Yöntem makalesi

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

DOI:

10.3791/52095

⸱

18 Kasım 2014

 , 
1Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder, 2Linda Crnic Institute for Down Syndrome, University of Colorado, Denver

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNA'lar (miRNA'lar), yaygın olarak korunan bir düzenleyici molekül sınıfıdır. Burada, iki güçlü ligasyon adımına ve ardından yüksek verimli dizilemeye dayanan bir miRNA klonlama yöntemini açıklıyoruz. Yöntemimiz, miRNA'ların genom çapında doğru bir şekilde kantitasyonuna izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MiRNA klonlama ve yüksek verim sıralama, miR-Dizi, tek nükleotid çözünürlükte miRNA'lar ölçmek için bir transcriptome geniş bir yaklaşım olarak tek başına duruyor adlandırılır. Bu teknik MiRNA moleküllere 3 've 5' oligonükleotid adaptörler takılarak miRNA'lar yakalar de novo miRNA keşif sağlar. Güçlü yeni nesil dizileme platformları ile birleştirilmesi sonucu, miR-Seq miRNA biyoloji çalışmaya vesile olmuştur. Ancak, oligonükleotid ligasyon adımlarla tarafından tanıtıldı önemli önyargılar doğru bir kantitasyon aracı olarak istihdam edilmesini miR-seg engellemiştir. Önceki çalışmalar, mevcut miR-Dizi yöntemleri önyargıları genellikle bazı miRNA'ların 1,2 1.000 kata kadar hataları ile yanlış miRNA miktar yol açtığını göstermektedir. RNA ligasyonu ile kazandırılan bu önyargıları gidermek için, biz de 3 've 5' ligasyon adımlar için% 95'in üzerinde ligasyonu verimliliği ile sonuçlanan bir küçük RNA ligasyonu yöntemi geliştirdik. Bu im Kıyaslamasürekli beklenen değerden az iki kat sapmayla numaraları okur verir, eşit molar veya farklı olarak karışık sentetik miRNA'lar kullanarak kitaplık inşaat yöntemi olduğunu kanıtladı. Ayrıca, bu yüksek verimli miR-Dizi yöntem in vivo toplam RNA örneklerinde 2 doğru genom miRNA profilleme izin verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek verim sıralama tabanlı metodolojileri yaygın ölçüde biyolojik sistemlerin 3,4 moleküler karmaşıklığı anlayışımızı genişleyen son yıllarda birçok biyolojik numunelere uygulanmıştır. Ancak, yüksek sekanslama için RNA örneklerinin hazırlanması çoğu zaman, bu güçlü teknikleri potansiyel kullanımını sınırlayan çalışan yönteme özgü belirli bir yanlılığı kazandırır. Bu yöntem, belirli önyargıları iyi ligasyon-temelli, küçük RNA kütüphane hazırlıkları 1,2,5,6 için belgelenmiştir. Bu önyargıları 1,000 kat varyasyon çılgınca değişken ve hata eğilimli sıralama verilerinden miRNA bereket çıkarsama yapma, eşit molar sentetik miRNA'ların için sayıları okur sonuçlanabilir.

Faj türevli, T4 RNA ligazların özelliklerine odaklanarak çalışmalar enzimler yüksek verimli sekanslama deneylerde belirlendiği gibi yanlı kitaplıkları ortaya nükleotid bazlı tercihleri ​​7, olduğu belgelenmiştir adres kadar. RNA, ligazlar tarafından kazandırılan hatalarını en aza indirmek için, birden fazla stratejiler kullanılmıştır; makromoleküler, 9 boğmakta ligasyon siteye 6 proksimalinde adaptör üzerinde nükleotid dizisi randomizing ve ligasyon adaptörü 2 yüksek konsantrasyonlarda istihdam. Bu üç yaklaşımların bir kombinasyonu sayesinde yüksek verimlilik sıralaması (Şekil 1) uyumlu küçük RNA kütüphanelerin tarafsız hazırlanması için bir iş akışı geliştirdik. Mevcut protokoller ve optimize edilmiş bir yöntemle arasında doğrudan karşılaştırmalar için, bizim son raporunda 2 başvurun. Bu optimize edilmiş yöntem her iki 3 've 5' aşamalarında% 95'ten ligasyonu verim alınmasını sağlamaktadır, sentetik ve biyolojik örnekler 2 küçük RNA moleküllerinin tarafsız bağlanmasını izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Bu, tüm işlem boyunca RNase içermeyen koşulları sağlamak için çok önemlidir.

