Kantitatif İmmünofloresan Deneyi sentrozomlar Protein Düzeyleri Varyasyon Tedbir

Sentrozom pericentriolar malzeme (PCM) 'çevrili Sentriyoller bir çift oluşur. Memeli hücrelerinde büyük mikrotübül organize merkezleri (MTOCs) olmak, sentrozomlar bölünen hücrelerde mitotik iğ iki kutup olarak hizmet, ve böylece genomik bütünlüğünü ¹ korumamıza yardımcı olur. (G0 aşamasında örneğin) hareketsiz hücrelerde, sentrozom, yani ana sentriolden iki Sentriyoller biri, primer kirpik, hücre yüzeyi ² dışarı doğru çıkıntı yapan bir duyusal organel birleştirmek için bir taban gövdesi içine transforme edilir. Hücreler bir kez hücre döngüsü yeniden girmek primer kirpikler parçalarına ve her centriole yavaş yavaş olgun centriole ³ oluşturmak üzere uzar proksimal ucunda bir procentriole montajını yönlendirmektedir. S-fazı başlangıcında, sentriolden 9-katlı bir simetriye sağlayan bir çember benzeri bir yapı olan her sentriolden yüzeyi üzerinde oluşturulmuş olan ve her procentriole baz olacaktır. Sas6 tcentriole montaj cartwheel ^4-6 hub oluşturmak için işe edilir için şapka vazgeçilmezdir. Diğer centriolar proteinler daha sonra uzak bir şekilde ⁷ derece düzenlenir, proksimal tekerin üzerine monte edilir. Tam centriole tekrarını tamamladıktan sonra, hücreler G2 fazı ⁸ yılı sonunda iki fonksiyonel sentrozomlar inşa ek pericentriolar malzemeleri bir araya getirin. Çekirdek centriolar bileşenler ^9-11, kinaz, fosfataz, şaperonlar, iskele elemanları, zara bağlı proteinler ve bozunma makineler dahil olmak üzere birçok başka protein ek olarak hücre döngüsü ^12-16 farklı zamanlarda Sentriyoller bazal gövde ve PCM ile ilişkilidir. Genellikle, bir çok proteinin centrosomal seviyeleri geçici olarak centrosomal hedefleme mekanizmalarının ve / veya sentrozom de proteozomal bozulması düzenlenir belirtilmelidir. Önemli bir şekilde, Plk4, Mps1, Sas6 ve CP110 a gibi çeşitli proteinlerin centrosomal düzeyinde dalgalanmalarhücre döngüsünün t farklı noktaları centriole düzeneğinin ^5,17-22 düzenleyen önemli olduğu görülmektedir, ve bu centrosomal bozulması önlenir Mps1 durumunda fazla Sentriyoller ¹⁹ oluşumuna yol açar. Öte yandan, çeşitli proteinlerin centrosomal fraksiyonlar sitosolik havuzları ile karşılaştırıldığında daha az dayanıksız. Örneğin aşağı doğru düzenlenmesi fotoseli 2 (Cetn2) siRNA aracılı olan bütün hücre seviyeleri ²³ büyük azalmaya rağmen Sentriyoller protein düzeyinde yalnızca orta derecede bir azalma sağladı. Oldukça onların centrosome özel fonksiyonları değerlendirilirken tüm hücre protein seviyelerini ölçmek daha centrosome de centrosomal proteinlerin düzeyindeki değişiklikleri ölçmek için bu nedenle çok önemlidir.

Bu çalışmada, sentrozom bir proteinin nispi seviyesini ölçmek için dolaylı immünoflüoresans (IIF) kullanan bir analiz geliştirdik. Bu deney, çeşitli örneklerden olan hücreleri analiz etmek için özellikle geliştirilmiştirve bu nedenle, aynı zamanda görüntülü edilemez. Numuneler farklı zaman noktalarında toplandı farklı reaktifler (örneğin, ilaç kontrole karşı) ile muamele edilmiş olan hücreler olabilir (yani, Chase karşı darbe), ya da hücre döngüsünün farklı aşamalarında bulunmaktadır. Bu deneyde ilkesi arka düzeltilmiş floresan yoğunluğu küçük bir bölgede bir proteine ​​karşılık gelen ve, seviyeleri seçilen deney koşulları altında değişmeyen bir başka protein aynı karşı değer normalleştirmek için ölçüm yatmaktadır. Centrosome biyoloji çeşitli çalışmalar son zamanlarda aday proteinlerin ^24-27 arasında centrosome özgü fonksiyonunu belirlemek için, hem canlı ya da sabit hücrelerde çeşitli kantitatif mikroskopi teknikleri, kullanılan var. Bu deneylere benzer şekilde, bu teknik, aynı zamanda test proteinin arka plan düzeltilmiş bir flöresan yoğunluk ölçer. Bununla birlikte, bu tahlilde, bir dahili standart olarak normalleştirme dahil büyük ihtimalle daha teklifdoğruluk ve iki farklı lamelleri üzerinde iki farklı örnekleri analiz güven. Ayrıca, sentrozom protein seviyesinin incelenmesine ek olarak, küçük ayarlamalar ile bu yöntem, deney şartlarının farklı ayarlamak için ya da diğer hücresel sitlerde uygulanabilir.

