Pseudomonas aeruginosa bakterisinin intratrakeal enjeksiyonu ile bir fare akciğer hasarı modeli geliştirdik. Bu model pnömoni sırasında akciğer hasarını taklit eder ve klinik olarak önemlidir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Insan akut akciğer hasarı ve pnömoni incelemek üzere, bu hastalığın çeşitli patolojik özelliklerini taklit etmek için hayvan modelleri geliştirilmesi önemlidir. Burada bakteriler Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa veya PA) intra-trakeal enjeksiyon yoluyla fare akciğer hasarı modeli geliştirdik. Bu modeli kullanarak, yaralanma erken dönemde akciğer iltihabı gösteren başardık. Buna ek olarak, alveol epitel bariyer leakiness bronkoalveoler lavaj (BAL) analiz ederek gözlenmiştir; ve alveolar hücre ölümü yaralı akciğerlerinden hazırlandı doku kullanılarak TÜNEL tahlili ile gözlemlenmiştir. Yaralanmasının ardından daha sonraki bir aşamada, biz tamir işlemi için gerekli hücre çoğalmasını gözlendi. Yaralanma 7 gün P. başlatılmasından çözüldü aeruginosa enjeksiyon. Bu model pnömoni sırasında akciğer iltihabı, yaralanma ve onarım sıralı ders taklit eder. Bu klinik açıdan anlamlı hayvan modeli f, onarım mekanizmasını patolojiyi incelemek için uygundurakut akciğer hasarı ollowing ve bu hastalık için potansiyel bir terapötik maddelerin test edilmesi için kullanılabilir.
Giriş
Akciğerler çevresel patojenlere maruz ve inflamasyon ve yaralanma 1-3 yatkındır vardır. Pnömoni veya yetişkinlerde solunum zorluğu sendromu (ARDS) gibi patolojik durumları sırasında, lökositler tarafından salgılanan patojen hem de enflamatuvar etkenlerin alveol hücreleri 1-3 yaralanma ve ölümünü indükler. Bu onarım yaralanma patoloji çalışma yanı sıra mekanizmasını kolaylaştırmak için akut akciğer hasarı hayvan modellerinin geliştirilmesi önemlidir.
Şu anda, çoğu insan hiperoksia ve Bleomisine bağlı fare akciğer hasarı modellerini 4 kullanın. Ancak, hiperoksinin mekanizmaları yaralanma pnömoni veya ARDS 5 sırasında ortaya en sık akciğer yaralanmaları gibi aynı değildir neden oldu. Bleomisin ile oluşturulan akut hasarı klinik bağlamda 4 nadirdir. Burada P. içi trakeal enjeksiyon kullanılarak fare akciğer hasarı modeli rapor aeruginosa 6,7. Bu model klinik olarak önemlidir, ve taklit ppnömoni 8 Aşağıdaki olur rocesses.
Bağışıklığı baskılanmış kişilerde bir fırsatçı, hastane patojen, P. gibi aeruginosa genellikle pulmoner sistem, üriner sistem, yanıklar, yaralar bozar, hem de diğer kan enfeksiyonlarına 6 neden olur. Bakteriler, virulans faktör ekzotoksin A serbest çarpma ve immün yanıtları 6 tetikler. P. içi trachael yönetim aeruginosa pnömoniye neden bakteri insan maruz kalma durumunu yansıtan ve patoloji son bildirilen grip virüsü H1N1 kaynaklı akciğer hasarı modelinde 9 farklı olması muhtemeldir. P. yana aeruginosa o daha öldürücü patojenlerin bazı karşılaştırıldığında işlemek için nispeten güvenli bir fırsatçı patojendir. Gözlemlediğimiz, çünkü burada bu yöntemin kıyasla akciğerin en uzak alveol bölgesine daha fazla bakterilerin ortaya koyduğu bakterileri yönetmek için içi trakeal enjeksiyon kullanılanBöyle ağız yoluyla bir kateter kullanarak gibi diğer bazı prosedürler.
Diğer akut akciğer hasarı modelleri ile karşılaştırıldığında, S. Burada açıklanan model, aeruginosa, bakterilerin ve aşırı iltihaplanma ile kaynaklı akciğer hasarı çalışmak için uygundur. P. kullanan diğer hayvan modellerinde farklı aeruginosa burada lokalize akut akciğer hasarı oluşturmak için bu bakterilerin içi trakeal enjeksiyon kullanımı, sepsis 10,11 ikna etmek.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan deneyleri Chicago Illinois Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi ve Kurumsal Biyogüvenlik Komiteleri tarafından onaylandı.
NOT: maskesi, göz koruması, önlük veya tulum, ve çift eldiven: pseudomonas kapsayan tüm işlemler bunlarla sınırlı değildir Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL2) uygulamaları ile yapılmalıdır. Sertifikalı Biyogüvenlik Kurulu çalışın. Çamaşır suyu veya klor dioksit bazlı dezenfektan ile bakteri ile temas aletleri davranın. Taşıma örnekleri için bir kapalı kutu kullanın.
