Immunotargeted sentezi Magneto-plasmonik nanoklastırlar

Özet

Burada, biz güçlü bir manyetik an ve güçlü yakın kızılötesi (NIR) absorbanslı manyeto-plasmonik nanopartiküllerin sentezi için bir protokol açıklar. Protokol moleküler özgü hedeflenmesini gerektiren çeşitli biyomedikal uygulamalar için Fc kısmının yoluyla nanopartiküllere antikor konjugasyonu içerir.

Özet

Tek bir nanopartikül kombine manyetik özellikleri ve plasmonik kontrast yeni manyetomotif Görüntüleme yöntemleri iyileştirme, eşzamanlı yakalama ve (kapalı zaman eğrilerinin) dolaşan tümör hücrelerinin saptanması, ve bir foto termal tedavi ile birlikte çok modlu, moleküler görüntüleme de dahil olmak üzere biyomedikal uygulamalarda bir dizi avantaj sağlayan bir sinerji sağlar Kanser hücrelerinin. Bu uygulamalar yakın kızılötesi (NIR) bölgesinde optik absorbans ve güçlü bir manyetik moment ile manyeto-plasmonik nanopartiküllerin sentezi için protokollerin gelişmesinde önemli ilgi canlandırmıştır. Burada, bir yağ-içinde-su mikroemülsiyonu metoduna dayanır Bu tür melez nanopartiküllerin sentezi için yeni bir protokol mevcut. Bu tarifnamede tarif edilen protokol benzersiz özelliği de manyeto-plasmonik özelliklere sahip olan birincil blokları çeşitli boyutlarda manyeto plasmonik nanopartiküllerin sentezi. Bu yaklaşım, yüksek den olan nanopartiküller verireşit nanopartikül hacmi boyunca dağıtıldığı ve manyetik plasmonik işlevselliklerinin lu. Hibrid nanopartiküller kolayca hedefleme için uygun antijen bağlanması için sorumlu olan Fab kısmındaki çıkış Fc kısmı ile antikor bağlanması ile işlevselleştirilebilir.

Giriş

Farklı fizikokimyasal özelliklere sahip farklı malzemelerden oluşan hibrid nanopartiküller modlu moleküler görüntüleme, tedavi ve izlenmesinde, yeni tarama ve teşhis deneyleri de dahil olmak üzere ^1-3 biyomedikal uygulamalarda yeni fırsatlar açabilir. Bir manyetik alana plazmon rezonans ve yanıt ile ilgili olarak çok güçlü bir ışık saçılması ve emme kesitler sağlar, çünkü tek bir nanopartikül içinde plasmonik ve manyetik özelliklerin kombinasyonu özellikle tercih edilir. Örneğin, manyeto-plasmonik nanopartiküller bir harici elektro ^3-5 ile geçici bir sinyal modülasyon uygulanarak işaretli hücrelerin karanlık alan görüntüleme kontrastı arttırmak için kullanılmıştır. Manyeto-foto akustik görüntüleme, manyeto-plasmonik nanopartiküller kontrast ve sinyal-arka sıçan büyük gelişmeler sağlayacak - Daha yakın zamanlarda, benzer bir ilke bir yeni görüntüleme yönteminin geliştirilmesinde uygulanmıştırio ^6,7. Ayrıca hibrid nanopartiküller eşzamanlı yakalama ve tam kan ve in vivo ^8,9 dolaşan tümör hücrelerinin saptanması için kullanılabilir gösterilmiştir. Ayrıca, manyeto-plasmonik nanopartiküller kanser hücrelerinin ¹⁰ fototermal tedavi ile kombine moleküler spesifik optik ve MR görüntülemede kullanılabilir theranostic maddeleri umut vericidir.