Burada, farklı hücre döngüsü aşamalarında hücreleri karşılaştırmak için BrdU darbe-kovalamaca stratejisi ile kantitatif mikroskopi tahlil birleştirir. Bunun yerine, hücre döngüsünün farklı zaman noktalarında çalışma zaman uyumsuz büyüyen hücreler standart hücre döngüsü tutuklama ve serbest bırakma teknikleri kullanılarak S-fazında hücreleri etiketlemek için BrdU ile inkübe edilir, ve etiketlenmiş hücreler, çeşitli zamanlarda (tipik olarak 4-6 saat) boyunca takip edilir. Etiketli hücrelerin çoğu hemen darbesinden sonra S-faz olacaktır. Chase sonra işaretli hücrelerin morfolojik özellikleri nuc göre sentrozom gibi maddelerle pozisyonu tarafından kontrol edilebilir geç S, G2 veya mitoz içinde olacak şekilde Chase uzunluğu seçilirLei, sentrozom arasındaki mesafe, vb kromozom kondansasyon Böylece, kovalama uzunluk S, G2 ve belirli bir hücre tipinin M fazında ortalama süresine bağlıdır. Bu yaklaşım, vb hidroksiüre, afidikolin, nokodazol, hücre döngüsü inhibitörleri önler olduğundan, fizyolojik olarak daha uygun hücre döngüsü analizi sağlar.

Bu yüzden, tek başına nicel floresan mikroskobu deneyi veya BrdU Darbe kovalayıcı tahlilinde ile kombinasyon halinde, doğru bir soğukkanlı hücre döngüsü sırasında aday protein centrosomal seviyesinde göreli değişiklikleri ölçmek için basit ama etkili bir yöntem olduğu burada ortaya koymaktadır. Biz, bu deneyler kullanılarak, VDAC3, son zamanlarda ^16,28 mitokondri ek olarak sentrozom de tanımlanan bir protein centrosomal düzeyleri ölçüldü. Burada elde edilen sonuçlar VDAC3 arasında centrosomal havuz bozulması ile düzenlenir bizim daha önceki bir gözlem doğrulamak, ve aynı zamanda bir hücre döngüsü bağımlı hazırlık değişirt şekilde ^16, ayrıca bu yöntemin uygulanabilirliğini doğrulanması.

1. Hücre Kültürü

1. Ters transkriptaz (hTERT) ölümsüzleştirdi retina pigment epitel hücreleri, insan telomeraz kullanın (hTERT-RPE1; RPE1 burada anılacaktır).
   Not: RPE1 hücrelerde bu centriole montaj ve ciliogenesis incelemek için kullanılır yakın-diploid, dönüştürülmemiş insan hücreleridir. Bu hücreler düzenlenmiş hücre döngüsü ile koordineli normal centriole çoğaltılması döngüsünü izleyin.
2. Geçiş 1 ile RPE1 hücrelerinin yakın bir birleşik, 100 mm'lik bir hücre kültürü çanağı: 10 ml ihtiva eden bir taze 100 mm tabak için orijinal kültür 5 seyreltme DME / F-12 (1: 1) ortamı,% 10 fetal inek serumu ile desteklenmiş (FBS), 100 U / ml penisilin G ve 100 ug / ml streptomisin (tam bir ortam, DME / F-12 ortamı olarak adlandırılır). % 5 _CO2 varlığında 37 ° C'de hücreler büyür.
   1. Bir su banyosu veya inkübatör içinde 60 ° C'de, çalkalanarak olmadan kapalı bir cam beher O / N HC1 50 ml 12 mm yuvarlak cam lamelleri inkübe edin.
   2. Afasit çözeltisi atılması ter arada çalkalanarak 15 dakika boyunca inkübe edilerek lamelleri damıtılmış su, 100 ml, üç kez yıkayın. % 70 Etanol ve% 95 etanol ile benzer şekilde yıkama tekrarlayın.
   3. Ayrı ayrı 60 dakika UV radyasyonu ile sterilizasyon ardından biyogüvenlik kabini içinde bir laboratuvar kurutma kağıdı, onları dışarı yayarak lamelleri kurulayın.
3. Bir 35 mm hücre kültür çanağı 2-4 kuru lamelleri yerleştirin. Hücre kültürü, PBS içinde 25 ug / ml'lik bir konsantrasyona kadar işlenmiş polimerin (1 mg / ml stok konsantrasyonu) gibi fibronektin çözeltisi ya da fibronektin ile seyreltilir.
   1. Her lamel üzerine seyreltilmiş çözeltinin 80-100 ul yerleştirin ve kaplamak için 60 dakika lamel üst tarafı için kuluçkaya yatmaktadır. Tam orta eklemeden önce PBS ile üç kez lamelleri yıkayın.

