Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

13.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52085

⸱

21 Aralık 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest University Health Sciences, 2The Ritchie Centre, Monash Institute of Medical Research, Monash University

Bu makalede

Özet

Mevcut iyi üretim uygulamaları (cGMP) yönergelerine uygun olarak hayvansal ürün içermeyen reaktifler kullanarak insan amnion epitel hücrelerini (hAEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Term veya preterm amniyon membranlarından türetilen insan amnion epitel hücreleri (hAEC'ler), rejeneratif tıp için potansiyel bir hücre kaynağı olarak araştırmacıların ve klinisyenlerin dikkatini çekmiştir. Bu ilginin nedeni, bu hücrelerin yüksek multipotent farklılaşma yeteneğine, düşük immünojenisiteye ve anti-inflamatuar fonksiyonlara sahip olduğuna dair kanıtlardır. Bu özellikler, araştırmacıları, klinik öncesi hayvan çalışmalarında çeşitli hastalık ve bozuklukları tedavi etmek için hAEC'lerin potansiyelini çok başarılı bir şekilde araştırmaya sevk etmiştir.

hAEC'ler, bir dizi hastalık ve bozukluğun tedavisi için yaygın bir uygulama alanı bulmuştur. HKEC'lerin potansiyel klinik uygulamaları arasında inme, multipl skleroz, karaciğer hastalığı, diyabet ve kronik ve akut akciğer hastalıklarının tedavisi yer alır. Klinik öncesi hayvan çalışmalarından klinik çalışmalara ilerlemek, hücre tedavisi ürünleri için daha yüksek bir kalite kontrol ve güvenlik standardı gerektirir. Güvenlik ve kalite kontrol hususları için, hücre izolasyon protokollerinin hayvansal ürün içermeyen reaktifler kullanması tercih edilir.

Araştırmacıların hayvansal ürün içermeyen reaktifler kullanarak hAEC'leri izole etmelerine, kriyoprezervasyon yapmalarına ve kültürlemelerine olanak tanıyan protokoller geliştirdik. Bu yöntemin avantajı, bu hücrelerin, uygun hücre verimlerini, canlılıklarını ve büyüme potansiyelini korurken, insanlara potansiyel olarak zararlı hayvan patojenleri verme riski olmadan izole edilebilmesi, karakterize edilebilmesi, dondurularak saklanabilmesi ve kültürlenebilmesidir. Klinik öncesi hayvan çalışmalarından klinik araştırmalara geçen araştırmacılar için bu metodolojiler, düzenleyici onayı büyük ölçüde hızlandıracak, riskleri azaltacak ve terapötik hücre popülasyonlarının kalitesini artıracaktır.

Giriş

Plasenta gibi perinatal kaynaklardan, plasental membranlar, göbek kordonu ve amniyotik sıvıdan elde edilen hücreler rejeneratif tıp 1,2 için hücrelerin bir potansiyel kaynağı olarak araştırmacılar ve klinisyenler dikkatini çekmiştir. Bu ilginin nedeni, bu hücre tipleri, tüm plastisite ve bağışıklık yeteneği 3, potansiyel terapötik uygulamalar için temel olan bazı özellikleri derecesine sahip olmasıdır.

hAECs rejeneratif hücre malzemeden bir miktarda potansiyel kaynağı temin terimi ya da önceden dönem amniyon zar 4 elde edilebilir heterojen epitel nüfus bulunmaktadır. hücresel bir tedavi olarak çekici hAECs yapmak özellikleri kendi multipotency, düşük imünojenite ve anti-inflamatuar özelliklerini içerir. hAECs (yüksek ölçüde, in vitro ve in vivo olarak multipotent mezodermal soy içine türetme yeteneğinde olduğu kardiyomiyopati bulunmuşturyocytes, myocytes, osteositler, adiposit), Endodermal soy (pankreas hücreleri, karaciğer hücreleri, akciğer hücreleri) ve ektodermal soyları (saç, cilt, sinir hücreleri ve astrositler) 5-10.