Çeşitli yaklaşımlar manyeto-plasmonik nanopartiküllerin sentezi için araştırılmıştır. Dambıl gibi çift fonksiyonlu Au-Fe ₃ O ₄ nanopartiküller ¹¹ oluşturmak için altın nanopartiküller örneğin, Yu ve ark. Kullanılan ayrışma ve Fe (CO) oksidasyon için _5. Wang ve ark. Termal bozunma yöntemi ¹² kullanılarak altın kaplı demir oksit nanopartikul sentezlediler. Diğer bazı yaklaşımlar ag birikimi, ardından manyetik çekirdek nanopartiküller üzerine kaplama polimeri ya da amin fonksiyonel moleküller güvenmekmelez oluşturmak için polimer yüzeyi üzerine eski kabuk parçacıkları ^7,13. Buna ek olarak, demir oksit nanopartiküller, elektrostatik etkileşimler ve bir kimyasal reaksiyonun ^14,15 ile altın nanoçubuklar bağlanmıştır. Bu yaklaşımlar, manyeto-plasmonik oluşturulan nano verim de, biyomedikal uygulamalar için çok tercih edilir ve bu da, yakın kızılötesi (NIR) pencerede optik abzorbans ya da güçlü bir manyetik an olarak manyetik-plasmonik kombinasyonunun bir ölçüde özellikleri tehlikeye düşürür. Örneğin, halter Au-Fe ₃ O ₄ nanopartiküller nedeniyle, bu tayf aralığında yüksek doku bulanıklığa in vivo kendi faydalarını sınırlandıran 520 nm 'de bir plazmon rezonans noktası vardır. Ayrıca, mevcut protokoller tarafından üretilen manyetik-plasmonik nanopartiküller ACH olabilir daha önemli ölçüde daha az olduğunu, sadece bir veya az sayıda ¹¹ (10'dan az) ^14,15 süperparamanyetik kısımları (örneğin, demir oksit nanopartiküllerinin) ile sınırlıdıryoğun bir şekilde bir nano olarak hedeflenmektedir:. Örneğin, yoğun bir şekilde bir 60 nm çapında küresel nanopartikül bin 6 nm süperparamanyetik nanopartiküllerinin mertebesinde içerebilir. Dolayısıyla melez nanopartiküllerinin manyetik özellikleri geliştirmek için büyük bir yer vardır. Ayrıca, daha önce anlatılan bazı protokoller nispeten karmaşık ve sentez işlemleri sırasında tanecikler arasındaki ^14,15 toplanmasını önlemek için dikkatli bir optimizasyon gerektirir.

Burada, güçlü bir manyetik anda mevcut ve teknikte önemli sınırlamaları çözen güçlü NIR absorbans manyeto-plasmonik nanopartiküllerin sentezi için bir protokol açıklar. Sentez içinde yağ-su mikroemülsiyon yöntemi ¹⁶ kökeni vardır. Böylece, daha küçük birincil parçacıklar arzu edilen bir boyutta nanopartiküllerinin montaj dayanmaktadır. Bu yaklaşım, altın, demir oksit, ve yarı iletken PRI gibi tek bir malzemeden oluşturulan nano üretmek için kullanılmıştırMary ¹⁶ ihtiva etmektedir. Biz son küresel nano içine birincil hibrid parçacıkları montaj, sonra, 6 nm çapında altın kabuk / demir oksit parçacıkları çekirdekli yaparak, tarafından, ilk manyeto-plasmonik nanopartiküllerin sentezi için genişletilmiş ve. Nanoklastırlar sadece bu süperparamanyetik özelliklerini korurken yüksek bir manyetik anda gerçekleştirilmesi gibi kurucu nanopartiküllerinin özelliklerini iyileştirmek izin verir, aynı zamanda bu nedenle örneğin güçlü yeri gibi, kurucu nanopartiküllerden mevcut yeni özellikler, ayrı ayrı oluşturma nano-tanecikleri arasındaki etkileşimlerin yararlanır içine birincil parçacıklar Montaj NIR penceresinde optik absorbans. Bu protokol, manyetik ve plasmonik işlevleri bir yüksek yoğunluklu hibrid nano-tanecikleri elde edilir. Birincil parçacıklar sentezlendiği sonra, yöntem, esas olarak, basit bir tek-kaplı bir reaksiyondur. Genel plazmon rezonans gücü ve manyetik momenti birincil parçacıklar ve, Ther bir dizi belirlenirefore, kolay bir uygulamaya bağlı olarak optimize edilebilir. Ayrıca, moleküler özgü hedeflenmesini gerektiren çeşitli biyomedikal uygulamalar için hibrid antikor nanopartiküller olarak bağlanması için bir prosedür geliştirilmiştir. Antikorlar hedefleme için uygun antijen bağlanması için sorumlu olan Fab kısmındaki çıkış Fc parçası yoluyla bağlanır.

