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier. Neuroscience. 170, 361-371 (2010).
- De Jong, G. I., et al. Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment. Neuroscience. 91, 203-210 (1999).
- Cavaglia, M., et al. Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia. Brain Res. 910, 81-93 (2001).
- Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
