Sigara litik Ekzositoz görselleştirme Cryptococcus neoformans Dijital Işık mikroskopi ile Makrofagların gelen

Summary

Biz makrofaj C görselleştirmek için nasıl açıklar neoformans (Cn) dijital ışık mikroskobu kullanılarak litik olmayan ekzositoz sürecine özel vurgu ile gerçek zamanlı etkileşim,. Ayrı ayrı enfekte makrofajlar bu tekniği kullanarak bu olayın çeşitli yönlerini belirlemek için ele alınabilir.

Abstract

Cryptococcus neoformans ile makrofajların enfeksiyonun pek çok yönü, geniş olarak araştırılmış ve iyi bir şekilde tanımlanmıştır. Ancak, açıkça anlaşılmış değildir belirli bir etkileşim olmayan litik ekzositoz olduğunu. Bu işlemde, maya hücreleri, makrofajlar ve Cn uygulanabilir hem yaprak, az anlaşılmış bir mekanizma ile hücre dışı alana salınır. Burada, zaman lapsed mikroskobu ile 24 saatlik bir enfeksiyon dönemi için ayrı ayrı enfekte makrofajlar çok sayıda takip açıklanmıştır. Enfekte olmuş makrofajların, bir hücre kültürü inkübatöründe olduğu gibi aynı şartlar sağlayan bir mikroskop bağlı bir _CO2 atmosfere sahip bir ısıtma odasına yerleştirilmiştir. Canlı dijital mikroskopi statik görüntülerin mevcut olmayan bir ev sahibi ve patojen arasındaki dinamik etkileşimleri hakkında bilgi verebilir. Tersi makrofajlar mantar enfeksiyonları nasıl idare için ipuçları sağlayabilir ve her enfekte hücreyi görselleştirmek için güçlü olmak. Bu teknik, ıkarmaşık bir fenomenin arkasında dinamikleri okuyan sa güçlü bir araçtır.

Introduction

Kriptokokal hücreleri ve makrofajlar arasında bir mantar enfeksiyonunun safhaları ^1-3 belgelenmiştir. Maya hücreleri, makrofajlar tarafından sindirilen sonra etkileşimlerin çeşitli oluşabilir: makrofaj hücre dışı alanı içine mantar yükünü serbest lize olabilir veya hücresel membran ⁴ sınırları içinde maya hücrelerini tutarak enfeksiyon kontrolü olabilir. Litik olmayan ekzositozu, bir makrofaj çevredeki ortama kriptokokal hücrelerin bazı veya tüm expunged bir işlemdir ya da komşu hücre ve ana ve hem de patojen ⁵ canlı kalır: Bununla birlikte, birkaç yıl önce, yeni bir sonuç iki grup ile bağımsız bir şekilde tanımlanmıştır ^-8. Çeşitli çalışmalar bu etkileşimin ardındaki moleküler mekanizmalarını anlamaya çalıştılar ama biz hala bu fenomen neyin tam bir kavrayışa sahip değilsiniz.

Yeteneği, gerçek zamanlı görüntü yakalama ve sonradan birden Infect analized makrofajlar bir mantar enfeksiyonu sırasında morfoloji ve makrofajlar hatta stres zamanlaması, mekansal kapasite, değişim ile ilgili olmayan litik eksositoz çevreleyen fiziksel özellikleri hakkında birçok sorulara cevap verir. Hücreler bir kuluçka karşılaştırılabilir bir ortamda muhafaza edilecek izin, biz makrofaj-mantar hücre etkileşimlerinin dinamik doğasını belirti. Araştırmacılar, bu sürecin çeşitli bileşenleri incelemek için bu tekniği kullandık. Başka bir grup litik olmayan ekzositozu protein alanlarının çekirdek YIKAMA ¹⁰ silinen oldu hücrelerde bloke olduğunu göstermek için bu yöntemi kullanan Bu işlemde fagozomun rolü, floresan lekelenmesi ve aktin bloke edici maddeleri kullanılarak açık ⁹ yapılmıştır. Sitokin sinyallerinde etkisi de gerçek zamanlı mikroskobu ¹¹ kullanılarak tespit edilmiştir. Bu işlem, C bunlarla sınırlı değildir bunun gibi neoformans, Candida albicans gözlenmiştir anothemakrofajlar ¹² bulaştırmak için yeteneğine sahiptir mantar patojen r. Bu bulgular bu yöntem hakkında o kadar az şey biliyoruz bir alana bir bilgi zenginliği sağlayabilir nasıl örnekleridir.

Protocol

Tüm hayvan çalışma mevzuatına ve Albert Einstein Tıp Koleji Hayvan Araştırmaları Enstitüsü kurallarına uygun olarak yapıldı.