1. P. aeruginosa Kültür ve Büyüme
- Mağaza P. -80 ° C de dondurarak saklamaya uygun vialler bir vidalı başlık bakteriyel bir stok olarak aeruginosa, PA103.
- % 70 etanol ıslatılmış kağıt havlu ile bir kutu içinde bir rafa yerleştirin flakon ve Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL2) laboratuvara götürmek.
- Şerit koyun kanı agar plakalarına bakteri ve bir kuluçka makinesi içinde 15 saat ~ 37 ° C'de büyütülmüştür.
- Bir BSL2 kaputu, 5 ml PBS içinde bakteri döngü ve tekrar süspansiyon ile plaka bakterileri çizebilir.
- 3 aya kadar 4 ° C 'de stok saklayın. Bununla birlikte, titre her 2 haftada bir belirler.
- Seri olarak (01:10 ila 7 01:10 4 genellikle) PBS içinde bakteri sulandırarak koyun kanı agar plakaları üzerinde bilinen seyreltme plaka.
- ~ 15 saat süreyle inkübe edin. Kolonileri sayın ve bakteri konsantrasyonunu belirlemek için Koloni Oluşturma Birimi (CFU) hesaplayabilirsiniz.
- Uygun konsantrasyonlarda yeniden süspanse edin (~ 5 x 10 3 CFU / ml), 1.5 ml steril vida kapaklı bir küçük cryovials içinde 0.5 ml PBS içinde. Kriyotüplerin Seal ve bir çırpıda kapaklı kutu dezenfektan yüklü kağıt havlu üzerinde kriyotüpe rafa koyun.
- BSL2 hayvan tesisine kutusuna taşıyın. Bir kez orada, BSL2 kabinede kutusunu açmak.
2. P. aeruginosa damlatma
- Sağkalım cerrahi aseptik (steril eldiven, steril aletler gerçekleştirinVe aseptik teknikler). Steril (otoklav) cerrahi aletler için bir çalışma yüzeyi sağlamak için steril örtüyü kullanın. Her trakea İnstilasyon prosedür arasında sıcak bir boncuk sterilizatör kullanılarak aletleri sterilize.
- Anesthetization önce fareler tartılır. Ketamin (100 mg / kg), ksilazin (5 mg / kg) ile fareler anestezi 0.1 - 0.2 ml PBS intraperitoneal (ip). Ayak tutam cevapsızlıktan tarafından anestezik etkinliğini belirlemek. Anestezi altında kuruluğunu önlemek için gözleri bir veteriner merhem kullanın.
- BSL2 kabinede bir cerrahi gemide fareler dizginlemek.
- Kesim aşağı için bölgeyi belirlemek. Bu alanı tıraş ve 3 kez alkol ve povidon iyot bezlerden alternatif kullanılarak cildi hazırlar.
- Bu anestezi gibi trakea erişmek için bir cilt kesisi olarak küçük bir ameliyat için yeterli olduğu gibi lokal anestezi (lidokain) ile kesi alanı davranın.
- Boyun orta hatta küçük bir kesi (yaklaşık 5 mm) yapmak, ve künt f kullanınorceps hafifçe trakea erişim için kas taşımak için. Cerrahi diseksiyon ile trakea Açığa.
- 27 G iğne ile 1 ml tek kullanımlık enjektöre bakteri çözüm çizin. Her bir fare için, uygun konsantrasyonda (10 5 CFU her bir fare kadar) bakteri 20-30 ul uygulayın.
- Trakea içine iğne takın. Trakea içine yavaş yavaş bir çözüm enjekte edilir.
- Genellikle bu çözümü gösterir hayvan soluk soluğa, akciğere ulaştığını emin olun.
- Aseptik koşullarda steril sütür (6-0 lifli) ile yarayı kapatın.
- 0.1 mg / ameliyat sonrası ağrıyı kontrol etmek için post-op analjezi gibi deri altı enjeksiyon yoluyla kg buprenorfin kullanın.
- Kapatma insizyon ilk anestezi indüksiyon gerekli süre en az 15 dk olduğundan emin olun.
- Enjeksiyonundan sonra, uygun bir biyolojik tehlikeli kabın içinde şırınga ve iğneler atmayın.
- Klor dioksit bazlı bir dezenfeksiyon cerrahi aletler davranınnfectant 15 dakika için durulayın ve sterilizasyon için laboratuar dönmek ve gerektiğinde yeniden.
- Tek başına sıcak bir ortamda temiz kafeslerde ev fareler.
- Bu bilinç kavuşur ve hareket edene kadar hayvanın her 30 dakikada kontrol edin; ve daha sonra da ilk 3 gün sonra, cerrahi için 12 saatlik aralıklarla.
