Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yenidoğan Farelerde intravenöz enjeksiyonlar

61.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52037

⸱

11 Kasım 2014

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Ohio State University, 2Center for Gene Therapy, Nationwide Children's Hospital Research Institute, Ohio State University

Bu makalede

Özet

Pediatrik hastalığın hayvan modelleri erken başlangıçlı ve agresif hastalığın ilerlemesini yaşayabilirsiniz. Klinik genç fare modelleri ile ilgili tedavi teslimat teknik olarak zor olabilir. Bu protokol, yaşamın ilk iki doğum sonrası gün içinde yeni doğmuş fareler için invazif olmayan bir damar içi enjeksiyon yöntemi tarif etmektedir.

Özet

İntravenöz enjeksiyon, terapötikleri sunmak için bir klinikte uygulanabilir tarzıdır. Yetişkin kemirgenler ve büyük hayvanlar için, intravenöz enjeksiyon teknik olarak mümkün ve rutin vardır. Ancak, bazı fare modelleri potansiyel tedavilerin uygulanması zorlaştırır hızlı ilerlemesi ile hastalığının erken başlangıçlı olabilir. Temporal (veya yüz) ven sadece farelerde kulak tomurcuk ön ve bir mikroskop kullanarak başın iki tarafında doğumdan sonra da açıkça ilk iki gün boyunca görünür durumdadır. Bu pencerede, zamansal damar 50 ul hacme kadar enjekte edilebilir. Enjeksiyonu güvenli ve iyi yavrular ve barajlar ikisi tarafından tolere edilir. Tipik bir enjeksiyon yöntemi yavru kafese bunun ardından 1-2 dakika içinde tamamlanır. Üçüncü doğum sonrası gün ven görselleştirmek için zordur ve enjeksiyon prosedür teknik güvenilmez hale gelir. Bu teknik, adeno-ilişkili virüs (AAV) Vect verilmesi için kullanılmaktadırbu da seçilen viral serotip bağlı olarak hayvanın yaşam için yaklaşık vücut geniş dengeli transgen ekspresyonunu sağlayabilir ORS.

Giriş

Pediatrik hastalığı olan kemirgen modellerinde merkezi sinir sistemi (MSS) için terapötiklere teslimi bir sorundur. Model yenidoğan hastalık durumları doğrudan merkezi sinir sistemi içinde uygun yapıların enjekte etmek zor olabilir, bu nedenle cılız ve gelişimsel olgunlaşmamış ve olduğunu fareler. Terapötik maddelerin damar içi enjeksiyonu CNS 1-5 ve 3,5-9 retinanın da dahil olmak üzere bütün vücuda hücreleri, uyuşturucu ya da viral vektörler sunmak için invazif olmayan, iyi tolere edilen bir yöntemdir. Önceki yayınlar bir diseksiyon mikroskobu 11,12 olmadan, bir transilluminator 10,11 kullanarak zamansal yüz damar enjeksiyonu tarif veya iki birey gerektiren 10 enjekte etmek. Tek tek yavrular enjekte edebilir ve ışık kaynağı zamansal damar, yavru değen bir sabit yüzeye göre bir ameliyat bandı duyulan ihtiyacı ya da bir yavru yapışmalarını ortadan kaldırmamaktadır görüntülemek için, bu protokol açıklanan enjeksiyon tekniği avantajlıBir transilluminator 11 gibi. Farelerde adeno-ilişkili viral vektör serotip 9 (AAV9) teslim beyin ve omurilik (Şekil 1) boyunca nöronlar ve astrositlerde sağlam ifadesini üretir. Yüzeysel zamansal yüz damar içine viral vektörlerin damar yoluyla verilmesi güvenilir bir çocuk nöromüsküler bozukluğun spinal kas atrofisi (SMA) 2,4,13,14 tedavi etmek için yeni doğan farelerin çeşitli çalışmalarda kullanılan ve sonunda tedavi edilen farelerin ömrünü arttırılmıştır.

Neonatal farelerin damar içi enjeksiyonu, aynı zamanda etkin bir şekilde, periferal sinir sistemi ve periferal organların (Şekil 2) hedefler. AAV enjeksiyonunun ardından, dorsal kök gangliyon, karaciğer, kalp, iskelet kası, akciğer, gut miyenterik pleksus transdüksiyon 1,3,6,7,15 gözlenmiştir. MSS ve çevrenin yaygın transdüksiyon küresel ifadesini gerektiren hastalıklar için enjeksiyon bu ideal yöntem yaparBu tür Gaucher hastalığı 16 ve diğer lizozomal depo hastalıkları 17,18, geçinmek hastalığı ve ilişkili nöronal seroıd lipofuksinoz, 19 ve Bardet-Biedl sendromu, erken çocukluk 20 meydana gelen belirtilerle başlayan bir genetik multisistemik bozukluk gibi bir transgen. Yenidoğan farelere damar içi enjeksiyonu, aynı zamanda modelleme sistem genelinde çocuk hastalıkları için yeni bir metod olarak kabul edilmelidir. Bu teknik büyük hayvan modellerinde 5,21 için tercüme edilmiştir ve damar içi enjeksiyon zaten terapötikleri teslim klinik olarak kabul edilebilir bir yöntem olarak var.