Reassuringly kendi multipotency hAECs ya bir şekilde tümörlere görünür ya da in vivo olarak tümör gelişimini teşvik etmemesine karşın. Ayrıca, hAECs de sınıf II insan lökosit antijenleri (HLA'lar) 8 düşük seviyelerde ifade, ayrıcalıklı bağışıklık bulunmaktadır. Bu özellik muhtemelen bağışıklık yetkili maymunlar, tavşan, kobay, sıçan, ve domuzlar 11-13 kullanıldığı çalışmalarda gösterildiği gibi, allojenik ve ksenojenik transplantasyon sonrası immün ret kaçınmak için kendi yeteneğini temelini oluşturmaktadır. hAECs güçlü immünomodülatör ve immünosüpresif özellikler gösterir ve böylece otoimmün hastalığın tedavisinde potansiyel klinik uygulamalar için önemli bir pratik avantaj sağlar. hAECs hem doğal ve adaptif bağışıklık sistemi üzerinde bağışıklık fonksiyonlarını uygulamak inanılmaktadır. Üzerindeimmunomodülator salgılanması 14 faktörleri ile öne mekanizmaların e.

Klinik öncesi hayvan hastalık modellerinde hAECs Mevcut uygulamalar felç, multipl skleroz, karaciğer hastalığı, şeker hastalığı ve kronik ve akut akciğer hastalıkların tedavisi bulunmaktadır. Araştırmacılar nedeniyle benzersiz özellikleri inme sonrası beyin iltihabı tedavi etmek hAECs kullanarak ilgi gösterdi. HAECs, onlar aşılamak olabilir kan beyin bariyerini kadar 60 gün boyunca hayatta, nöronlar içine ayırt, inflamasyonu azaltmak ve nörolojik hastalıkların 15 hayvan modellerinde hasarlı santral sinir sistemi dokusunun yenilenmesini teşvik edebilir dair kanıtlar vardır.

hAECs hedef ve multipl skleroz gelişmesi ve ilerlemesine katkıda birden patolojik yollar ters yeteneği sunuyoruz. Örneğin, klinik öncesi hayvan çalışmalarında kaynaklanan hAECs kuvvetle bağışıklık olduğunu göstermektedir vepotansiyel çevresel immün tolerans neden ve devam eden inflamatuar yanıtları tersine çevirebilirsiniz. hAECs in vivo sinir hücrelerine dönüştürmek ve nörotropik geniş bir dizi 16 faktörleri salgılayarak endojen sinir sistemini geliştirmek için kapasitesine sahip olduğu gösterilmiştir.

İnsan ve kemirgen amniyon epitel hücreleri, hayvan modellerinde karaciğer hastalığının tedavisi için terapötik etkinliğini göstermiştir. Düşük hepatosit apoptoz eşliğinde karaciğer hastalığı, karaciğer canlı hAECs nakledilmesiyle için haec nakli kurşun, karbon tetraklorür hasar indüksiyon modelinde ve hepatik inflamasyon ve fibrozis 17 azalmıştır.

hAECs insülin ve glükoz taşıyıcıları içeren ifade pankreas faktörlere stimüle edilebilir. Çeşitli çalışmalar, diyabetik farelerde 18 kan şekeri seviyelerinin normale dönmesi için hAECs potansiyelini araştırdık. Farelerde almahAECs, her iki hayvan vücut ağırlığı ve kan glukoz seviyeleri, hücre enjeksiyonunun ardından, normal seviyelere düşmüştür. Bu çalışmalar, diyabet tedavisi için hAECs kullanımı için güçlü bir sunulmaktadır.

hAECs yetişkin ve yenidoğan modelleri 19 hem de önlenmesi ve deneysel akut ve kronik akciğer hasarı tamir kanıtlanmış rolü vardır. Bu çalışmalar, hAECs Kistik fibroz membran geçirgenliğinin düzenleyicisi (CFTR), kistik fibroz 20 hastalarda mutasyona uğramış, ve iyon kanalının de dahil olmak üzere birden fazla akciğer ilişkili proteinler ifade eden fonksiyonel akciğer epitel hücrelerine in vitro olarak ayırt bulundu. HAECs yaralı yetişkin ve yeni doğan akciğer teslim edilir, ayrıca, bunların nötrofil, makrofajlar ve lenfositler 21-23 dahil olmak üzere akciğer lökosit işe, azaltılması, konak bağışıklık hücrelerinin modülasyonu yoluyla onarım etkilerini uygularlar.

Onların bolluğu göz önüne alındığında,Emniyet kaydı ve birden hastalıklar için kanıtlanmış klinik uygulamalar, hAECs kullanarak klinik çalışmalarda kaçınılmazdır. Klinik denemeler içine haec tedavilerin çeviri hızlandırılması amacı ile, biz mevcut iyi üretim uygulamaları (cGMP) kurallarına uygun olarak hayvansal ürün içermeyen reaktifler kullanılarak, klinik çalışmalar için uygun bir şekilde kültür hAECs, izole cryopreserve ve yöntemler geliştirdi .