3 'Bağlayıcının 1. Adenylation

  1. Nükleaz içermeyen H2O içinde 100 uM 3 ligasyon reaksiyonları için tasarlanmış DNA oligonükleotid seyreltin
    Not: oligonükleotidi bir 5 'fosfat grubu, 5 bir randomize dinükleotid' ucuna ve 3 'dideoxycytosine olmalıdır. 5 PCP 10 'fosfat grubu etkili 5 için Mth enzimin bir gerekliliktir'. Fosfat doğrudan modifikasyonu ile bir polinükleotid kinaz ile oligonükleotidin ön-muamele ile ilave ya da istenebilir. 5 'ucunda, randomize dinükleotit hangi belirli bir son uç diğerleri üzerinde 6 tepkileri birleştirilmesi için bir RNA ligaz sergiler sekansı tercih en aza indirmek için önemlidir. 3, oligonükleotid t 'ucuna dideoxycytosine 3 bir blokaj elemanının yerleştirir'O sonraki bağlama adımları sırasında bağlayıcı-bağlayıcı konkatamerler oluşumunu inhibe eden ve aynı zamanda bağlama reaksiyonu, 11 3 '3'ün ucunda oluşturulan miRNA-Bağlayıcı molekülün ucunu' için blok teşkil eder. Aşağıdaki gibi tarafsız miR-Dizi yöntemi için seçilen oligonükleotid linker dizisi olduğu için: 5'PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3. '
  2. 200 pmol 3 'oligonükleotidi, 4 ul 10x için 5' DNA adenilasyon tampon maddesi, 4 ul 1 mM ATP, 4 ul Mde RNA ligaz, nükleaz içermeyen H2O 40 ul'lik nihai bir hacme kadar: Aşağıdaki adenilasyon reaksiyon bir araya getirin.
  3. 1 saat boyunca 65 ° C'de reaksiyon inkübe edin. 5 dakika boyunca 85 ° C'ye ısıtılması yolu ile reaksiyonu bitirin.
  4. Kalıntı ATP kaldırmak ve gelecekteki reaksiyonlarda beklenmedik ligasyonu önlemek için% 100 2.5 hacim etanol ve 10 M amonyum asetat 1/3 hacme ilavesiyle adenylated bağlayıcı çökeltilmesi.
    1. Kısaca, al karıştırıncohol, tuz ve 20 dakika boyunca 4 ° C'de bir mikrosantrifüj içinde tam hızda eğirme homojenlik oligo çözeltisi (~ 15,000 xg). Adenylated oligo 50-100 uM vermek üzere nükleaz içermeyen H2O uygun hacimde% 70 etanol, kuru hava ve tekrar süspansiyon pelet yıkayın.
  5. % 18 poliakrilamidjeli çalıştırarak adenilasyon onaylayın.
    1. Birlikte, aşağıdakileri karıştırarak jel hazırlayın: 6.3 g üre,% 40 akrilamid 6.75 mi, ve 10x TBE 1.5 mi. H 2 O 15 ml ilave edilir.
    2. Üre tamamen çözülene kadar karıştırın ve amonyum persülfat (BP), ve 15 ul tetramethlyethylenediamine (TEMED) (ağ / hac), 150 ul% 10 ekleyin.
    3. Jel 1x TBE oda sıcaklığında tampon maddesi ile jel genişliğinin 24 V / cm 'de 30 dakika boyunca ön-run kurduğunda. Tamponu ile çalışan 30 dk kadar bir kez yıkayın kuyular.
    4. Ile adenylated oligonükleotitlerin ve 2x denatüre RNA yükleyici tampon eşit hacimde (% 95 (h / h) formamid 5 pmol karıştırın% 0.02 SDS,% 0.02 bromofenol mavisi (ağırlık / hacim),% 0.01 (ağırlık / hacim) (w / v) Ksilen siyanol, 1.0 mM EDTA) içinde, ısı kısa bir süre için 75 ° C ve buz üzerinde soğutuldu oturmaktadır. Jelin kuyuya, örneğin tamamına koyun. Aynı zamanda, bir sigara adenylated kontrol benzer bir miktar ve düşük molekül ağırlıklı boyutu standartlarına uygun bulunmaktadır.
    5. Bromofenol mavi jel tabanına yol ¾'ünü kadar 24 V / cm jel üzerinde çalıştırıldı. 1x TBE 1x SYBR-altın çözeltisi ile cihaz, post-leke jel sökmeye ve UV-transilluminator'de kutusu (Şekil 2) görselleştirmek.
      Not: girdi RNA örnekleri ile karşılaştırıldığında Jel ", herhangi bir giriş RNA 'olarak kontrol PCR ürününün yüksek miktarda elde edilir, yukarıda tarif edilene benzer bir şekilde adenylated oligo temizler.

