Mevcut iyi üretim uygulamaları (cGMP) yönergelerine uygun olarak hayvansal ürün içermeyen reaktifler kullanarak insan amnion epitel hücrelerini (hAEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri
Bu makalede
Özet
Özet
Term veya preterm amniyon membranlarından türetilen insan amnion epitel hücreleri (hAEC'ler), rejeneratif tıp için potansiyel bir hücre kaynağı olarak araştırmacıların ve klinisyenlerin dikkatini çekmiştir. Bu ilginin nedeni, bu hücrelerin yüksek multipotent farklılaşma yeteneğine, düşük immünojenisiteye ve anti-inflamatuar fonksiyonlara sahip olduğuna dair kanıtlardır. Bu özellikler, araştırmacıları, klinik öncesi hayvan çalışmalarında çeşitli hastalık ve bozuklukları tedavi etmek için hAEC'lerin potansiyelini çok başarılı bir şekilde araştırmaya sevk etmiştir.
hAEC'ler, bir dizi hastalık ve bozukluğun tedavisi için yaygın bir uygulama alanı bulmuştur. HKEC'lerin potansiyel klinik uygulamaları arasında inme, multipl skleroz, karaciğer hastalığı, diyabet ve kronik ve akut akciğer hastalıklarının tedavisi yer alır. Klinik öncesi hayvan çalışmalarından klinik çalışmalara ilerlemek, hücre tedavisi ürünleri için daha yüksek bir kalite kontrol ve güvenlik standardı gerektirir. Güvenlik ve kalite kontrol hususları için, hücre izolasyon protokollerinin hayvansal ürün içermeyen reaktifler kullanması tercih edilir.
Araştırmacıların hayvansal ürün içermeyen reaktifler kullanarak hAEC'leri izole etmelerine, kriyoprezervasyon yapmalarına ve kültürlemelerine olanak tanıyan protokoller geliştirdik. Bu yöntemin avantajı, bu hücrelerin, uygun hücre verimlerini, canlılıklarını ve büyüme potansiyelini korurken, insanlara potansiyel olarak zararlı hayvan patojenleri verme riski olmadan izole edilebilmesi, karakterize edilebilmesi, dondurularak saklanabilmesi ve kültürlenebilmesidir. Klinik öncesi hayvan çalışmalarından klinik araştırmalara geçen araştırmacılar için bu metodolojiler, düzenleyici onayı büyük ölçüde hızlandıracak, riskleri azaltacak ve terapötik hücre popülasyonlarının kalitesini artıracaktır.
Giriş
Plasenta gibi perinatal kaynaklardan, plasental membranlar, göbek kordonu ve amniyotik sıvıdan elde edilen hücreler rejeneratif tıp 1,2 için hücrelerin bir potansiyel kaynağı olarak araştırmacılar ve klinisyenler dikkatini çekmiştir. Bu ilginin nedeni, bu hücre tipleri, tüm plastisite ve bağışıklık yeteneği 3, potansiyel terapötik uygulamalar için temel olan bazı özellikleri derecesine sahip olmasıdır.
hAECs rejeneratif hücre malzemeden bir miktarda potansiyel kaynağı temin terimi ya da önceden dönem amniyon zar 4 elde edilebilir heterojen epitel nüfus bulunmaktadır. hücresel bir tedavi olarak çekici hAECs....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: plasenta vadeli elektif sezaryen için bir tercih, tekiz gebeliklerde sağlıklı toplanan edilmelidir. Yazılı bilgilendirilmiş onam kendi plasenta toplanması için verilmelidir. Sizin ilgili insan araştırma etik kurul onayı tüm koleksiyon ve insan dokularının kullanılması gerekir.
Amniyon Epitel Hücreleri 1. İzolasyon
- Bir sınıf II biyolojik güvenlik kabini içinde steril bir yüzeye yerleştirin plasentayı.
- Steril Hanks ile dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS) kullanarak, plasenta yüzeyi ve zarlardan mümkün olduğu kadar kan yıkayın.
- Göbek kordonu yukarı bakacak şekilde yerleştirilen plas....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu prosedür doğru devam edildiğinde, 120,000,000 hAECs bir ortalama verim 80-160,000,000 hücre tipik aralık, beklenmelidir. Bu verimi kaynaktan, 83 ±% 4 arasında bir ortalama canlılığı beklenebilir. Klinik yöntemde artan ortalama verimi ve biraz daha düşük bir canlılık bağlı olarak serum proteinleri olmaması belki de, hayvan türevi ürün daha yüksek bir tripsin aktivitesi nedeniyle olabilir ve. İzole hAECs <% 1, CD90, CD105, mezenkimal geni taşıyan hücreler ile% 92 EpCAM pozitif hücreleri arasında bir ortalama hücre y.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu metodolojinin başarısında önemli bir etkiye sahip birkaç kritik parametreler vardır. HAECs izolasyonundan önce 3 saat süre ile plasenta veya amniyon depolanması ancak doku mümkün olan en kısa zamanda işlem önerilmektedir, lojistik ve programlama amacıyla arzu edilebilir. Doku saklanacaksa, bu depolama amniyon membran diseksiyon ve yıkama sonrası yapılması tavsiye edilir. Amniyon sıvısı 4 ° C'de steril HBSS içeren antibiyotik saklanabilir ancak hücre canlılığı, uzun depolama süresi ile azalabilir. Biz, ve diğerler.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, Victoria Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı'ndan sağlanan mali desteği kabul ediyorlar.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Toplama Kiti | |||
| Sıyırma tepsisi | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Pansuman Forsebi, sivri uçlu 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Makas - Keskin/Küt Düz | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Steril lateks eldivenler | Fisher Bilimsel | 19-014-643 | |
| Koruyucu Giysi | |||
| Koruyucu Giysi (Önlük) | U-line | S-15374-M | |
| İzolasyon önlükleri | U-line | S-15374-M | |
| Steril lateks eldivenler | Fisher Bilimsel | 19-014-643 | |
| Genel amaçlı yüz maskesi | Cardinal Health | AT7511 | |
| Boneler | Medline | CRI1001 | |
| Ayakkabı kılıfları | U-line | S-7873W | |
| Medya ve Reaktifler | |||
| Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) | Kalsiyum veya magnezyum içermeyen | Life Technologies | |
| 14175095 TrypZean (hayvansal ürün– ücretsiz rekombinant tripsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soya Fasulyesi Tripsin İnhibitörü ve 1g / 50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Çözümleri | 205102 | |
| Tripan mavisi reaktifi | Yaşam Teknolojileri | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-izotipi kontrol | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-izotip kontrolü | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-izotip kontrolü | BD Pharmingen | 340754 | |
| Kollajen Tip VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Sarf malzemeleri | |||
| 50 ml dereceli pipet | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml dereceli pipet | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml dereceli pipet | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml şahin tüpleri | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml şahin tüpleri | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri kapları | Corning | 351058 | |
| 70 μ m filtreler | BD / Falcon | 352350 | |
| 0.22 & mu; m filtreler | Kırlangıç SLGV033RS | ||
| 1 ml Pipet uçları | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μ l Pipet uçları | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Şırınga | BD / Tıbbi | 309661 | |
| Plastik spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastik tartı teknesi | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo şişeleri | Nunc | 377267 | |
| Ekipmanları | |||
| Bay Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biyolojik Tehlike Dolabı |
Kaynaklar
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
