Burada, bir proteinin floresan yoğunluğunu uygun bir iç standardınkine normalleştirerek, özellikle sentrozomlarda bir proteinin seviyesindeki değişiklikleri ölçmek için yeni bir kantitatif floresan testi geliştirilmiştir.
Yöntem makalesi
Burada, bir proteinin floresan yoğunluğunu uygun bir iç standardınkine normalleştirerek, özellikle sentrozomlarda bir proteinin seviyesindeki değişiklikleri ölçmek için yeni bir kantitatif floresan testi geliştirilmiştir.
Sentrozomlar genomik bütünlüğünü korumak veya hücrelerde duyusal işlevleri kolaylaştırmak için birincil kirpikler araya mitotik iğ direkleri olarak hizmet küçük ama önemli organellerdir. Bir protein seviyesi, diğer .cellular konumlarda daha sentrozom daha farklı düzenlenmiş olabilir, ve hücre döngüsünün farklı noktalarda çeşitli proteinlerin centrosomal seviyesindeki değişimin sentriol düzeneğinin doğru düzenlenmesi için önemli olduğu görülmektedir. Bu tür hücre döngüsünün farklı aşamalarında veya farklı reaktifler ile muamele edildikten sonra çeşitli örneklerden sabit hücrelerde sentrozom bir protein seviyesinde nispi değişiklik ölçen bir sayısal floresan mikroskobu bir deney geliştirildi. Bu deneyde ilkesi küçük bir bölgede bir proteine karşılık gelen arka düzeltilmiş floresan yoğunluğunun ölçülmesi yer alır ve seçilen deney c değişiklik olmayan başka bir protein için aynı karşı ölçüm normalizeondition. BrdU nabız ve soğukkanlı hücre döngüleri incelemek için takip stratejisi ile birlikte bu testte kullanarak, kantitatif özellikle sentrozomlarla de proteazom aracılı bozulması ile muhtemel VDAC3 ve centrosomal havuz, hücre döngüsü sırasında sentrozomlarla de düzenlenir bizim son gözlem, valide var.
Sentrozom pericentriolar malzeme (PCM) 'çevrili Sentriyoller bir çift oluşur. Memeli hücrelerinde büyük mikrotübül organize merkezleri (MTOCs) olmak, sentrozomlar bölünen hücrelerde mitotik iğ iki kutup olarak hizmet, ve böylece genomik bütünlüğünü 1 korumamıza yardımcı olur. (G0 aşamasında örneğin) hareketsiz hücrelerde, sentrozom, yani ana sentriolden iki Sentriyoller biri, primer kirpik, hücre yüzeyi 2 dışarı doğru çıkıntı yapan bir duyusal organel birleştirmek için bir taban gövdesi içine transforme edilir. Hücreler bir kez hücre döngüsü yeniden girmek primer kirpikler parçalarına ve her centriole yavaş yavaş olgun centriole
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
1. Hücre Kültürü
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bizim son çalışmalar VDAC3, mitokondriyal porinlerini 16,28 birinin yeni centrosomal lokalizasyonu ve fonksiyonu tespit. Bir VDAC3 özel bir antikor kullanılarak RPE1 hücreleri dahil olmak üzere birçok memeli hücrelerinin immün belirgin centrosomal boyama ve nispeten zayıf mitokondriyal boyanma gösterdi. Ayrıca centrosomal VDAC3 tercihen ana sentriolden ve endojen hem de centrosomal havuzu ile ilişkili ve ektopik VDAC3 bozulma 16 düzenlenir ifade olduğunu göstermiştir. Kantitatif IIF tahlil doğrulam.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Hücre biyolojisinde Kantitatif mikroskopi yaygın sabit farklı nicel mikroskopi deneyleri gelişmekte hücre biyologları artan örnekler vardır, vb Ancak, (sıkı bağlamak) Photobleaching sonra böyle Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET), Floresan Kurtarma gibi canlı hücre görüntüleme deneyleri ile ilişkilidir Son yıllarda 27,34-36 hücreler. Önemlisi, sentrozom biyoloji anlamada ilerleme genellikle centrosomal havuzları diğer havuzlar daha farklı düzenlenebilir proteinlerin centrosome özel fonksiyon an.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi (GM77311) ve The Ohio Cancer Research Associates'ten (H.A.F.'ye) bir tohum hibesi ile desteklenmiştir. SM, Ohio Eyalet Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi'nin İnsan Kanseri Genetiği Programından bir Up on the Roof bursu ile kısmen desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Fibronektin | Sigma | F8141 | Suda 1 mg / ml stok |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | DMSO'da 10 mM stok |
| BrdU | Sigma | B5002 | DMSO |
| Anti-γ-tubulin (fare monoklonal, klon GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 IIF engelleme tamponu |
| Anti-VDAC3 (tavşan poliklonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 inç IIF engelleme tamponu, 1:1.000 inç WB engelleme tamponu |
| Anti-Sas6 (fare monoklonal) | Santa cruz biyoteknoloji | sc-81431 | 1:100 in IIF bloke edici tampon |
| Anti-Cep135 (tavşan poliklonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF bloke edici tampon |
| Anti-BrdU (sıçan monoklonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 içinde IIF engelleme tamponu |
| Alexa Fluor 350 Keçi Anti-Sıçan IgG (H+L) | Yaşam teknolojileri | A21093 | 1:200 inç IIF engelleme tamponu |
| Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Fare IgG (H+L) Antikor | Yaşam teknolojileri | A21202 | 1:1.000 inç IIF engelleme tamponu |
| Alexa Fluor 594 Eşek Anti-Fare IgG (H+L) Antikor | Yaşam teknolojileri | A21203 | 1:1.000 inç IIF'dir engelleme tamponu |
| Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L) Antikor | Yaşam teknolojileri | A21206 | 1: 1.000 inç IIF engelleme tamponu |
| Alexa Fluor 594 Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L) Antikor | Yaşam teknolojileri | A21207 | 1: 1.000 içinde IIF engelleme tamponu |
| Anti-&# 947;-tubulin (tavşan poliklonal) | Sigma | T5192 | 1: 1.000 inç WB engelleme tamponu |
| Anti-&# 945;-tubulin (fare monoklonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20.000 inç WB engelleme tamponu |
| Alexa Fluor 680 Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L) | Yaşam teknolojileri | A10043 | 1:10.000 inç WB engelleme tamponu |
| Fare IgG (H & L) Antikor IRDye800CW Konjuge | Rockland antikorları | 610-731-002 | 1: 10.000 WB bloke edici tamponda |
| SlowFade Altın Antifade Reaktifi | Yaşam teknolojileri | S36936 | Montaj ortamı |
| Yuvarlak lameller 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 mikroskop | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR kamera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo yağa daldırma objektifi | Olympus | 1.4 sayısal diyafram | |
| Slidebook yazılım paketi | Akıllı Görüntüleme Yenilikleri | ||
| Odyssey IR Görüntüleme Sistemi | Li-cor Biosciences | ||
| Biskinconinik asit (BCA) tahlili | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Dar UV küpü | Olympus | U-M622 | Filtre |
| U-MNU2 Dar Mavi Küp | Olympus | U-M643 | |
| Filtre U-MNU2 Dar Yeşil Küp | Olympus | U-M663 | Filtre |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste