Yöntem makalesi

Musküler Distrofi Hastalarda gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin oluşturulması: İdrar Türetilmiş Hücre Verimli Entegrasyonu-ücretsiz yeniden programlanması

DOI:

10.3791/52032

⸱

28 Ocak 2015

 , 
1Department of Medicine, Medical College of Wisconsin

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kas distrofisi hastalarından idrardan türetilmiş hücrelerin izolasyonu için ayrıntılı prosedürler gerektirir; Sendai virüsü transdüksiyonu yoluyla verimli ve hızlı yeniden programlamaları.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Distrofik kardiyomiyopati müsküler distrofi bir tam olarak anlaşılamamıştır sonucudur. Kas distrofisi olan hastalarda gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) üretilmesi, in vitro bir hastalık modeli sistemleri için çok değerli bir hücre kaynağıdır ve ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilir. Hasta türetilmiş idrar hücreleri distrofik kardiyomiyopati 1 modellemek için uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine başarılı bir yeniden programlama kullanılmıştır. Vektör sistemlerinin entegre güvenlik endişelerini hitaben, biz Yamanaka transdüksiyon müsküler distrofi hastalardan alınan idrar hücrelerine faktörler olmayan bir entegre Sendai virüsü vektörü kullanılarak bir protokol mevcut. Bu protokol, tamamen 2-3 hafta içinde klonlar yeniden programlanan üretir. pluripotent hücreler geçit-13 vektör-ücretsizdir. Bu distrofik iPSCs kardiyomiyositlerde ayrılmakta ve hastalık mekanizmalarını tam ve ilaç taraması için çalışma halinde kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyomiyopati Duchenne ve Becker kas distrofisi (MD) olan hastalarda ölüm ikinci önde gelen nedenidir. X'e bağlı distrofin genindeki mutasyonlar 1 ortaya karşın: 3.500 erkek doğum, çok az ilerici kalp kası hasarına yol açan moleküler ve hücresel olaylar hakkında bilinmektedir. Müsküler distrofi hastalardan elde edilen insan uyarılmış pluripotent kök hücreleri altta yatan hastalık mekanizmaları incelemek ve ilaç 1,2 tarama için kullanılacak yeni bir araç olarak ortaya çıkmıştır.

cilt biyopsisi veya kan örneklerinin beklenen rahatsızlık çalışması katılım için onay vermek, genç hastalar ve / veya onların veliler caydırmak olabilir. İdrar numuneleri yeniden programlama yöntemleri iyileştirilebilir olan somatik hücre non-invaziv bir kaynağıdır. Son zamanlarda, kas distrofisinin, hastalardan toplanan idrar hücreler kültürlendi olabileceğini göstermiştir ve verimli bir şekilde Yamanaka faktörleri ile retroviral transdüksiyonu ile iPSCs (içine yeniden programlanabilir adresOct3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-Myc; OSKM) 1. retroviral gen aktarımı dezavantajı konak kromozom içine yeniden programlanması genlerin rastgele bütünleşmesidir. Bu sınırlamayı aşmak için, biz idrar hücre yeniden programlama olmayan entegre Sendai virüsü kullandık.

Bu protokol daha sonra çalışma için kardiyomiyositlerde ya da diğer hücre tiplerine ayırt edilebilir kas distrofisi hastalardan elde edilen idrar hücrelerinin Sendai virüsü yeniden programlama göstermektedir. Bu protokol, aynı zamanda diğer hasta belirli hastalıklar için adapte edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Hastalar ve / veya veliler çalışmayı onayladı bir Kurumsal Değerlendirme Kurulu katılmak için bilgilendirilmiş onam vermelidir.