C. 1. Yetiştirilmesi neoformans H99 (serotip A)

1. Bireysel C büyütün Sabouraud agar plakaları üzerinde neoformans (Cn) kolonileri.
2. Bir gün önce deney, tek bir koloni seçip Sabouraud suyu 10 ml aşılamak.
3. Kültür 250 rpm bir hızda çalkalanarak 37 ° C'de bir gece boyunca büyümeye izin verin.

2. İzolasyon ve C57 Primer Kemik Makrofagların Hazırlık / BL6 Fareler

1. Artık nefes kadar bir _CO2 odasına hayvana yerleştirerek fareler öldürülür. İkinci bir önlem olarak, cervically diseksiyonu başlamadan önce, boyun yerinden. % 70 etil alkol ile tüm vücut sterilize.
2. Steril DMEM'de hem femur ve tibia ve yer kemikleri çıkarın.
3. Aşırı doku ve kas DE kullanarak sökünKemikler tamamen temizlenene kadar licate mendil.
4. % 70 etil alkol içeren bir Petri kutusu sadece sağlam kemikleri yerleştirin ve ilgili mikroorganizmaları öldürmek için 3 dakika boyunca inkübe edin. Steril DMEM ile Petri kabındaki kemikleri ve yer çıkarın.
5. Dikkatle kemiklerin uç kesti. Boş bir 50 ml konik tüp, buz üzerine yerleştirildi ve her bir kemik içinden bir 25 G iğne kullanılarak soğuk DMEM, 10 ml dikkatli bir hizada fazla kemik tutun.
   NOT: Her fare 4 kemikleri (2 femur, tibia 2) verecektir. Bu nedenle, bir fare hücre süspansiyonu yaklaşık olarak 40 ml elde edilmelidir.
6. 650 x g'de 10 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüje hücre süspansiyonu.
7. Bu Santrifüj sırasında hazırlamak ve filtre kemik iliği makrofaj% 20 L929,% 10 fetal dana serumu,% 10 NCTC-109,% 1 Pen-strep,% 1 HEPES,% 1 L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM ortamı oluşur besleme sterilize , temel olmayan amino asitler,% 1,% 0.1 2-mersaptoetanol eklenir.
8. Besleme ortamı 10 ml ile yeniden süspanse edilen topak. Hücre esas asma geçmekhücre kümeleri bozabilir ve büyük enkaz kaldırmak için 70 mikron hücre süzgecinden iyon.
9. Levha (10 plakaların toplam) doku kültürü kullanılmak üzere optimize edilmiştir Petri tabaklarında besleme ortam 10 ml hücre süspansiyonu 1 mi.
10. Hücreler% 10 _CO2 ile 37 ° C 'de yapışmaya izin verin. 7. günde, 3. günde taze besleme ortamı 5 ml tam ortam besleme ve makrofajlar kullanılmaya hazırdır değiştirin.
11. Deneyden önceki gün, besleme ortamı kaldırarak levhadan ayırmak ve makrofaj plaka reaktif sıyırma yumuşak bir hücrenin 5ml ekleyin.
12. 37 ° C'de 5-10 dakika süreyle inkübe ve hafif pipetle makrofajlar çıkarın.
13. 10 dakika boyunca 650 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri.
14. Medya besleme 1 ml içinde süspanse pelet. 1:20 seyreltme kullanılarak, bir haemositometre üzerine hücre süspansiyonundan 10 ul pipetleme makrofajların konsantrasyonunu hesaplamak.
15. Petri kapları 14 mm cam tabanı kullanarak, bir plakaşirketinden 200 ul maksimum kapasitesi iç kuyu üzerine 1 x 10 ⁵ makrofaj konsantrasyonu, bu yüzden, Şekil 4'te gösterildiği gibi, bu birimin aşmaması için dikkatli alır.
16. Hücreler 1 saat boyunca 37 ° C inkübatör yemekleri yerleştirerek cam bir Petri tabağına yapışma izin verin.
17. 500 U / ml, 1 mg / ml IFNg LPS ile takviye edilmiş ortam besleme 1-2 ml ilave edilir ve hücreler bir gece boyunca inkübe edin.