2. Büyüyen Hücreler ve Proteazom inhibitörleri ile tedavi Hücreler

1. Passage 2 x 10 ⁵ asenkron olarak büyümekHer 35 mm çanak ing RPE1 hücreleri lamelleri içeren ve 2 ml tam orta hücreleri büyür. Kültür ortamı, taze, önceden ısıtılmış tam ortam maddesi ile her 24 saatte değiştirin.
   1. Test protein centrosomal düzeyde proteazom inhibisyonunun etkisini analiz etmek (burada VDAC3 veya γ-tubulin), 44 saat için iki adet 35 mm yemekleri hücreleri büyümek. Komple ortam ile kültür ortamı yerine sırasıyla 5 uM veya% 0.05'lik bir nihai konsantrasyonda kontrol çözücü olarak MG115 veya DMSO ya da eklemek. Aynı zamanda, 4 saat süre ile hücreler 40 uM'lik nihai bir konsantrasyonda, hücrelere BrdU ekleme ve inkübe edilir.
   2. 24 oyuklu bir plaka içerisinde her bir lamel aktarın. Her bir oyuğa 500 ul soğutulmuş metanol eklenir ve 10 dakika lamelleri hücreleri düzeltmek için, -20 ° C 'de plaka inkübe edin. Hemen lamelleri 500 ul yıkama tamponu ile üç kez yıkayın (0.5 mM _MgCI2 ve% 0.05 ihtiva eden 1x PBS, Triton-X-100).
2. Artık Hasat35 mm tabak ve santrifüj 5 dakika boyunca 1000 x g'de hücrelerinden hücre. Western blotting (aşama 6), total protein analiz üzere hücre pelleti kullanın.

3. BrdU Darbe ve Chase Testi Farklı Hücre Döngüsü Evreleri Protein Düzeylerinin Analiz

1. 44 saat lamelleri içeren iki adet 35 mm yemekleri hücreleri büyümek, hücre döngüsünün farklı aşamalarında sentrozomlarla bir proteinin (burada VDAC3, Sas6 veya Cep135) seviyesi değişimini analiz etmek. 40 uM BrdU içeren tam ortam maddesi ile kültür ortamı yerine ve hücre kültürü kuluçka makinesi içinde 4 saat kuluçkalayın.
2. Bir tabak, Aşama 2.1.2 tarif edildiği gibi soğutulmuş metanol kullanılarak hücreleri gidermek için bir 24 oyuklu plaka lamelleri aktarın.
3. 4 saat BrdU puls sonrasında BrdU-içeren ortam maddesinin ayrılması bir kez PBS ile yıkayın hücreleri ve tam ortam maddesi ile bir kez çeşitli zamanlarda (tipik olarak bir 4 saat boyunca BrdU yokluğunda hücreleri taze ortam ilave ve daha sonra büyüyecekAdım 2.1.2 de açıklandığı gibi hücrelerin sabitleme önce RPE1 hücreleri) için.
   Not: RPE1 hücreleri için, BrdU-pozitif hücrelerin çoğu, bir 4 saat Chase sonra geç S ya da G2 faz içindedir. Bu, her bir hücre tipi için ayrı ayrı belirlenmelidir.