1. Tamponlar ve Medya Hazırlıklar

  1. Yıkama tamponu: yıkama tamponu 100 ml hazırlamak fosfat tamponlu salin (PBS) ile 99 ml 100x pen / strep çözeltisi (Streptomisin 100 U / ml penisilin + 100 ug / ml), 1 ml ekleyin.
  2. İdrar Progenitor Hücre (UPC) Orta: UPC orta hazırlamak keratinosit Serum Ücretsiz (KSF) Orta + Progenitor Hücre Orta eşit hacimlerde karıştırmak için.
    1. KSF Orta: epidermal büyüme faktörü 5 ng / ml (EGF), büyükbaş hayvan hipofız bezi ekstraktı, 50 ng / ml (BPB), kolera toksini, 30 ng / ml, ve pen / strep çözeltisi (100 u ilave keratinosit ortamı hazırlamak için / ml penisilin, 500 ml, KSF ortam için, 100 ug / ml streptomisin).
    2. Progenitor Hücre Orta: FBS, 0.4 ug / ml hidrokortizon, 0.1 Ham-F12 medya dörtte biri ile DMEM dörtte üçü ekleyin ve% 10 ile eknM, kolera toksini, 5 ng / ml insülin, 1.8 x 10 -4 M adenin / ml transferin, 2 x 10 -9 M triiyodo tironin, 10 ng / ml EGF ve pen / strep solüsyonu 5 ug.
  3. embriyonik kök Ortamı:% 20 KO-serum yerine (K-SR), 1x MEM esansiyel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin, 100 uM β-merkaptoetanol, 20 ng / ml bFGF ve pen / strep ekleyin 400 mi DMEM / F12 ortamı.

2. İdrar Numune Toplama

  1. Idrar yeterli miktarda (~ 30-40 ml) tahsil edilebilir olmasını sağlamak için idrar toplama 30 dakika önce sıvıları içmek hasta söyleyin.
  2. Hasta ve / veya onların veliler aşağıdaki öğeleri içeren bir idrar toplama kiti ver: (1) steril ya da temiz yakalamak idrar örneği almak için nasıl yazılı talimatlar, (2) nemli bir anti-bakteriyel tuvaletler, ve (3) 100 ml steril örnek toplama fincan. Örnek toplamak için hasta söyleyin.
  3. Hemen buz üzerinde idrar örnekleri yer ve laborant transferBir soğutucu tory. Hemen hücre izolasyonu için idrar işleyin. Bir gecikme kaçınılmaz ise, hücre canlılığı kaybıyla kadar 4 saat boyunca buz üzerinde numune saklamak.

3. İzolasyon ve İdrar Hücreleri Genişleme

NOT: Bir BSL2 Biyolojik Güvenlik Kabinesi steril koşullar altında aşağıdaki adımları uygulayın.

  1. Steril pipetler kullanarak, transferi idrar örnekleri 50-ml santrifüj tüpleri steril alanlar. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
  2. Tüp içinde 1 ml bırakarak süpernatant aspire; Hücre pelet rahatsız etmemek için dikkatli olun.
  3. Süspanse yıkama tamponu 7 ml birden çok tüpünden elde edilen taneler bir araya ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de tekrar santrifüj ve.
  4. Dikkatle hücre pelet ve süpernatant ~ 0,2-0,5 ml bırakarak, süpernatant aspire. İdrar Progenitor Hücre (UPC) orta 2-3 ml süspanse ve un 4-6 kuyulara süspansiyon transferikaplanmış 24 oyuklu plaka.
  5. 72 saat sonra, göz başına taze UPC ortamı, 0.5 ml kültür ek ve 2-3 gün sonra ortam değiştirin. plaka takmak gerekmez eritrosit ve skuamöz hücreler orta değişikliklerle silinecektir.
  6. 4-6 gün sonra kültür izleyin.
    NOT: Küçük 2-4 hücre kolonileri görünmeye başlayacak. Hücreler yuvarlak veya tip I veya renal epitel (RE) hücrelerin sırasıyla 3 tip II temsil eden uzamış olacaktır.
  7. Hücreler görünür bir kez, onlar hızlı bir genişleme fazı uğrayacak beri her 2-3 günde orta değiştirin.
  8. Hücreler% 80-90, kaplama sonra yaklaşık 9-15 gün ulaştıklarında, daha da genişlemesi için 24 plaka 2-4 kuyuları üzerine hücreleri (15,000-18,000 hücre / cm 2) ayırmak ve geçit. Hücre geçişi 1 (P1) olarak bu işaretleyin.
  9. Akım sitometri analizi yoluyla soy özellikleri için idrar hücreleri karakterize immunohistochemnik boyama ya da ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu yoluyla (RT-PCR).
  10. Uzun süreli dondurulup saklanma (DMEM% 10 serum ve% 10 DMSO ile desteklenmiş) izole idrar hücreleri (bölüm 4) reprogram veya Orta Donma onları aşağı dondurma.