Biz bu protokolünü biz hayvansal kaynaklı reaktifler 6 kullanarak hAECs izole başarıyla kullandığınız bir önceden yayınlanmış bir protokol tabanlı. Biz hayvansal ürün içermeyen reaktif ile hayvansal kaynaklı ürünler yerine orijinal protokol değişmiş ve sonraki optimizasyon hücre verimi, canlılığı ve saflık optimize etmek yapıldı. Amacımız, insan klinik denemeler için hücre üretimi için düzenleyici standartlara uygun bir protokol geliştirmekti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: plasenta vadeli elektif sezaryen için bir tercih, tekiz gebeliklerde sağlıklı toplanan edilmelidir. Yazılı bilgilendirilmiş onam kendi plasenta toplanması için verilmelidir. Sizin ilgili insan araştırma etik kurul onayı tüm koleksiyon ve insan dokularının kullanılması gerekir.

Amniyon Epitel Hücreleri 1. İzolasyon

  1. Bir sınıf II biyolojik güvenlik kabini içinde steril bir yüzeye yerleştirin plasentayı.
  2. Steril Hanks ile dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS) kullanarak, plasenta yüzeyi ve zarlardan mümkün olduğu kadar kan yıkayın.
  3. Göbek kordonu yukarı bakacak şekilde yerleştirilen plasenta ile, mekanik amniyon ve koryon zarlarının dış kenarını ayrı.
  4. Ayrıldıktan sonra, elle göbek kordonu doğru, membran kenarında çalışan, plasentanın koryon zarından amniyon zarı şerit.
    NOT: caref Beul amniyon gelen koryon zarı kirlenmesine parçaları varsa kaldırmak için.
  5. Steril makas kullanılarak, 250 ml HBSS içeren kabı sızdırmaz bir 500 ml'lik, göbek bağı ve yer tabanından yaklaşık 2 cm amniyon membran kesti.
  6. Amniyon zarı içeren mühürlü şişeyi sallayarak iyice yıkayın.
  7. 15 cm Petri kabı içine toplanması steril forseps kullanarak konteyner ve yerden amniyon zarı çıkarın.
  8. Kanlı veya yırtılmış parçaları atarak, (forseps ile dikey tutulduğunda), yaklaşık 5 cm uzunluğunda parçalar halinde amniyon zarı kesin.
  9. 500 ml'lik bir yer kabı sızdırmaz şekilde kapatıldı ve 250 ml HBSS ile yaklaşık 3-5 kez yıkama veya amniyon membranı kirlenmeye sebep olan hiçbir kan saydam hale gelinceye kadar.
    NOT: Herhangi bir kan mevcut çözüm sindirmek enzimatik etkinliğini azaltabilir.
  10. Dikkat ederek, çözelti sindirmek enzimatik 50 ml ihtiva eden bir kap içine amniyon zarın tüm parçaları transferHBSS taşınmasını en aza indirir.
  11. Kalan kanı çıkarmak için yavaşça sallanarak 15 dakika için 37 ° C'de su banyosunda veya sıcak bir odada çözüm sindirmek enzimatik olarak amniyon parçaları inkübe.
  12. Yeni bir steril kap içinde çözüm ve yer sindirmek enzimatik gelen amniyon zarı parçalarını çıkarın.
  13. Taze enzimatik 100 mi amniyon zara çözeltisi sindirimi ve bir su banyosu ya da yumuşak çalkalama (birinci sindirim) ile sıcak bir odada 60 dakika süre ile 37 ° C'de inkübe ekleyin.
  14. Amniyon zarı parçalarını çıkarın ve enzimatik zarının her parçasından tahliye çözüm sindirmek izin vermek için yeni konteyner alarak bakım içine yerleştirin.
    Not: Bu, kabın iç kenarı boyunca amniyon parçaları sürükleyerek elde edilebilir.
  15. Taze enzimatik 100 mi amniyon membran parçaları çözeltisi sindirimi ve hafif çalkalama (ikinci sindirim) ile 37 ° C'de bir su banyosu ya da sıcak bir odada 60 dakika inkübe ilave edin.
  16. Hücre asıltı geçmek10 dakika boyunca 1.000 xg'de 70 mikron filtre ve santrifüj yoluyla Adım 1.14 itibaren.