4. immün

1. 30 dakika boyunca (1 x PBS içinde% 2 BSA ve% 0.1 Triton X-100), bloke edici tampon 200 ul lamelleri ile sabitleştirilmiş hücreler inkübe edin.
   1. Birincil antikor karışımı ile inkübe hücreleri nemlendirilmiş bir bölmede 4 ° C'de tampon O / N engelleme seyreltilmiş (tipik olarak bir tavşan içinde yetiştirilmiş ve bir fare arttırılmış).
   2. Nemlendirilmiş bir odasını yapmak için, boş bir 1.000 ul pipet kutusunun alt yarısında ıslak kağıt havlu koymak. Raf yüzeyinde Parafilm bir şerit yatıyordu, ve inkübe her lamel için Parafilm üzerine antikor çözümün bir damlacık (15-20 ul) nokta. Antikor çözeltisi bir damlacık üzerine bir lamel haricindekileri (hücre dalmış böylece) ve yakınucu kutusunun kapağı.
   3. Yine lamelleri ters çevirin ve 24 kuyu çanak onları geri dönün. Lamelleri yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca (yeşil flüoresan boya konjuge edilmiş anti-tavşan ve kırmızı flüoresan boya konjuge edilmiş anti-fare, bloke edici tampon içinde seyreltilmiş burada) 150 ul ikinci antikor karışımı içinde inkübe. Lamelleri üç kez yıkayın.
      NOT: florofor-konjuge İkincil antikorlar duyarlı hafif. Adım sırasında ışıktan koruyunuz örnekleri 4.1.3-5.1.2.
2. Aşama 2.1.2 tarif edildiği gibi, 10 dakika boyunca -20 ° C 'de 500 ul soğutulmuş metanol ile tekrar boyanmış RPE1 hücrelerin tespit anti-BrdU boyama için hazırlayın. Üç kez lamelleri yıkayın.
   Not: Bu tespit, takip eden basamakta asit hidroliz işlemi sırasında ilgili protein (ler), primer ve sekonder antikor etiketleme korur.
   1. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 2 N HCI, 200 ul hücreleri inkübe edin. 1 M Tris-Cl, 300 ul, pH 8, ile nötralizehücreleri yıkama tamponu kullanarak üç kez yıkayın d.
   2. Tekrar, oda sıcaklığında 30 dakika blokaj tamponunda 200 ul kullanarak hücreleri bloke eder.
   3. Nemli bir bölmede 37 ° C 'de 45 dakika boyunca (blokaj tamponu içinde seyreltilmiş) sıçan anti-BrdU antikoru ile inkübe hücreleri. 24 oyuklu tabağa geri lamelleri Dönüş yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat süre ile, 24-çukurlu tabak bloklama tamponu 150 ul seyreltilmiş mavi floresan boya konjuge edilmiş anti-fare ikincil antikoru (kuluçkalayın.
3. Lamelleri üç kez yıkayın. Bir cam mikroskop lamı üzerine antifade reaktif içeren bir montaj çözümün bir damlacık (kabaca 3-6 ul) Nokta. Hücre tarafı montaj çözümü üzerine, aşağı bakacak şekilde, bir lamel haricindekileri. Yavaşça yumuşak doku temizleme kullanarak slayt karşı lamel basarak fazla sıvıyı silin. Mikroskop lamı üzerine mühür lamel kenarında şeffaf oje sürün.

5. Immünofloresan Görüntü EdinimEdinim ve Analizi

1. Ortam sıcaklığında BrdU-pozitif RPE1 hücrelerinin görüntüler elde etmek için (1.4 sayısal diyafram ile) 100X Planı Apo immersiyon yağı hedefi kullanın.
   1. Dijital görüntüleme yapabilen bir kamera ile mikroskop ekli (donanım bakınız) bir slayt koyun. Her fluorofor için, manuel bir deney tüm örnekleri inceleyerek (tipik 300-1,000 msn arasında) uygun pozlama süresini belirler. Bir hücrenin görüntüleri almadan önce, elle Z-ekseni (genellikle 0.2 mikron adım boyutu) boyunca uygun üst ve alt odak düzlemi belirler. Bir dijital mikroskopi görüntüleme yazılımı paketi kullanarak Z-ekseni boyunca farklı floroforlar için aynı pozlama süresi ile ayrı lamelleri farklı örneklerin görüntüleri edinin.
2. Z-ekseni boyunca elde edilen tüm resim yığınlarının (Yok komşu algoritması kullanarak bu durumlarda) dekonvulasyon gerçekleştirin.
   1. Boyunca her görüntü yığını toplam yoğunluk projeksiyonu eldeZ-ekseni.
3. Sentrozomlar (iki sentrozomlarla arasındaki mesafe en az 2 mikron) yakın hücrelerde, hem sentrozomlarla etrafında küçük bir kare (yan başına tipik 20-30 piksel) çizmek ve seçilen alanı işaretleyin.
   1. İlk meydanı çevreleyen daha geniş bir kare (yan başına tipik 24-35 piksel) çizin ve büyük kare seçili alanı işaretleyin.
   2. Alan (A) ve her kutuya her floroforun toplam floresan yoğunluğu (F) elde (S küçük kutu gösterir ve L büyük kutu gösterir).
   3. . Howell ve ark ²⁹ tarafından açıklanan formülü kullanarak her floroforun arka plan düzeltilmiş floresan yoğunluğu analiz: F = F _S - [(F _L - F _{S) S} / (A _L - A _S) x].
   4. Bunu fl artalan-düzeltilmiş floresan yoğunluğu oranının hesaplanmasıyla ilgi (burada VDAC3 veya Sas6) proteinin normalize edilmiş floresan yoğunluğu elde edilir(Burada γ-tubulin, Sas6 veya Cep135) seçilen iç standart için kullanılan floroforun buna uorophore.
4. Sentrozomlar iyi ayrılmış nerede hücreleri analiz durumunda, kutuların iki ayrı set çizerek ayrı ayrı centrosome analiz (iki sentrozomlarla arasındaki mesafe büyük 2 um daha). Her centrosome etrafında küçük bir kare (yan başına tipik 15-25 piksel) çizin ve seçilen alanı işaretleyin. İlk meydanı çevreleyen daha geniş bir kare (yan başına 20-30 piksel) çizin ve seçilen alanı işaretleyin.
   1. Alanı (A) ve her kutuya her fluorofor toplam floresan yoğunluğu (F) elde edilir, ve adım 5.3.3 tarif edildiği gibi, her bir sentrozom için ayrı ayrı her bir fluorofor arka düzeltilmiş floresan yoğunlukları hesaplamak.
   2. Bu hücredeki bu proteinin toplam centrosomal seviyesi elde etmek için, iki sentrozom her proteinin arka plan düzeltilmiş floresan şiddetleri birleştirin.
   3. Elde etmekİç standart toplam centrosomal yoğunluğu toplam centrosomal yoğunluğu oranının hesaplanmasıyla ilgili proteine ​​normalize şiddeti.
5. Her deneysel koşul için en az 15-25 hücreleri analiz ve bir tablo grafiği çizmek.