Geçerli protokol doğum sonrası 2. gün Enjeksiyon daha geç yüzeysel zamansal yüz damar yoluyla yenidoğan farelere ajanları sunan basit, etkili bir yöntem tanımlayan bir tek tamamlanabilir, bireysel uygulanan ve iyi yavrular ve barajlar ikisi tarafından iyi tolere edilir. Yavrular az sıkıntı yaşayabilirsiniz ve hızlı bir şekilde kurtarmak. ImportanTLY, Başarılı bir enjeksiyon olarak uygulanan maddenin küresel uygulanmasına neden olur. Bu protokol, viral vektörler, yeni doğmuş farelerin farmasötik maddelerin veya bir hücre sağlanması için uygun değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Protokolde belirtilen tüm işlemler Ohio Devlet Üniversitesi Hayvan Kullanım ve Bakım komitesi (IACUC) Enstitüsü onaylanmıştır.

Çalışma alanı hazırlanması 1.

  1. Çöp, bir mikroskop, 90 ° enjeksiyon (bir ışık kaynağı kullanımı bir açıyla yerleştirilmiş bir ışık kaynağından barajı ayırmak için, boş bir kafes fare yavrular uyutmak için ıslak buz toplamak   enjeksiyon yerinde açı ven), enjeksiyon için hayvan yerleştirmek için temiz bir yüzey, pamuklu, 3/8 "30 G iğne (hayvan başına) ve% 1 Evans Blue Dye ile 3/10 cc insülin şırınga (gizlemektedir eğitim için fosfat tamponlu salin (PBS)) çözeltisi ile yapılır.
  2. Yavrular işlenirken ayrı bir kafese baraj çıkarın.

2. Enjeksiyon Yöntemi

  1. Hayvan uyutmak için 30-60 saniye boyunca ıslak buz üzerinde doğrudan bir tek yavru yerleştirin. T bırakmayınnedeniyle ventriküler fibrilasyon, doku hipoksi ve metabolik asidoz dahil hipotermi ile ilişkili komplikasyonların riski çok uzun buz üzerinde o hayvan.
    NOT: tecrübemiz 30-60 saniyelik bir enjeksiyonu sağlamak için yavru hareketleri yavaş için yeterli olmasıdır. Derin anestezi gerekiyorsa, bu tür 1-2 izofluran% olarak inhalantların uygun olabilir.
  2. Hayvan buz üzerinde iken, Evans mavi boya, 30 ul şırınga yükleyin.
  3. Hayvan tamamen uyuşturulduktan zaman, hala nefes alırken buz üzerinde hareket eksikliği tarafından onaylandıktan mikroskop altında hareket ettirin. Sağ elli bir enjeksiyon için sağa hayvanın ağzını yüz. Kulak tomurcuk parmağı ve orta parmak (Şekil 1) arasında olacak şekilde kulak tomurcuk namlu ve sol orta parmak kuyruğu üzerinde sol işaret parmağını yerleştirin.
  4. Sadece cilt manipüle edildiğinde hareket yüzeysel kılcal için kulak tomurcuk ön Schulabschluss. Bu kılcal Ancak, hedef değilkimlik zamansal damar tanınmasında önemlidir. Sonra, ne olursa olsun cilt pozisyon sabit kalır kılcal aşağı bir karanlık, karanlık ven bulun. Temporal damar, gölgeli görünür dorsal ventral çalışır ve juguler ven (Şekil 1) beslenir.
  5. Iğne konik yukarı zamansal ven girin. Doğru takılırsa, o iğne konik deri yoluyla kan ile doldurmak görmek mümkündür. Sonra yavaş yavaş piston bastırın ve not yüzün tarafında aşağı ven beyazlaşma.
  6. Iğne injectant geri akmasını önlemek için ilave bir 10-15 saniye ven içinde kalmasını sağlar.