Protokol

1. Aletler ve Züccaciye Hazırlık

1. Yani uygun koruyucu ekipman, laboratuvar önlüğü, atılabilir eldivenler ve göz koruması takın.
2. Kondansatöre, yuvarlak dipli bir balon içinde iletişime ve bir termometre ile bir sıcaklık denetimli bir silikon yağı banyosu içinde bırakın. Yağ banyosunda (Şekil 1) altında, bir ısı kaynağı (örneğin, sıcak plaka) koyun. Sıcaklığı daha yüksek 260 ° C ölçme yeteneğine sahip bir termometre kullanarak.

İlköğretim Hibrid 2. sentezi Magneto-plasmonik Nanoparçacıklar

1. Manyetik Çekirdek Nanopartiküller Yapımı
   1. Yuvarlak bir 353.2 mg (1 mmol), demir (III) asetilasetonat, 1 ml (2 mmol), oleik asit, 1 ml (2 mmol) oleilamin, 1.292 gr (5 mmol) 1,2-heksadekanediol ve 10 mi fenil eter ekleyin -Dip şişe.
   2. Kuvvetli geri akış altında 1 saat boyunca 250-260 ° C'ye kadar Manyetik bir karıştırma-çubuğu ve ısı ile karıştırın. Çözüm soğumasını Sonra, bekleyinKarışımın oda sıcaklığına. Sıcaklık fenil eter kaynamasını önlemek ve kondansatöre yuvarlak dipli bir reaksiyon kabına reaksiyon kanşımının bir ileri atılmasını önlemek için 260 ° C'nin altındaki sıcaklıklarda olduğundan emin olun.
      DİKKAT: Reaksiyon karışımı son derece sıcak ve kimyasallar tahrişe neden olabilir. Davlumbaz altında faaliyet ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymelidir. Yağ banyosu için yeterli havalandırmayı sağlayın.
      Not: Yağ banyosu manyetik nanopartiküllerin sentezi sırasında, 1 saat süre ile 250-260 ° C sıcaklıkta tutulur. Prensip olarak, bir Pyrex cam tabak, bu amaç için kullanılabilir. Ancak, Pyrex cam için maksimum sürekli sıcaklık satıcı bilgiye göre ºC ~ 260 olduğunu. Bu nedenle, metal kap, daha yüksek bir sıcaklığa dayanabilirler ve birden fazla çalışmalar sırasında uzun süre gibi reaksiyon için daha güvenli bir seçenek sağlar.
2. Manyetik çekirdek nanopartiküller üzerine bir altın kabuk çökelmeden
   1. 411.5 mg (1.1 mmol) altın ace Ekleetilester, 0.25 mi (0.75 mmol) yağ asidi, 1,5 mi (3,0 mmol) oleilamin, yuvarlak dipli bir şişeye 775.3 mg (3 mmol) 1,2-heksadekanediol ve 15 ml fenil eter.
   2. Adım 2.1 'den manyetik nanopartiküller 5 ml süspansiyon ekleyin. 180 ° C'ye ısıtılır ve reaksiyon karışımı, 1 saat boyunca geri akış altında tutun. Oda sıcaklığına kadar soğuması için çözüm bekleyin.
   3. 15 dakika boyunca 3250 x g'de santrifüj işlemi ile hibrid birincil nano-tanecikleri çökeltmek için 50 ml etanol ekleyin.
   4. Banyo sonikatör kullanarak 25 ml heksan içinde süspanse çökelti. Birincil hibrid nano-tanecikleri çökeltmek için 25 ml etanol ile ekleyin. 15 dakika boyunca 3250 x g'de santrifüj ve heksan içinde çökelti tekrar süspansiyon. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
   5. Bir vakum desikatör O / N çökelen primer karma nano-tanecikleri kurutunuz. Parçacıklar tamamen kuru olduğundan emin olun.