6. Western Blot kullanma Toplam Protein Analizi

1. 50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCl,% 1 Nonidet P-40,% 1 sodyum deoksikolat,% 0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren (RIPA) tamponu radyoimmünopresipitasyon deneyinde hücreler yeniden süspanse edin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe hücreleri lize etmek için.
   1. 10 dakika için 10,000 x g'de santrifüjleyin Karışımı topak fraksiyonundan lizat ayrılması ve bir bisinkoninik asit (BCA) deneyi kiti kullanılarak her bir lizattan toplam protein konsantrasyonunun ölçülmesi.
2. 4x SDS-PAGE yükleme tamponu (50 mM Tris-Cl, pH 6.8,% 2 SDS,% 10 gliserol, 100 mM ditiyotireitol,% 0.1 Brom ile lizat 40 ug karıştırın) Mavi ophenol.
   1. 10 dakika boyunca numune kaynatılır ve 200 V sabit gerilimde, SDS-PAGE, denatüre edici bir% 12.5 ile örnekleri çalıştırmak
3. (Soğukta 1 saat süre ile 90 V sabit gerilim) Western lekeleme tekniği kullanılarak bir nitroselüloz zar üzerine, SDS-PAGE üzerinde ayrılmış proteinler aktarın.
   1. 1x PBS içinde% 3 yağsız süt ile bloke membran ve daha sonra 1 için (bu durumda, tavşan anti-VDAC3, tavşan anti-γ-tübülin ve fare anti-α-tübülin bağında absorbe edilmemesi) ile seyreltildi birincil antikor çözeltileri ile membran inkübe oda sıcaklığında bir saat.
   2. Membrana PBS-T tamponu kullanılarak üç kez (çalkalama altında, her 5 dakika inkübasyon) yıkandıktan sonra (1x PBS ve% 0.2 Tween-20), yakın kızılötesi (IR), floresan boya konjuge edilmiş anti-tavşan oluşan bir karışım içinde membran inkübe ve 1 saat boyunca (PBS-T içinde seyreltilmiş) IR florasan boya konjuge edilmiş anti-fare ikincil antikorlar.
   3. Membranı üç kez yıkayın ve sonra kızılötesi f kullanarak bantları analiz membran taramaimmünoblot tespiti için uygun luorescence görüntüleme sistemi olmaktadır.

Bizim son çalışmalar VDAC3, mitokondriyal porinlerini 16,28 birinin yeni centrosomal lokalizasyonu ve fonksiyonu tespit. Bir VDAC3 özel bir antikor kullanılarak RPE1 hücreleri dahil olmak üzere birçok memeli hücrelerinin immün belirgin centrosomal boyama ve nispeten zayıf mitokondriyal boyanma gösterdi. Ayrıca centrosomal VDAC3 tercihen ana sentriolden ve endojen hem de centrosomal havuzu ile ilişkili ve ektopik VDAC3 bozulma 16 düzenlenir ifade olduğunu göstermiştir. Kantitatif IIF tahlil doğrulamak için S-fazında olan hücrelerde sentrozom ilişkili VDAC3 havuzunda değişiklikler incelendi.