Sendai Virüs Kullanılması 4. İdrar Hücre yeniden programlanması

NOT: transfekte maddeler işlenirken doğru kullanımı ve PPE (kişisel koruyucu ekipman) kullanılması tavsiye edilir. Bir BSL2 Biyolojik Güvenlik Kabinesi steril koşullar altında aşağıdaki adımları uygulayın. ajan ve / veya transfekte hücreleri transfekte uygun atılması, çevre ve sağlık tehlikeleri riskini önlemek için tavsiye edilir. Aşağıda ayrıntılı olarak idrar hücre yeniden programlanması için, üreticinin besleyici bağımlı protokol değişiklikleri ile Sendai yeniden programlanması Kit kullanın.

  1. Sendai virüsü kullanarak yüksek verim yeniden programlama sağlamak için, kullanım hızlı olan idrar hücrelerinin 1-5 geçişlerily bölünmesi. Hücreler de çoğaltmak veya yaşlanınca yoksa onlar verimli reprogram olmayacak gibi, onları atın.
  2. Tohum, 6 gözlü bir plakanın iki kuyu içinde oyuk başına 60,000 hücre. Mark Day -2 olarak bu. Hücre tohumlama yoğunluğunu ayarlayın (5 x 04-09 Ekim x 10 4 hücre kuyu başına) Günün 0% 80-90 ulaşmak için gerektiği gibi.
  3. Gün 0 (hücreleri kaplama sonra 48 saat), dört OSKM faktörlerin her içeren Sendai yeniden programlama vektörleri (SeV) hazırlamak. Önceden ısıtılmış UPC ortamı, 1 ml için vektörlerin her ekleyin. Yeniden programlama idrar hücreleri için yeterli olan 1-1.5 MOI (5-7,5 x 10 5 UKÜ) kullanın. Orta aspire ve yavaş yavaş idrar hücrelerinin bir kuyuya 1 ml UPC + Sev ekleyin. Transdüksiyon negatif kontrol olarak ikinci kuyu kullanın.
  4. Gün 1, taze UPC ortam ile UPC + SeV orta yerine. Bazı hücre ölümü nedeniyle viral sitotoksisite 24 saat sonra görülür.
  5. Reprogrammed Clon verimliliğine bağlıE oluşumları ve kompakt morfolojisi, günde 6 ya da 7 kadar günlük orta değişen tutmak.
  6. Önce kalıt aktarımlı hücrelerin (gün 5 veya 6), Mitomisin-C (3 st için 10 ug / ml), 0.1 5 x 10 4 hücre / cm2, yoğunluğu tedavi-MEF'ler kaplama ile MEF besleyici plakalar hazırlamak ayrışması için bir günlük % jelatin 100 mm 2 kültür yemekleri kaplı.
  7. Ertesi gün (gün 6 ya da 7),% 0.25 tripsin ile hücreleri ayırmak UPC orta ve plaka 5 x 10 4 hücreleri tekrar süspansiyon - 2 x 10 5 hücre / 100 mm2 MEF besleyici plaka.
  8. Ertesi gün, embriyonik kök ortamına geçiş ve ortam her gün değiştirin. Dönüştürülmüş hücreler izlemek için bir mikroskop altında hücre dikkate alınmalıdır.
    NOT: Hücreler karakteristik arnavut morfolojisi ve sitoplazmik oranı yüksek çekirdeğe sahip (12-18 gün sonrası transdüksiyon) ile klonal agregatlar oluştururlar.
  9. 2-3 hafta içinde transdüksiyon sonra, koloniler almak ve klon için yeni plakalar transferal genişleme.
  10. 37 ° C'de 1 saat süre ile TRA-1-81 antikoru ile inkübe edilmesi ile iPSC klonların seçilmesi için canlı hücre boyama gerçekleştirme C CO CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de 1 saat boyunca özel bir floresan boya konjuge sekonder antikor ile karşı boyama ile 2 kuluçka takip etti.
  11. Bir 26 G 1½ inç iğne kullanın küçük eşit büyüklükte parçalar halinde büyük TRA-1-81 pozitif iPSC klonlar (klon başına 4-6 adet) çapraz yumurtadan.
  12. Çekme ve transfer Matrigel her çukuruna (10 ug / cm2) birden çok klonun 10-20 çapraz kesik parça embriyonik kök ortamı ile 24 yuvalı plaka -kaplı bir steril pipet ucu kullanın.
    NOT: Tek bir kuyuya ayrı ayrı kaplama bir tek klon gelen adet genişletmek veya pluripotensini korumak değil.
  13. Programlanması klonlar Matrigel yüzeyine bağlı sonra iPSC ortamına hes 24-48 saat değiştirin.