3. Hibrid Magneto-plasmonik nanoklastırlar Sentezi ve Boyut Ayırma

1. Banyo sonikatör kullanılarak 1 mL kuru heksan içinde primer karma nanopartiküllerinin süspanse 5 mg arasındadır. Gözle görülen bir çökelti oluşana kadar nanoparçacık süspansiyon sonikasyon.
2. Bağlı kapaklı 20 ml'lik bir cam şişe içerisinde 3,1-10 ML aşama sodyum dodesil sülfat (2,8 mg / ml) sulu bir çözelti solüsyonu ekleyin. Bir sonraki aşamada önce, iki fazın karıştırılması bilmek damla primer karma nanopartiküller damla süspansiyonu ekleyin.
3. 10 dakika boyunca 80 ° C'de bir su banyosunda ısıtarak ve ardından, 2 saat boyunca bir banyo sonikatörü içinde, iki fazlı bir çözelti, sonikasyon. Oda sıcaklığına kadar soğuması için çözüm bekleyin.
   1. Sonikasyon banyo çalışma seviye çizgisine kadar su doldurun. Sonikasyon banyosunda cam şişeyi ortalayın. Hemen iki faz arasında bir emülsiyon oluşturur. Sonikasyon başlamasından sonra elle, iki fazlı bir çözelti çalkalayın; Bu primer karma nano-tanecikleri içeren bir faz ve alt, sulu faz arasındaki karıştırma kolaylaştırır.
      NOT: tha farkında olunsonikatöre t operasyonun 2 saat sonra ısınır.
4. 30 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj melez nanocluster süspansiyonu. Çökelti ve süpernatan iki toplayın. 10 dakika sonikasyon altında 0.1 mM sodyum sitrat çökelti süspanse. Nanoklastırlaar beklenen boyutu çapı ~ 180 nm'dir.
5. Yeni bir konik tüp adım 3,3 süpernatant aktarın.
6. 30 dakika boyunca 400 x g'de adım 3.4 süspansiyon santrifüj. Çökelti ve süpernatan iki toplayın. 10 dakika sonikasyon altında 0.1 mM sodyum sitrat çökelti süspanse. Nanoklastırlaar beklenen boyutu çapı ~ 130 nm'dir.
7. Yeni bir konik tüp adım 3.5 den süpernatant aktarın.
8. 30 dakika boyunca 1.500 xg'de adım 3.6 den süspansiyon santrifüj. 10 dakika sonikasyon altında 0.1 mM sodyum sitratta çökelti ve tekrar süspansiyon toplayın. Nanoklastırlaar beklenen boyutu ~ çapı 90 nm'dir.
9. Ekle 300 _6, bir UV Vis NIR absorbsiyon spektrumunu ölçme için bir 96-çukurlu mikro levha okuyucusu l nanocluster süspansiyonu. TEM görüntüleme için karbon kaplı bakır ızgara üzerine 10 ul nanocluster süspansiyon bırakın.