2. Bağlayıcı Ligasyon miRNA 3 'ucuna

  1. 3 'Ligasyon
    1. (Ağ / hac) PEG 8000, 0.5 ve 1.0 ul% 50: sıraya uygun olarak buz üzerinde, aşağıdaki bileşenleri monte956. l 10x RNA ligaz tamponu (500mM Tris-HCI pH 7.5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1.0 ul, 3 'Linker (100 uM), 0.5 ul RNaz inhibitörü, 0,5-8,0 ug toplam RNA, adenylated 0.5 ul T4 RNA ligaz, 2, 5 ul'lik nihai bir hacme kadar nükleaz içermeyen H2O.
    2. Çözelti girdaba çok viskoz olduğu gibi bağlı bir kez iyice karıştırılır PEG 8000 yüksek konsantrasyonu pipetleme tepkime karışımı ısıtılmış kapak ile, bir termal döngü reaksiyonu yerleştirin. 16 ° C'ye kadar bloğu ayarlama, ve 4 saat süreyle inkübe edin.
      Not: Reaksiyon bağlanma verimliliği herhangi bir kayıp olmadan 20 ul bir son hacme kadar ölçeklendirilebilir. Çevre sıcaklığında 4 saat boyunca reaksiyona girmesi ya da gece boyunca 4 ° C 'de esas itibarıyla benzer bağlanma verimliliği elde edilir.
  2. Jel saflaştırma
    1. 3 'Ligasyondan sonra, 2x RNA yükleyici tampon maddesinin eşit hacmi ile reaksiyona karıştırın. 5 dakika boyunca 70 ° C'ye kadar ısı ve buz üzerinde serin ek.
    2. PAGE arıtılması için bir% 15 poliakrilamid jeli üzerinde örnek çalıştırın.
      1. Adım 1.5'te daha önce tarif edilene benzer bir şekilde, 7 M üre ihtiva eden bir% 15 poliakrilamid jelinde hazırlayın.
      2. En az 30 dakika boyunca jel genişliği 24 V / cm jel ön çalıştırın. Öncesi dönemde aynı geriliminde güç kaynağı, floş kuyuları, yük örnek ve çalışma jel kapatın.
      3. Örnek yükleyin ve Bromophenol mavi jel çıkıldı sadece kadar PAGE çalıştırın. Arzu edilen ürün, iksilen siyanol yakın hareket edecektir.
  3. Boyama, Görselleştirme ve Eksizyon
    1. 15 dakika boyunca 1x çalışan tampon (TBE), 1x SYBR-altın ve kaya temiz tepsiye jel aparat ve yer jel sökmeye.
    2. Boyanması çanak jel çıkarın ve temiz bir plastik wrap ile kaplı UV transilluminator'de kutusunda görselleştirmek. Ligasyon ürünü, uzunluğu yaklaşık 45 nükleotid olacaktır.
    3. Temiz bir Razo ile ligasyon ürünü içeren bölgeyi tüketim0.5 ml mikro-santrifüj tüpüne r bıçak ve yer.
  4. Ürün İzolasyon ve Yağış
    1. Pierce, 30 G iğne ile 0.5 ml mikrosantrifüj tüp alt ve ikinci bir temiz, düşük tutma deldi tüp yeri, 1.5 ml mikrosantrifüj tüp. ~ 15,000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
    2. Görme tüm jel dilim iç tüp delikten hareket ettiğini teyit etmektedir. Gerekirse, yakın deliğe bazı jel parçaları itmek için temiz bir pipet kullanın.
    3. Boş 0.5 mi tüp atılır ve akrilamid bulamaca yüksek tuzlu kolon tamponu 400 ul (25 mM Tris-HCI pH 7.5,% 0.1 SDS HSCB 400 mM NaCl) ilave edin. Gece boyunca 4 ° C 'de kaya tüpü (s).
    4. Geniş çaplı bir pipet kullanarak 0.22 mikron selüloz asetat spin kolon bulamaç aktarın. ~ 15,000 x g'de, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca santrifüje uzaklıkta akrilamid jel matrisi tüm sıvı toplamak.
    5. Temiz, düşük tutma sıvı transfer, 1.5 ml tüp içerir20 mg / ml glikojen 1 ul ing. Bir izopropanol eşit hacim ve 10/1 inci hacim sodyum asetat ekleyin. Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek çözeltisi karıştırın ve 20 dakika boyunca ° C sıcaklıkta dondurucuya -80 hızlandırabilir.
    6. 20 dakika boyunca 4 ° C 'de tam hızda santrifüje nükleik asidi: pelet. Süpernatantı ve% 70 etanol içinde yıkayın. Havada kurutma, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile pellet halindedir ve 5 'bağlama adımı doğrudan devam edin.