  17. Çıkarın ve supernatant ve 1 mg / ml soya fasülyesi bazlı bir enzim inhibitörü içeren 4 ml HBSS hücre pelletini. Yavaşça tek bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere, 1 ml pipet ile tekrar tekrar pipetle.
    Not: ikinci sindirilmiş hücre işlem aynı seviyede olana kadar bu aşamada hücreler, buz üzerinde bırakılabilir.
  18. Amniyon zarı parçalarını çıkarın ve enzimatik zarının her parçasından tahliye çözüm sindirmek izin vermek için yeni konteyner alarak bakım içine yerleştirin.
    Not: Bu, kabın iç kenarı boyunca amniyon parçaları sürükleyerek elde edilebilir.
  19. 10 dakika boyunca 1.000 xg'de 70 mikron filtre ve santrifüj yoluyla Adım 1.18 hücre süspansiyonu geçirin.
  20. Çıkarın ve supernatant ve 1 mg / ml soya fasülyesi bazlı bir enzim inhibitörü içeren 4 ml HBSS hücre pelletini. Yavaşça 1 ml p art arda pipettek bir hücre süspansiyonu elde etmek için ipette.
  21. İki digests veya alternatif Havuz hücreleri hücre sayımları sonrasına kadar ayrılmış hücre digests tutun.
    NOT: Bu yüksek canlılık hücreleri ile potansiyel olarak düşük canlılığı hücrelerinin karıştırılması önler.
  22. 10-20 ml'lik bir son hacme HBSS ekleyin ve canlılığını ölçmek için tripan mavisi kullanarak hücreleri sayısını gerçekleştirmek.
  23. Flow sitometri ile epitel hücre fenotipi onaylayın. Anti-EpCAM-PE kullanılarak uygun antikor kokteyli Makyaj (1: 2 seyreltme), anti-CD90-PeCy5 (1: 250) ve anti-CD105 APC (1: 100), HBSS.
  24. 25 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda bir hücreler ya da antikor kokteyli içinde iki digests bir alt yeniden süspanse edin.
  25. Flow sitometri, leke izotip kontrolleri içeren antikor kokteylleri ile 1 x 10 6 hücre için (örn., IgG 1 izotop kontrol-PE + Anti-CD90-PeCy5 + Anti-CD105-APC). Set-up akış sitometresi için lekesiz ~ 1 x 10 6 hücre tutun.
  26. Antikorda hücreleri inkübe60 dakika boyunca 4 ° C'de kokteyller.
  27. Yıkama akış sitometresi için hücreler, ml başına 5-10.000.000 hücreler HBSS ve tekrar süspansiyon 3x.
  28. Akış sitometrik ve not sonuçlarını gerçekleştirin. Hücre izolatı (EpCAM pozitif ve CD90 / CD105 negatif hücrelerin yüzdesi) saflığı sırasıyla% 90-95 ve <% 1 olacağı tahmin edilmektedir.
  29. Nihai uygulama tarafından tespit edildiği üzere, uygun kalite kontrol ve serbest bırakma kriterleri için test edilmesi için bir kenara hücrelerin uygun bir sayısı ayarlayın.
    NOT: Bu hastalık / viral tarama veya diğer güvenlik veya biyolojik kriterlerini içerebilir.
  30. Kalan hücreler için, Kriyoprezervasyonun protokolünü takip veya alternatif (kültür adım 3.6 doğrudan) kültür doğrudan yerleştirin.

HAECs 2. Kryoprezervasyon

  1. Veri veya tripan mavi dışlama manuel sayım flow sitometri kullanılarak hücre sayısı ve canlılığı belirleyin.
  2. 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüjleyin.
  3. Süspanse hücrehayvansal ürün içermeyen kriyoprezervasyon medya ml başına 1-10 milyon hücreleri arasındaki s.
  4. O-halkalı dondurarak saklama şişeleri içine hücrelerin uygun bir hacim pipet ve soğutma yaklaşık olarak meydana geldiği hızı kontrollü dondurma cihazının içine koyun 1 ° C / dakika kadar -80 ° C elde edilir °.
  5. Uzun süreli depolama için sıvı azot içine şişeleri aktarın.