Nanoklastırlar karşı monoklonal antikorların 4. Konjügasyon

1. 100 uL monoklonal antikor çözeltisi (PBS içinde 1 mg / ml), pH 7.2, örneğin, bir anti-epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) antikorlar ya da anti-epidermal büyüme faktörü reseptörü 1 (EGFR) antikorları hazırlayın.
2. 3.9 ml 4 mM HEPES, pH 7.2 adım 4,1 antikor solüsyonu ekleyin. Santrifüj 8 ° C'de 20 dakika boyunca 3250 x g'de 10 K bir MWCO santrifüj filtre ile çözelti. 100 ul son hacim olması için, 4 mM HEPES, pH 7.2 içinde yeniden süspanse antikor.
   Not: Bu adım HEPES ile antikor çözeltisi içinde orijinal ortamı değiştirmek için gerçekleştirilir.
3. Antikor çözeltisi 100 mM NAIO _4-100 ul, 10 ul ekle. Bir al ile reaksiyon şişesine Kapakoda sıcaklığında uminum folyo ve orbital bir karıştırıcı kullanılarak 30 dakika boyunca karıştırın.
4. 1x PBS 500 ul ekleyerek reaksiyonu söndürün.
5. Adım 4,4 antikor çözeltisine 46,5 mM bağlayıcı çözeltisi, 2 ul (dithiolaromatic PEG6-CONHNH ₂₎ ilave et ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca çalkalanır.
6. 8 ° C'de 20 dakika boyunca 3250 x g'de 10 K bir MWCO filtre kullanılarak santrifüj solüsyonu filtre. , ~ 1 mg / ml 'lik bir antikor konsantrasyonuna yol açar 100 ul'lik nihai bir hacme kadar 1x PBS içinde yeniden süspanse antikor.
7. Oda sıcaklığında 120 dakika boyunca aşama 4.6 (1 mg / mi) 1.0 1 ııl ~ OD 100 ul değiştirilmiş antikorları nanocluster süspansiyon karıştırın.
8. 10 ³ M, 5 kDa tiol PEG 10 ul eklenir ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sallayın.
9. 3 dakika boyunca 830 x g'de santrifüje çözeltisi. Süpernatantı atın ve PBS, pH 7.2 / 5 h kDa PEG w 100 ul% 2 tortu tekrar süspansiyon.
10. Antikora konjuge nanoklastırlaar absorbans spektrumunun ölçmek ve karşılaştırmak to çıplak nanoklastırlaar spektrumu Absorbans. Birleştirmeden sonra nanometre kırmızı vardiya birkaç bekliyoruz.
11. Nanotanecikler, ve kırmızı-NIR'de OD bir artış ile önemli bir değişiklik gösterdiği agrega halinde, 5 cm x 10 M. ^-3 tiol PEG konsantrasyonunu arttırmak Ayrıca, 30 dakika için tiol PEG ile inkübasyon süresi artar ve 200 x g santrifüj artışlarla hızını azaltır.
12. Kanser hücresi etiketleme testi için, ya da, orta veya 1x PBS (1 mi ~ 10 ⁶ hücre) kanser hücre süspansiyonu aşama 4,9 Antikorun konjuge nano-tanecikleri ekleyin ve 60 dakika için karıştırın.

Sonuçlar

Immunotargeted manyeto-plasmonik nanoklastırlaar sentezi için bir şema Şekil 2'de gösterilmiştir. İlk olarak, manyetik Fe ₃ O ₄ demir oksit nanopartiküller ısı ayrıştırma yöntemi yoluyla sentezlendiği. Daha sonra, ince yaklaşık 1 mil altın kabuk termal dekompozisyonu aracılığıyla demir oksit çekirdek partikülleri üzerine çökeltilir. Tohumlar bir yağ-içinde-su mikroemülsiyonu yaklaşımı kullanılarak manyeto-plasmonik nanoyığınlar oluşturmak için birincil yaklaşık 6 ...