Burada, senkronize olmayan bir şekilde büyüyen RPE1 hücreleri proteazom önleyicisi MG115 ya da 4 saat süre ile kontrol çözücü DMSO ile işlemden geçirildi. S-faz ve sentrozom takımını geçiren bulunan hücrelere analizimizi kısıtlamak için, biz sadece BrdU du dahil hücreleri incelendiAynı 4 saat halka ve (birbirini 2 mikron içinde aralıklı) iki yakın aralıklı sentrozomlar vardı. Bu MG115 kısa tedavi BrdU dahil edilmesini, kontrole göre (yaklaşık% 58) etkilemediğini sonuçlandırmak için hem kontrol ve MG115 tedavisi (Şekil 1A) için BrdU boyanmış hücreler ve çekirdekler muhtelif rasgele incelenen alanın (yaklaşık% 56) RPE1 hücrelerinde. Biz (birbirinin 2 um olan aralıklı iki γ-tübülin odaklarının varlığı ile belirlendiği üzere), S-fazında olduğu, sadece hücreler karşılaştırarak olarak, normalleştirme için potansiyel bir iç standart olarak γ-tubulin olarak. BrdU-pozitif hücrelerde centrosomal γ-tübülin seviyeleri proteazom inhibisyonu göre değişebilir Böylece, ilk incelenmiştir. Beklendiği gibi, orada bir hücreden diğerine γ-tübülin floresan yoğunluğu kayda değer hücre-hücre varyasyon ve bu varyasyon iyi bir bütün veriler olarak ayarlanmış verileri sunmak kutusu ve visker şemalarında sunulmuştur olduğu bulunmuştur. Benn kutusu ve bıyık şemaları, kutular alt ve üst çeyreğini temsil kutuya işaret her serinin ortanca gösterir, ve bıyıkları (her zaman olmasa da) genellikle aykırı olan minimum ve maksimum değerler, temsil eder. Şekil 1 D'de görüldüğü gibi, centrosomal γ-tübülin seviyesi bu nedenle, bu deney için, bir iç standart olarak γ-tubulin doğrulayarak, MG115 veya DMSO ile muamele edilen BrdU-pozitif hücreleri arasında önemli ölçüde farklı değildi. -Tubulin γ aksine, centrosomal VDAC3 karşılık gelen arka plan düzeltilmiş bir flöresan yoğunluk kontrol hücreleri (Şekil 1C) daha MG115 ile muamele edilmiş hücreler içinde daha yüksek bir 2.5 kat yaklaşık oldu. Biz γ-tübülinin buna karşı toplam VDAC3 floresan normalize zaman, kat artış kabaca iki kat (Şekil 1E) biraz düştü. Kat değişim normalleşme olmadan büyük olmasına rağmen, biz bett hissediyorum normalize verilerin doğruluğu daha fazla güven var, numune işleme MG115 tedavisi, hem de değişik herhangi bir genel etki için er kontrol eder. Olmayan centrosomal siteleri (Şekil 1B) veya VDAC3 (Şekil 1F) 'nin toplam hücresel düzeyde VDAC3 boyama, proteazom inhibisyonu ile etkilenmemiştir. Böylece, biz kantitatif VDAC3 ve centrosomal havuz proteasome-aracılı bozulması tarafından düzenlenir önceki gözlem doğrulayın.

Hücre döngüsü sırasında centrosomal VDAC3 değişikliği ölçmek için biz etiketli hücrelerin bir 4 saat kovalamaca ardından 4 saat BrdU darbe ile hücreleri etiketli. Beri sadece S-fazı hücreleri darbesi sırasında BrdU dahil olacak, geç S-faz veya erken G2 fazında ya olacak 4 saat kovalamaca sonrası BrdU-pozitif RPE1 hücrelerinin çoğunluğu ((iki sentrozomlarla arasındaki ortalama mesafe ± 0.16 mikron 1.35 olduğunu) İki sentrozomlarla arasındaki ortalama mesafe geç G2 aşamada küçük bir nüfusa sahip,) 1.55 ± 0.22 mikron olduğu centroBazı çift anlamlı 30 (iki sentrozomlarla> 2 um arasındaki ortalama mesafe) ayrılmış oldu. γ-tubulin, büyük bir PCM bileşeni büyük ölçüde G2 faz 31,32 meydana gelir, ve bu artış, diğer centrosomal proteinlerin hücre döngüsü varyasyonları değerlendirmek için zayıf bir iç standart hale sentrozom olgunlaşması sırasında sentrozom birikir. Öte yandan, Sas6 cartwheels 4,5,7 montajını uyarmak için erken S-fazında procentrioles için işe edilir ve (Şekil 2 bozulmuş başladığında, hücreler mitoza girdiğinde kadar yeni oluşan Sentriyoller tabanında kalır ve referans 5). Hücreler G2 fazında 5 S-fazdan ilerleme Ancak, HeLa veya U2OS hücrelerinde, Sas6 ve centriolar düzeyi giderek artmaktadır. Bu nedenle, ilk Cep135, Sentriyoller proksimal uçları boyunca lokalize bir çekirdek centriolar proteininin göre centrosomal Sas6 seviyesi ölçüldüHücre döngüsü 33. Sentrozomlar yakından aralıklı zaman biz (Şekil 3A-D nabız veya kovalamaca, gelen BrdU-pozitif RPE1 hücrelerinde Cep135 veya Sas6 arka plan-düzeltilmiş toplam floresan yoğunlukları anlamlı bir fark saptamadık; ikisi arasında 'yakın' hücreleri ortalama mesafe sentrozomlar en az 2 um). Bu duruma göre, normalize Sas6 seviyesi, bu hücreleri (Şekil 3E) içindeki kalmıştır. Bununla birlikte, Sas6 genel floresan yoğunluk değerleri tutarlı bir artış ve (; * uzak hücreleri iki sentrozom> 2 um arasındaki mesafe) sentrozomlar iyice ayrıldığı hücrelerde Cep135 aynı hafif bir artış gözlenmiştir. Buna göre, iki iyi ayrılmış sentrozomlarla birlikte hücrelerde normalize toplam centrosomal Sas6 seviyesi biraz oldu, ama birbirine yakın sentrozomlarla birlikte hücrelerde daha istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek. Bu durum Sas6 düzeyi zekâ doğal düzenlemeye muhtemeldirh hücre döngüsü ilerlemesi 5. Ancak, hafif bir artış (ki ya da daha düşük istatistiksel anlamlılık) yakın aralıklı sentrozom hücrelerde de aynı anda iki sentrozom analiz göre, ayrı ayrı analiz edilmiştir iki sentrozom floresan yoğunlukları ilave bağlı olduğu da mümkündür. VDAC3 floresans yoğunluğu, tek başına Sas6 bu göre normalize edildi zaman Bununla birlikte, iki birbirine yakın sentrozom de VDAC3 seviyesinde erken S-fazı ile karşılaştırıldığında, geç S / erken G2 fazında olan hücrelerde yaklaşık 1.5 kat artmıştır hücreleri (Şekil 4A-C, F; 'yakın' hücreleri). Bu hücreler, son G2 fazında ilerleme, iki sentrozom normalize VDAC3 seviyesi geç S-fazı (Şekil 4C, F) kıyasla 2.4 misli azalmıştır.