Cyropreserved hAECs 3. erimesi ve Kültür

  1. Sıvı azottan dondurarak saklama şişeleri çıkarın ve buz üzerine yerleştirin.
    NOT: Yalnızca transferi için - bir sonraki adıma geçin hızla.
  2. Buz kalır, sadece küçük bir parça (~ 5 mm x 5 mm) kadar 37 ° C de hızlı bir şekilde dondurarak saklama şişeleri çözülme.
    NOT: Bu hücre çözümü dondurulması medyada DMSO toksik etkilerini azaltmak için sıcak olmadığı önemlidir.
  3. Soğuk (~ 4 ° C), serum içermeyen ortam ile dondurarak saklama Ortam 10 kat seyreltilir, damla damla uygun bir boyut halinde ilaved tüp veya kap.
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüjleyin.
  5. Ml başına 1.000.000 hücre bir konsantrasyonda için, serum barındırmayan ortam içinde yeniden süspanse edin. Tripan mavi dışlama ile otomatik veya manuel sayım kullanarak hücre sayısı ve canlılığı belirleyin. Beklenen canlılık sonrası çözülme öncesi kriyokoruma canlılığı% 5-10 daha az olacaktır.
  6. Plaka standart hücre kültürü-işlenmiş plastik eşya üzerine hücreler, veya alternatif kullanmak Tip I kat kültür yüzeylere kollajen.
  7. Tip I Kollajen kaplama için aşağıdaki protokolü takip
    1. İnsan plasentasından (25 ml deiyonize su ve 50 ul asetik asit, 15 mg, kolajen) 'ye ait asit çözünebilir Tip I Kolajen hazırlayın.
    2. Parafilm ile beher Kapak ve kolajen iplikler eriyene kadar 37 ° C'de orta karıştırın.
    3. 0.22 um filtre kullanılarak steril filtre kolajen çözeltisi.
    4. Deiyonize su ile filtrelenmiş kollajen stok 01:10 sulandırmak. Bu seyreltilmiş hisse çalışma conce olduğunuKaplama, plastik ve zar yüzeylerin ntration çözeltisi.
    5. Kollajen kat plastik, 37 ° C'de, oda sıcaklığında 2 saat için cam ve zar yüzeylerin ya da O / N, 2-8 ° C'de ilave edildi.
    6. Kaplanmış yüzey aşırı sıvı kaldırmak, ve O / N kurumasını bekleyin.
    7. Hücreleri ve orta tanıtan önce steril doku kültürü dereceli su veya HBSS ile durulayın.
  8. Levha serumsuz ortam içinde 25,000 hücre / cm2 yoğunluğunda hAECs ve ek 72-96 saat boyunca oluşmasına izin verir.
  9. Ek sonra, dikkatli bir şekilde aspire edilmesiyle ve serumsuz ortamda uygun bir hacim, her 2-3 günde bir ile değiştirerek ortamı değiştirmek.
  10. Aşağıdaki protokolü kullanarak Passage hücreleri
    1. Aspire hücre kültürü ortamı ve steril HBSS 1x hacmi ile yıkayın
    2. Hücreler, hücre kültürü yüzeyinden ayırma gözlenen kadar enzimatik 1x hacmi ekleyin çözüm sindirmek ve 5-15 dakika inkübe, ya da.
    3. Çözelti, hücreleri ihtiva eden sindirimi ce sağlanması enzimatik toplamakrf defalarca hücre kültürü yüzeyine karşı çözüm sindirmek enzimatik pipetleme hücre kültürü yüzeyinden ayrılır
    4. 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüjleyin.
    5. 1 mg / ml soya fasülyesi bazlı bir enzim inhibitörü ihtiva eden HBSS uygun bir hacimde hücre pelletini. Yavaşça tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir 1ml pipet ile art arda pipetle.
    6. 1.000.000 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda serum içermeyen ortam ekleyin. Tripan mavi dışlama ile otomatik veya manuel sayım kullanarak hücre sayısı ve canlılığı belirleyin.
    7. Levha serumsuz ortam içinde 25,000 hücre / cm2 yoğunluğunda hAECs, standart kültür yöntemleri ile devam eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu prosedür doğru devam edildiğinde, 120,000,000 hAECs bir ortalama verim 80-160,000,000 hücre tipik aralık, beklenmelidir. Bu verimi kaynaktan, 83 ±% 4 arasında bir ortalama canlılığı beklenebilir. Klinik yöntemde artan ortalama verimi ve biraz daha düşük bir canlılık bağlı olarak serum proteinleri olmaması belki de, hayvan türevi ürün daha yüksek bir tripsin aktivitesi nedeniyle olabilir ve. İzole hAECs <% 1, CD90, CD105, mezenkimal geni taşıyan hücreler ile% 92 EpCAM pozitif hücreleri arasında bir ortalama hücre y...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu metodolojinin başarısında önemli bir etkiye sahip birkaç kritik parametreler vardır. HAECs izolasyonundan önce 3 saat süre ile plasenta veya amniyon depolanması ancak doku mümkün olan en kısa zamanda işlem önerilmektedir, lojistik ve programlama amacıyla arzu edilebilir. Doku saklanacaksa, bu depolama amniyon membran diseksiyon ve yıkama sonrası yapılması tavsiye edilir. Amniyon sıvısı 4 ° C'de steril HBSS içeren antibiyotik saklanabilir ancak hücre canlılığı, uzun depolama süresi ile azalabilir. Biz, ve diğerler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, Victoria Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı'ndan sağlanan mali desteği kabul ediyorlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Toplama Kiti