Tartışma

Manyeto-plasmonik nanoklastırlaar başarılı sentezde kritik adımlar çok tek tek dağılmış birincil altın kabuk / demir oksit nano-tanecikleri yapma ve çekirdek nanoklastırlar içine birincil partiküllerinin öz düzeneğini yönlendiren içerir. Birincil parçacıklar ve yüzey aktif maddeler arasında bir mol oranı nanoklastırlaar boyut dağılımına belirlenmesinde önemli bir rol oynar. Birincil nanopartiküllerinin muntazam olmayan boyut dağılımı manyeto-plasmonik nanoklastırlaar montajı sırasında büyük agrega oluşumu olabilir. Buna...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
PYREX 50 ml kısa boyunlu ve 24/40 [ST] eklemli yuvarlak tabanlı kaynatma şişesi	Corning	4320A-50	Termal bozunma reaksiyonu
PYREX 41 x 300 mm 5 ampullü Allihn kondansatörü, 24/40 [ST] dış/iç eklemli	Corning	2480-300	Termal bozunma reaksiyonu
Silikon yağı	Fisher	S159-500	Yağ banyosu
Sıcak plaka karıştırıcı	Corning	PC-351	Karıştırma fonksiyonu ile reaktonu ısıtın
Termometre	ThermoWorks	221-092	Sıcaklığı ölçün
Demir (III) asetilasetonat	Fisher	AC11913-0250	Birincil hibrit nanopartikül sentezi için malzeme
Oleik asit% 99	Fisher	A195-500	Birincil hibrit nanopartikül sentezi için malzeme
Altın (III) asetat	Fisher	AA3974206	Birincil hibrit nanopartikül sentezi için malzeme
Hekzan	Fisher	H292-1	Birincil hibrit nanopartikül sentezi için malzeme
Fenil eter% 99	Fisher	AC13060-0025	Birincil hibrit nanopartikül sentezi için malzeme
1,2-Hekzadekanediol% 90	Sigma	213748-50G	Birincil hibrit nanopartikül sentezi
için malzemeOlelamin% 70	Sigma	O7805-100G	Birincil hibrit nanopartikül sentezi için malzeme
Sodyum dodesil sülfat	Fisher	BP166-100	Küme sentezi
Sodyum sitrat dihidrat	Sigma	W302600	Küme sentezi
Monoklonal anti-EGF reseptör antikoru	Sigma	E2156	Hücre etiketleme özgüllük testi
Monoklonal anti-HER2 antikor	Sigma	AMAB90627	Hücre etiketleme özgüllük testi
Sodyum periodat	Sigma	311448	Antikorların Fc bölgesini
okside etmek Ditiolataromatik PEG6-CONHNH2	SensoPath Teknolojileri	SPT-0014B	Nanokümelere antikor konjugasyonu için heterofonksiyonel bağlayıcı
Metoksi-PEG-tiyol, 5 k	Yaratıcı PEGworks	PLS-604	Antikor konjugasyonundan sonra kalan altın yüzeyi pasifleştirin
Ultracel-10 membranlı Amicon Ultra-4 santrifüj filtre ünitesi	Millipore	UFC801008	Protein saflaştırması
HEPES	Sigma	H3375	Tampon
PBS, 1x çözelti	Fisher	BP2438-20	Tampon
UV-Vis spektroskopisi	BioTek	Sinerji HT	Spektrum
Santrifüjü	Elde Edin Eppendorf	5810R	Ayırma
İletim Elektron Mikroskobu	FEI	TECNAI G2 F20 X-TWIN	Nanoyapıların morfolojisini elde
edin Dik mikroskop	Leica	DM6000	Karanlık alan görüntüleri elde
Sonicator	Branson	1510	Sonication
Karbon film 300 mesh ızgara		EMS CF300-Cu	TEM görüntüleme
96 kuyulu plaka	Corning	09-761-145	UV-Vis okuma plakası

edin