Sas6 seviyeleri geç S-fazı, G2 den biraz artış için, iç standart olarak Sas6 kullanılarak Aralık hafif bir fazla tahmin edilmesine yol açarGeç G2 faz hücrelerinde VDAC3 seviyelerinde artma (sentrozomlar fazla 2 um ile ayrılmaktadır). Bizim veri Cep135 daha iyi bir seçim hücre döngüsü değişimleri değerlendirmek için bir iç standart olarak olduğunu göstermektedir iken bize mevcut VDAC3 ve Cep135 antikorları hem tavşan, çünkü biz VDAC3 için kullanamazsınız. Ancak, Cep135-normalize Sas6 medyan değerine göre Sas6-normalize VDAC3 (F VDAC3 / F Sas6) için medyan değeri çarpılarak bize Cep135-normalize VDAC3 [(F VDAC3 / F Sas6) x için yaklaşık bir değer (F Sas6 / verir F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. Bu analiz, Geç s / erken G2 ve geç G2 arasında VDAC3 seviyelerinde değişiklik yapıldıktan sonra 2 kat hafifçe düşer. Özet kromozom ve zayıf Sas6 boyama ile değerlendirildiği gibi mitoz herhangi bir aşamasında olan BrdU-pozitif hücreler, Sas6 seviyeleri dramatik düşüş, bizim bu çalışmanın dışında bırakılmıştır. Ancak, biz kaydetti centrosomal VDAC3 seviyesi yenidenmitoz sırasında düşük mained (veriler gösterilmemiştir). Cep135 seviyeleri mitoz sırasında düşürmeyin Çünkü (veriler gösterilmemiştir), biz prensip olarak mitoz Cep135-normalize VDAC3 seviyelerini tahmin etmek yeniden normalleştirme işlemi tekrar olabilir. Bununla birlikte, gerçeklikte, mitoz centrosomal Sas6 seviyesi ilk olarak Sas6 normalleştirilmiş VDAC3 seviyelerinin doğru ve hassas belirlenmesi için izin vermek için çok değişken olmuştur. Ne olursa olsun, genel olarak, bizim veri VDAC3 ve centrosomal havuz, hücre döngüsü sırasında sentrozomlarla de düzenlenir olduğu belirlenmiş.

Şekil 1. eşzamansız büyüyen RPE1 hücreler, 4 saat boyunca BrdU ve MG115 (MG) ​​ya da DMSO (DM) ile inkübe edildi. (A) gösterilen bir anti-BrdU antikoru (kırmızı) ve Hoechst (lekelenmiş rasgele tedavi DMSO veya MG115 alanları hücreleridir DNA, mavi). Burada ve diğer tüm görüntüleri bar 5 mikron temsil eder.(BE) DMSO ve MG115 hücreleri VDAC3, γ-tübülin ve BrdU karşı antikorlar ile boyandı işlemden geçirildi. BrdU-pozitif hücreler aynı görüntüleme koşulları altında görüntülendi (pozlama mavi fluorofor / BrdU için 400 msn times-, yeşil fluorofor / VDAC3 için 500 msn, kırmızı fluorofor / γ-tubulin için 300 msn) ve arka plan VDAC3 floresan yoğunluklarına düzeltilmiş ve γ-tubulin belirlenmiştir. VDAC3 gösteren Temsilcisi görüntüleri (VD3; yeşil), γ-tubulin (γ-küvet, kırmızı) ve BrdU (mavi) (B) 'de gösterilmiştir. Kareler tarafından belirtildiği gibi burada ve diğer tüm görüntüleri, takmalar dijital sentrozomlar büyütülmüş göstermektedir. Arka plan düzeltilmiş floresan yoğunlukları (F, rasgele birimlerde) yirmi beş hücrelerinden VDAC3 ve γ-tubulin karşılık gelen sırasıyla kutu ve visker (C) 'şeması ve (D)' de çizilmiştir. Burada ve diğer tüm durumlarda, kutular, ma alt ve üst çeyrek temsil(-) kutusuna rker her serinin ortanca gösterir, ve bıyıkları minimum ve maksimum değerleri temsil eder. Bu yirmi beş hücrelerinden VDAC3 normalize edilmiş floresan yoğunluk değerleri (E) 'de çizilmiştir. (CE) için, p değeri eşsiz T-testi türetilmiştir. *** P gösterir <10 -5, ve ns p gösterir> 0.05. (F) α-tubulin (α-küvet) kontrolü yükleniyor VDAC3 (VDAC3a ve VDAC3b 16 ikisi) ve γ-tubulin (γ-küvet) tüm hücre düzeylerini gösteren İmmnüblotlar. Bu büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız rakam.