Bağlayıcı Hybrid 3. Bağlayıcı ligasyon 5 'miRNA-3 Sonu'

  1. Tanelenmiş nükleik asit için, aşağıdaki bileşenler eklemek: 2 ul PEG 8000 (% 50 ağırlık / hacim), 0.5 ul 10x RNA ligaz tamponu, 0.5 ul ATP (10 mM), 0.5 ul NN-RNA, oligo (100 uM), ve H 4 ul bir son hacim 2 O.
    NOT: 5'-ters dideoksi-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 "ifadesi ve üretici tarafından HPLC ile saflaştırıldı 'NN-RNA, oligo' in bileşimi olup.
  2. Karıştırmakaşağı defalarca yukarı pipetleme ve bu örnek. Pelet tamamen yeniden solübilize olmuştur emin olmak için bir süre (5 dk) için yapın. Yeniden-solübilizasyon sorunlu ise, 37 ° C örnek kısaca (3-5 dk) ısı ve karıştırmak için pipetlenmesini devam.
  3. RNaz inhibitörü ve T4 RNA ligaz 1 (5 birim): 1'lik bir karışımı topak çözelti içinde geri sonra, bir 1 1 ul içeren temiz bir PCR tüpü aktarılmaktadır. Yine aşağı yukarı pipetleme karıştırın.
  4. 4 saat 37 ° C'de bir termal döngü reaksiyonu inkübe edin. CDNA sentezi hemen geçin.

4. ters transkripsiyon / cDNA Sentezi

  1. 5 Aşağıdaki bileşenleri ekleme ligasyon reaksiyonu: 2 ul 5X RT tampon maddesi, 0,75 ul 100 mM DTT, 1 ul Illumina RT primer 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3 '(1 uM) ve 0.5 ul dNTP (10 mM) getirilmiştir.
  2. 5 dakika boyunca 65 ° C'ye kadar pipetleme ve ısı ile karıştırın. Sonra yavaş yavaş tezgah t üzerinde soğumasınıop.
  3. Reaksiyon, buz üzerinde, oda sıcaklığında, bir yer tüpüne soğutuldu ve ters transkriptaz enzimi ve RNase inhibitör her biri 0.5 ul ekleyin sonra. Imalatçının talimatlarında belirtildiği uzatma aşaması için ısı döngüleyici içinde pipetleme ve yerine göre karıştırın.
  4. Tamamlandığında eklenti nükleaz içermeyen H2O 5 ul 15 ul kadar cDNA kütüphanesinin son hacmi getirmek.