- Deney boyunca, hayvan BSL2 tesiste fareler tutun. Mühürlü kutuda bulunan tek doku hayvan BSL2 tesisi bırakır emin olun. Fareler can çekişen davranışların bir ifade halinde çalışmada herhangi bir noktada (solunum güçlüğü, uyuşukluk, yumuşak bir uyarıya yanıt olarak ambulasyon durum olarak tanımlanmaktadır), servikal dislokasyon bir şişe bir kaynaktan CO2 soluma ile farelerin euthanize.
- Anestezi altında kanı akıtılarak deneysel konuyu euthanize.
- Öldürülen farelerin akciğer dokusunu toplayın. Bir BSL2 kaputu bu işlemleri yürütmek. Gerekirse, rac içinde yerleştirilmekte, tüpler kullanılarak örnek aktarmakdaha fazla işlem için bir çırpıda kapaklı kutu dezenfektan yüklü kağıt havlu üzerinde k.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
72 saat sonrası P. - 24 başlayarak aeruginosa enjeksiyonu artan hücreli (Şekil 1A-D), akciğer bölümleri gözlenmiştir. Akciğer 96 saat sonrası yaralanma (Şekil 1E) kurtarmak için başladı. 7 gün sonra, P. yayınlamak aeruginosa normal alveol morfoloji büyük ölçüde (Şekil 1F) restore edildi. Tünel boyama kullanılarak akciğer kesitleri 24 saat sonrası P. hazırlanmış aeruginosa, alveol hücreleri (Şekil 1 G-I) 'de,<...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz burada açıklamak Pseudomonas fare akciğer hasarı modeli akut akciğer hasarı veya zatürre sonrası oluştuğu inflamasyon, akciğer hasarı, onarım, ve çözünürlük tüm süreci taklit eder. Bu, klinik olarak ilgili ve içerisinde nispeten güvenli ve kullanımı kolay olduğu birçok başka yaralanması modelleri ile karşılaştırıldığında eşsiz avantajlara sahiptir.
Prosedürdeki kritik aşama bakteri çözeltisi, enjeksiyon çok yavaş olması gerekiyor. Enjeksiyon çok hızlı ise, fareler bobini tarafından ölme ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri HL105947-01 (YL), HL07829-16 (), HL090152 () tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anestezik: Ketamin, ksilazin, lidokain, buprenorfin | farmasötik sınıf | ||
| 27 G iğne | Fisher | 1482648 | |
| şırınga | Fisher | 14823434 | 1 ml |
| makas | Güzel Bilim aletleri | ||
| forseps | Güzel Bilimler aletleri | ||
| sütür | Fisher | 19-037-526 | |
| Göz ölçer, eldiven, önlük | |||
| Biyogüvenlik Kabini | |||
| klor dioksit bazlı dezenfektan | Clidox | ||
| koyun kanı agar plakaları | Medex kaynağı | HL-1160 |
Kaynaklar
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Shimabukuro, D. W., Sawa, T., Gropper, M. A. Injury and repair in lung and airways. Crit Care Med. 31 (8), 524-531 (2003).
- Wansleeben, C., Barkauskas, C. E., Rock, J. R., Hogan, B. L. Stem cells of the adult lung: Their development and role in homeostasis, regeneration, and disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 131-148 (2013).
- Singleton, P. A., et al. Dynamin 2 and c-abl are novel regulators of hyperoxia-mediated nadph oxidase activation and reactive oxygen species production in caveolin-enriched microdomains of the endothelium. J Biol Chem. 284, 34964-34975 (2009).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J. W., Prince, A. S. Pathogen-host interactions in pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1209-1223 (2005).
- Liu, Y., et al. Foxm1 mediates the progenitor function of type ii epithelial cells in repairing alveolar injury induced by pseudomonas aeruginosa. J Exp Med. 208, 1473-1484 (2011).
- Kurahashi, K., et al. Pathogenesis of septic shock in pseudomonas aeruginosa pneumonia. J Clin Invest. 104, 743-750 (1999).
- Kumar, P. A., et al. Distal airway stem cells yield alveoli in vitro and during lung regeneration following h1n1 influenza infection. Cell. 147, 525-538 (2011).
- Delano, M. J., et al. Sepsis induces early alterations in innate immunity that impact mortality to secondary infection. J Immunology. 186, 195-202 (2011).
- Lange, M., et al. A murine model of sepsis following smoke inhalation injury. Biochem Biophys Res Commun. 391 (3), 1555-1560 (2010).
- Kobayashi, Y. The role of chemokines in neutrophil biology. Front Biosci. 13, 2400-2407 (2008).
- Matute-Bello, G., et al. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, L379-L399 (2008).
- Sadikot, R. T., et al. Targeted immunomodulation of the nf-kappab pathway in airway epithelium impacts host defense against pseudomonas aeruginosa. J Immunol. 176, 4923-4930 (2006).
- Pinto, I. L., et al. Development of an experimental model of neutrophilic pulmonary response induction in mice. J Pneumologia. 29, 213-214 (2003).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