Sıyırma tepsisiFisher Scientific13-361B
Liberty Pansuman Forsebi, sivri uçlu 13 cmFisher ScientificS17329 
Makas - Keskin/Küt DüzFisher ScientificNC0562592 
Steril lateks eldivenler Fisher Bilimsel19-014-643 
Koruyucu Giysi
Koruyucu Giysi (Önlük)U-lineS-15374-M
İzolasyon önlükleriU-lineS-15374-M
Steril lateks eldivenler Fisher Bilimsel19-014-643 
Genel amaçlı yüz maskesiCardinal HealthAT7511
BonelerMedlineCRI1001
Ayakkabı kılıflarıU-lineS-7873W
Medya ve Reaktifler
Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Kalsiyum veya magnezyum içermeyenLife Technologies
14175095 TrypZean (hayvansal ürün– ücretsiz rekombinant tripsin)Sigma AldrichT3449
Soya Fasulyesi Tripsin İnhibitörü ve 1g / 50mLSigma AldrichT6522
Cryostor CS5BioLife Çözümleri205102
Tripan mavisi reaktifiYaşam Teknolojileri15250-061
Anti-EpCam-PEMiltenyi Biotec130 - 091-253
PE-izotipi kontrolMiltenyi Biotec130-098-845
Anti-CD90-PeCy5BD Pharmingen555597
PeCy5-izotip kontrolüBD Pharmingen557224
Anti-CD105-APCBD Pharmingen562408
APC-izotip kontrolüBD Pharmingen340754
Kollajen Tip VISigma AldrichC7521
Sarf malzemeleri
50 ml dereceli pipetBD/Falcon356550
10 ml dereceli pipetBD/Falcon356551
5 ml dereceli pipetBD/Falcon356543
50 ml şahin tüpleriBD/Falcon352070
15 ml şahin tüpleriBD/Falcon352096
15 cm Petri kaplarıCorning351058
70 μ m filtrelerBD / Falcon352350
0.22 & mu; m filtrelerKırlangıç SLGV033RS
1 ml Pipet uçlarıFisherbrand02-707-401
200 μ l Pipet uçlarıFisherbrand02-707-409
20 ml ŞırıngaBD / Tıbbi309661
Plastik spatulaFisher Scientific14-245-97 
Plastik tartı teknesiFisher Scientific02-202-102 
Cryo şişeleriNunc377267
Ekipmanları
Bay FrostyFisher ScientificA451-4 
Biyolojik Tehlike Dolabı

Kaynaklar

  1. Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
  2. Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
  3. Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
  4. Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
  5. Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
  6. Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3(2007).
  7. Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6(2010).
  8. Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
  9. Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
  10. Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
  11. Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
  12. Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
  13. Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
  14. Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
  15. Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
  16. Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
  17. Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631(2012).
  18. Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
  19. Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
  20. Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533(2012).
  21. Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
  22. Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763(2012).
  23. Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
  24. Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
  25. Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
  26. Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
  27. Park, A., et al. Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Amniyon Membran zolasyonuHayvansal r n ermeyen ReaktiflerAk Sitometrik AnalizKriyoprezervasyon ProtokolH cre K lt r Tekni iEnzimatik Sindirim Y ntemiDoku S spansiyonu FiltrasyonuCanl l k De erlendirmesi
İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.