3. Post-enjeksiyon

  1. Uygun bir enjeksiyondan sonra, yavru hemen mavi dönmelidir. İğneyi çıkarın ve kan pıhtıları kadar enjeksiyon yerinde bir pamuklu bir bez uygulamak için yumuşak güç kullanmayın.
  2. Sıkıntı belirtileri yavru izleyin. Yavru 2-3 dk kurtarmak ve yeniden ısıt için izin ver, ryavru kafesine dönmeden önce, bilinçli dik ve hareketli olduğunda ecognize. Kupa araştırmacının eldivenli elinde yavrular gerekirse kazanılmasında yardımcı uygun sıcaklık sağlamak için. Alternatif olarak, enjekte yavru ısınma kolaylaştırmak için evde kafes altında bir ısıtma yastığı yerleştirin. Genellikle, bir Evans mavisi enjeksiyonundan sonra, yavrular euthanize. Test malzemesi enjekte ederken boya dahil etmeyin.
  3. Geri eve kafese yavru yerleştirin ve yavru baraj tarafından reacceptance sağlamak için yatak ve / veya nestlet ile kaplanmış olduğundan emin olun.
  4. Sterilite korumak için her yavru için yeni bir şırınga ve pamuklu çubuk kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Uygun bir enjeksiyon sırasında, damar anlık açık veya blanch dönmelidir. Boya enjekte Eğer tüm yavru saniye içinde mavi dönmelidir. Bir yanlış enjeksiyon meydana gelmiş ise, genellikle enjeksiyon yerinde dışarı sızabilir baş veya boyun ve injectant bir konsantre subkutan bolus var. Yanlış enjeksiyonları da boğaz çevresinde morarma görünüme neden olabilir. (Enjeksiyon tam ven teslim edilmedi yani) genellikle hiçbir kötü yan etkileri karşılaşabilirsiniz ve düzgün enjekte fareler gibi rutin tedaviye yanıt derialtı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Merkezi sinir sistemine veya tüm vücutta maddelerin damar yoluyla verilmesi hastalık yenidoğan sıçan modellerinde zordur. Açıklanan protokol intravenöz minimal teçhizatı gereksinimleri ile yenidoğan farelerin içine çözümleri yönetmek için hızlı, nispeten non-invaziv bir yoludur. Zamansal yüz damar çıplak gözle görülebilir rağmen, enjeksiyonlar özellikle bir unpracticed enjektör, mikroskop ve fiber-optik ışık kaynağı kullanımı ile daha doğru olabilir. Yenidoğan farelerde damar içine enjeksiyona yüksek bir başarı oranı

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar mali destek SMA NINDS, FightSMA ve aileleri kabul etmek istiyoruz. Segl NINDS eğitim bursu # 5T32NS077984-02 tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Thinpro insülin şırıngasıTerumoSS30M30093/10 cc, 3/8" iğne, 30 G, fare başına 1
adet Evans mavi boyaSigma-AldrichE21291x Fosfat Tamponlu Tuzlu Su ile %1'e seyreltin
Pamuk uçlu aplikatörlerFisher Scientific23-400-101
Fiber optik ışık kaynağıFisher Scientific12-562-36
Diseksiyon mikroskop

Kaynaklar

  1. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nature. 27, 59-65 (2009).
  2. Dominguez, E., et al. Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice. Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).
  3. Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, 3505-3518 (2011).
  4. Foust, K. D., et al. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat Biotechnol. 28, 271-274 (2010).
  5. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
  6. Bostick, B., Ghosh, A., Yue, Y., Long, C., Duan, D. Systemic AAV-9 transduction in mice is influenced by animal age but not by the route of administration. Gene Ther. 14, 1605-1609 (2007).
  7. Miyake, N., Miyake, K., Yamamoto, M., Hirai, Y., Shimada, T. Global gene transfer into the CNS across the BBB after neonatal systemic delivery of single-stranded AAV vectors. Brain research. 1389, 19-26 (2011).
  8. Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Human molecular genetics. 21, 1625-1638 (2012).
  9. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  10. Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 46, 50-54 (2007).
  11. Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J. vis. Exp. (56), (2011).
  12. Sands, M. S., Barker, J. E. Percutaneous intravenous injection in neonatal mice. Laboratory animal science. 49, 328-330 (1999).
  13. Bevan, A. K., et al. Early heart failure in the SMNDelta7 model of spinal muscular atrophy and correction by postnatal scAAV9-SMN delivery. Human molecular genetics. 19, 3895-3905 (2010).
  14. Valori, C. F., et al. Systemic delivery of scAAV9 expressing SMN prolongs survival in a model of spinal muscular atrophy. Science translational medicine. 2, (2010).
  15. Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19, 61-70 (2008).
  16. Guggenbuhl, P., Grosbois, B., Chales, G. Gaucher disease. Joint, bone, spine : revue du rhumatisme. 75, 116-124 (2008).
  17. Daly, T. M., Vogler, C., Levy, B., Haskins, M. E., Sands, M. S. Neonatal gene transfer leads to widespread correction of pathology in a murine model of lysosomal storage disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2296-2300 (1999).
  18. Daly, T. M., Ohlemiller, K. K., Roberts, M. S., Vogler, C. A., Sands, M. S. Prevention of systemic clinical disease in MPS VII mice following AAV-mediated neonatal gene transfer. Gene Ther. 8, 1291-1298 (2001).
  19. Wang, S. Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses. Advances in experimental medicine and biology. 724, 138-142 (2012).
  20. Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome. European journal of human genetics. 21, 8-13 (2013).
  21. Bevan, A. K., et al. Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders. Mol Ther. 19, 1971-1980 (2011).
  22. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
  23. Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nature biotechnology. 27, 804-805 (2009).
  24. Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21, 2148-2159 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

ntraven z EnjeksiyonTemporal VenFare YavrularAAV Vekt rleriGFP EkspresyonuDiseksiyon Mikroskobuns lin Enjekt rEvans Blue BoyasPostnatal G n
Yenidoğan Farelerde intravenöz enjeksiyonlar
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.