  14. Matrigel kaplı plakalar, manuel SCRA üzerinde bakım sırasındape-off tamamen yeniden programlanması ve pluripotent distrofik iPSC (MD-iPSC) klonları için zenginleştirmek için bir pipet-ucu kullanarak herhangi bir farklılaşmış hücre veya kontamine MEF besleyici hücreler.
  15. Tek tek klonlar, ~ 100 um boyutlara ulaşmış sonra, 3 dakika boyunca 0.48 mM EDTA (etilendiamintetraasetik asit) çözeltisi ile ayrıştırma ve iPSC ortamda süspansiyon haline getirilmiş, MD-iPSCs küçük hücre toplulukları kaplama ile klonlar genişletme (5 uM Y27632 Rho Kinaz ile takviye önleyicisi ) taze matrigel (10 ug / cm 2) 12 plaka kaplama. Günlük iPSC orta değiştirin.
  16. Her bir klonun tam yeniden programlama OSKM genler ve Pluripotency belirteçlerinin (Oct3 / 4 ve TRA-1-81) immünohistokimyasal boyama her iki gen ekspresyon analizi ile tespit edilebilir. Pluripotency potansiyeli titiz bir değerlendirme tamamen reprogrammed iPSC hatları üç germ içine ayırt edebilirsiniz onaylamak için istihdam edilmelidir. Bu embriyoit gövdesi (EB) oluşumu ve farklılaştırma denemesinde veya ter yoluyla gerçekleştirilebilmektedirAtoma formasyonu deneyi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(Sırasıyla, 97,37%, 97.09%, ve% 97.3; Şekil 1A ve 1B) insan idrarından izole en projenitör hücreleri, CD44, CD73 ve CD146 gibi epitelyal progenitör ve perisit işaretleri için pozitiftir. Bu hücreler, aynı zamanda, alfa-düz kas aktin ve vimentin (Şekil 1B) gibi diğer mezenşimal ifade edilen işaretçileri değiştirmemiştir. RT-PCR analizi sitokeratin-7 zayıf sentezleme olduğu kültürlerin hücre oluşan karışık bir popülasyonda kanıt sağlar (CK-7) ve Uroplakin (UP) Ia--IIIa, e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IPSCs kullanarak kardiyovasküler hastalıklar Modelleme genetik katkı 4-6 anlamak için ortak bir yaklaşım haline gelmektedir. Hastaların hücre örnekleri elde bazıları beklenmedik zorluklar, özellikle küçük çocuklar, böyle bir idrar toplama gibi bir non-invaziv bir yaklaşım seçeneği sunarak önlenebilir. Bu genç hasta popülasyonunda, bu yeniden programlama için yeterli idrar hücreleri elde etmek için yeterli idrar hacmini toplamak genellikle zordur. Sıvıları idrar toplama öncesinde 30 dakika içmek için genç hast...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün geliştirilmesi, Daha Sağlıklı Bir Wisconsin'in Geliştirilmesi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri, Translasyonel Bilimleri Geliştirme Ulusal Merkezi tarafından 8UL1TR000055 Hibe Numarası ile desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Materials
4 Oz. Kapaklı Numune Kabıİdrar Örneği Toplama içinSTL Medical SupplyM9AMSAS340
15 ml BD-Falcon TüpleriFisher Scientific352097
50 ml BD-Falcon TüpleriFisher Scientific352098
Yuvarlak Cam LamellerFisher Scientific12-545-81
CytoTune-iPS Sendai Yeniden Programlama KitiYaşam TeknolojileriA1378-001
PBS, pH 7.4Yaşam Teknolojileri10010-023
Glutaminsiz Pen-Strep Yaşam Teknolojileri15140-12237 °C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-09337 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
B-27 İnsülinçli Takviye (50x)Yaşam Teknolojileri17504-04437 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
B-27 İnsülinsiz Takviye (50x)Yaşam Teknolojileri0050129SA37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
DMEM/F12 (1:1)Yaşam Teknolojileri11330-03237 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Versene, 1: 5.000Yaşam Teknolojileri1504006637 ° C'de sıcak; C kullanmadan önce su banyosu