Primer sıçan makrofaj lan ve C. 3. alk kuluçkalama neoformans

1. Deney gününde, 420 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edilerek bir gece kültürü aşılandı ve pelet maya hücrelerinin 1 ml'sini uzaklaştırın.
2. Yukarıda belirtilen hızda ve zamanda polisakkarit glucuronoxylomannan (GXM) gibi medya ve hücre dışı kriptokoksik ürünleri kaldırmak için steril PBS ile hücreler 3 kez yıkayın.
3. 100 seyreltme: steril 1 ml PBS içinde yeniden süspanse ve hücre topağı, 1 olun. T pipetle 10 ulo bir haemocytometer üzerine seyreltme ve hücreleri saymak. 1 MOI'da maya hücreleri ekleyin: 5'tir. , 1 x 10 ⁵ makrofajlar bulunmaktadır, örneğin, / yuva, Cn 5 x 10 ⁶ / ml 'lik bir hücre süspansiyonu yapmak ve ⁵ x 10 5 Cn toplam bir miktarda bu çözeltiye 100 ul ilave edin.
4. 10 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda mAb 18B7 antikor ile besleme ortam 1 ml hücre süspansiyonu, kriptokokal hesaplanmış hacim. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bir hücre süspansiyonu inkübe edin.
5. Camdan besleme medyayı çıkartın Petri dipli çanak ve steril PBS ile 1x yıkayın. Iyi doğrudan opsonize Cn 100 ul ekleyin.
6. Hücreler% 10 _CO2 ile 37 ° C'de 2 saat inkübasyona izin verin.
7. Co-kuluçkasından sonra, makrofajlar Cn içselleþtirdikleri bu mikroskop ile kontrol edin. Içselleştirilmesi kabul edilmesi için, kriptokokal hücreler açıkça makrofaj sınırları içinde görülmelidir.
8. Steril PBS ile yıkayın Petri kabı, 3x her türlü extracellula kaldırmak içinr Cn.
9. 1-2 mAb 18B7 eklenmeksizin ortam besleme ml ve ayarlamak mikroskop ekleyin.

Dijital Işık Mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı 4. görselleştirme Non-litik Ekzositoz

NOT: CO ₂ teslimat ve bir ısıtma ünitesi gerekli içeren ekli bir kuluçka odası ile birlikte bir mikroskop bu deneyler gerçekleştirmek için.

1. Deneyden önce en az 30 dakika 37 ° C'de inkübe Kabin, önceden ısıtın. _CO2 birimi Deneyin başlangıcında% 5 okur emin olun.
2. Yer cam CO ₂ kapaklı kapak ve hiçbir ısı kaçar sağlamak için bütün kapılarını kapatmak, mikroskop platformda Petri dipli.
3. Faz kontrast mikroskop ile 10X objektif kullanılarak, enfekte makrofajlar net bir alana odaklanmak. Deney göre, üzerinde çalışılacak gerekir kaç makrofajlar tarafından kullanılan hedefi belirler.
4. Ta için mikroskop yazılımı kurmabir görüntüye 24 saatlik bir süre boyunca her 4 dakikada ke.
5. 24 saat sonra deney sona ulaştığını olacak ve 361 bir görüntü toplanan toplam olacaktır. 5% sıkıştırmada .jpegs olarak bu görüntüleri aktarın. Resim J yazılımı kullanarak, saniyede 5 kare Visual Stack olarak görüntüleyebilirsiniz. Film yayın veya sunum için inceledi gerekiyorsa, bir avi veya biçim izleyici için en iyi çalıştığını bağlı Mov dosyası ya olarak kaydedin.

Results

Bu tekniğin ürettiği görüntüler hücreleri C fagosite sonra ne çevreleyen bilgi toplamak için çeşitli şekillerde analiz edilebilir neoformans. Şekil 1'de görüldüğü gibi, enfekte edilmiş veya enfekte edilmemiş ya da yaklaşık 100 makrofajlar vardır. Bu makrofajlar her biri izleyiciye çok mikroskobik düzeyde konak-patojen etkileşimleri çalışmak için bir fırsat verir. Şekiller 2 ve 3'ün gibi, farklı bir makrofaj ve maya hücre arasında oluşabilir sonuçlar, hatta makrofaj mak...

Discussion

Burada, mantar-makrofaj etkileşimleri kaydedildi ve 24 saatlik bir süre boyunca gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir bir yöntemi tanımlamaktadır. Bizim laboratuvar olmayan litik ekzositoz zamansal açıdan birçok incelemek için bu protokolü kullandı ve bu süreci çevreleyen morfolojik bileşenleri tespit etmek için gerçek zamanlı mikroskobu kullanmaya devam edecektir.

Bu teknik, doğru sonuçlar elde etmek için özel bir dikkat protokol belirli adımlara verilmelidir. Çok fazla hücre hareketi ve ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sabouraud Dekstroz Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Dekstroz Suyu	BD	DF0382-17-9
Dubelcco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal Buzağı Serumu (FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Penisilin-Streptomisin	Gibco	15140-122
HEPES Tampon	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
Esansiyel Olmayan Amino Asitler	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Merkaptoetanol	Invitrogen	21985-023	Toksik
3003 Doku Kültürü Petri Kapları	Fisher Bilimsel	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek Cam Alt Kültür Tabakları	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Fare IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Laboratuvarımızda
Axiovert 200M Kuluçka Hazneli Mikroskop	Zeiss