4 saat Br ile etiketlenmiş Şekil 2. uyumsuz büyüyen RPE1 hücreleri(γ-küvet; kırmızı) dU nabız ve BrdU yokluğunda bir 4 saat boyunca takip edilir Sas6 (yeşil) ve γ-tubulin karşı antikor ile boyandı. Örnek görüntüleri olan iki yakın olan ((A), S-fazında Sas6 boyanmama Sas6 odaklar), (B) metafaz (kutuplarda iki zayıf Sas6 odaklar) ve (C) telofaz (Sas6 odakları kutuplarından kaybolur). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

400 msn kez-Cep135 ve Sas6 lekeli Şekil 3. uyumsuz artan RPE1 hücreleri BrdU yokluğunda bir 4 saat için 4 saat BrdU darbe ile etiketlenmiş ve takip edildi. BrdU-pozitif hücreler, aynı görüntüleme koşulları altında görüntülendi (maruziyetMavi fluorofor / BrdU için; Yeşil fluorofor / Cep135 için 400 msn; Kırmızı fluorofor / Sas6) ve Sas6 ve Cep135 arka plan düzeltilmiş floresan yoğunlukları için 500 msn belirlendi. İki sentrozom arasındaki mesafe, aynı zamanda tüm hücrelerde ölçülmüştür. İki sentrozomlarla arasındaki mesafe az 2 mikron olan bir hücre 'yakın' ve değer olduğu fazla 2 mikron 'uzak' olarak kategorize edilmiştir olarak kabul edildi. (AB) Cep135 (C135; yeşil) gösteren Temsilcisi görüntüleri, Sas6 (kırmızı) ve BrdU (mavi) gösterilir. (B) 'de, C1 ve C2 için temsili' uzak 'hücrenin iki sentrozomlar bulunmaktadır. (CD), arka plan düzeltilmiş floresan yoğunlukları (F, rasgele birimlerde), her bir kategori beş hücrelerinden Sas6 (C) ve Cep135 (D) 'e uygun kutu ve visker diyagramı çizilmiştir. (E) sağa sola Sas6 Normalize yoğunluklarım bu hücrelerin kutu ve bıyık şemada çizilmiştir. (CE) için, p değeri eşsiz T-testi türetilmiştir. * 0.001 <p <0.05 gösterir ve ns p> 0.05 gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yeşil fluorofor / Sas6 için 500 msn, mavi fluorofor / BrdU için 400 msn times- VDAC3 ve Sas6 için lekeli Şekil yukarıdaki BrdU darbe kovalamaca testte 4. BrdU-pozitif hücreler (Şekil 3) aynı görüntüleme koşulları altında görüntülendi (maruziyet; 1000 kırmızı fluorofor / VDAC3 için msn) ve Sas6 ve VDAC3 arka plan düzeltilmiş floresan yoğunlukları, iki sentrozom arasındaki mesafe tüm hücrelerde ölçülmüştür ve hücrelerin 'c olarak kategorize edildi. belirlendi'(iki sentrozom <2 um arasındaki mesafe)' uzak 'Şekil 3'de olduğu gibi, (2 ila iki sentrozom arasındaki mesafe>). (AC) temsili görüntüleri' BrdU puls (A) yakın hücreler için, kaybetmek BrdU kovalamaca (B), ve VDAC3 için lekeli BrdU kovalamaca (C) 'uzak' hücre (VD3; yeşil), Sas6 (kırmızı) ve BrdU (mavi) gösterilir. (C) 'de, C1 ve C2, iki sentrozomlar bulunmaktadır. [DE] arka plan düzeltilmiş floresan yoğunlukları (F, rasgele birimlerde), her bir kategori beş hücrelerinden VDAC3 (D) Sas6 (E) karşılık gelen kutu ve visker diyagramı çizilmiştir. Bu hücrelerden VDAC3 (F) Normalize yoğunlukları kutu ve bıyık şemada çizilmiştir. (DF) için p değeri eşsiz T-testi türetilmiştir. *** **, P <10 -5 gösterir10 <p <0.001 gösterir ve ns p> 0.05 gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.