bFGF (10 & mikro; g)Yaşam Teknolojileri13256-02937 & derece'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Hücre Sayacı KartuşlarıYaşam TeknolojileriC10228
Nakavt Serumu (500  ml Şişe)Yaşam Teknolojileri10828-02837 °C Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Geri Kazanım Hücre Kültürü Dondurma Orta Yaşam Teknolojileri12648-010
Keratinosit-SFM (1x), Sıvı Yaşam Teknolojileri17005-04237 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
DMEM, Yüksek Glikoz, GlutamaxYaşam Teknolojileri10566-01637 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Ham's F-12 Besin Karışımı Yaşam Teknolojileri11765-05437 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
EGF Rekombinant İnsan Proteini, Sıvı FormYaşam TeknolojileriPHG0311L37 °C Ilık; Kullanmadan önce C su banyosu
İnsülin, İnsan Rekombinant, Çinko SolnLife Technologies12585-01437 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
TeSR-E8Kök Hücre Teknolojileri5940 37° C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
ROCK İnhibitörü (Y-27632)SelleckS104937 ° C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
MatrigelBD Biosciences354277hESC Nitelikli Matris, LVED Ücretsiz
RNeasy Mini Kit Qiagen74104
iScript cDNA Sentez KitiBio-Rad170-8890
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)Termo-ScientificK1081
FBS NitelikliSigma AldrichF617837 °C &°C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Adenin BioreagentSigma AldrichA2786-5G37 ° C'de sıcak; C kullanmadan önce su banyosu
Vibrio cholerae< / em>Sigma AldrichC8052-.5MG'den37 derecede sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
HidrokortizonSigma AldrichH0888-1G37 ° C'de ısıtın; Kullanmadan önce C su banyosu
Sigma AldrichT0665-50MG'denHolo-transferrin37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
3,3 ',5-Triiyodo-L-tironin sodyum tuzuSigma AldrichT6397-100MG37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
DAPI Santa Cruz BiyoteknolojiSC-3598
Fluoromount Susu montaj ortamıSigma AldrichF4680
%16 ParaformaldehitAlfa-Aesar43368
Antikorlar
Mouse anti CD44 - FITC ile etiketlenmiş BD Biosciences560977
Fare anti CD146 - PE ile etiketlenmişBD Biosciences561013
Fare anti CD73 - PE ile etiketlenmişBD Biosciences561014
Fare anti-&alfa;-düz kas aktiniSigma AldrichA2547
Fare anti-VimentinAbcamab8978-100
Fare Anti - TRA-1-81Yaşam Teknolojileri411100
Tavşan anti Ekim 3/4Santa Cruz BiyoteknolojiSC-9081
Fare Anti DistrofinLeica BiosystemsNCL-DYSB
Kolera Toksini İnsan

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
  2. Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
  3. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  4. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
  5. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  6. Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).
  7. Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
  8. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
  9. Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
  10. Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
  11. González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
  12. Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504(2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sendai Vir s ile Yeniden ProgramlamaEntegrasyonsuz Y ntemYamanaka Fakt rleri Transd ksiyonuPluripotens Do rulamasAk Sitometrik AnalizTers Transkriptaz PCRKardiyomiyosit Diferansiyasyonu

İlgili makaleler