5. Kütüphane hazırlanması

  1. Endeksleme PCR için, buz üzerinde, aşağıdaki reaksiyon monte: 6 ul 5x Phusion Tampon, 1 ul dNTP (10 mM), 0.9 ul DMSO, 0.75 ul 5 'primer (25 uM), 0.75 ul 3' primer (25 uM), 3 ul cDNA kütüphanesi (girdi miktarına bağlı olarak değişken konsantrasyon), 0.5 ul Phusion Polimeraz (1 ünite), 30 ul'lik nihai bir hacme kadar nükleaz içermeyen H2O. Şablonun ve sıralama platformu ile uyumluluğu sağlamak için primer dizileri seçinseçim.
    1. 15 saniye için 72 ° C 'de uzanmaktadır, birinci 4 çevrim için, 3 dakika boyunca 98 ° C de ilk denaturasyon 15 sn için 50 ° C'de 15 saniye, tavlama için 98 ° C denatüre: PCR, aşağıdaki ayarlarla bir reaksiyondan .
      NOT: giriş malzemenin miktarına bağlı olarak, toplam PCR çevrim numaraları değişir. Tipik olarak, toplam RNA 1-2 ug bir giriş için, 13 toplam PCR döngüleri mıR-Dizi kütüphane oluşturmak için yeterlidir.
    2. Tavlama ve uzatma çevrimi bir araya getirilmiş ve 30 sn için ve denatürasyon için 70 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilmektedir, iki aşamalı bir şekilde, örneğin daha sonraki aşamalarda, durulamalar, 5-12, yürütmek tekrar 15 sn için 98 ° C 'dir.
      Not: Reaksiyon hacmi PCR programı duraklatma izin veren ve arzu edilen ürün bir görünüm için izlemek için önceden belirlenmiş bir döngü sayılarında, 10 ul bir kısım kaldırmak üzere 30 ul. Tipik haliyle, çevrimleri 10, 13 ve 16 toplam RNA numunesinin test için seçilir.
  2. Hazırlamak% 40 akrilamid ve 2 ml 10x TBE 1 ml, ve H2O 10 ml karıştırılarak% 8 denatüre edici olmayan akrilamid jeli. Daha sonra% 10 APS 100 ul ve TEMED 10 ul ekle. Jel dökün ve set edelim.
    1. 30 dakika boyunca jel genişliği, 12 V / cm jel ön çalıştırın. Floş kuyular. 10x yükleme tamponu 1 ul ekle (15% Ficoll 400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI, pH 8.0,% 0.1 (ağ / mavi / hacim) bromofenol hac) SDS,% 0.01 () 10 ul ekle boyutları her çukuruna 5 mm x 1 mm x 15 mm numune. Tipik olarak, her iyi örneklerin 30 ul yükleyebilirsiniz. Bromofenol mavi boya sadece jel alt bitene kadar 1x TBE tamponu içinde, jel genişliği 10 V / cm 'de örnek jel üzerinde çalıştırıldı.
    2. Leke ve aşama 2.3'de tarif edildiği gibi jel görselleştirmek.
    3. 146 baz çift bant pulu ve Bölüm 2.4 de tarif edilene benzer bir şekilde, HSCB 0.25 ml, gece boyunca tasfiye edilir. Bir izopropanol eşit hacimde ve 10/1 inci hacim sodyum asetat DNA hızlandırabilir. % 70 e yıkama peletTE tamponunda -metanol ve tekrar süspansiyon.
    4. Üreticinin tavsiyelerine göre PicoGreen kullanarak kütüphane niceliğini.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki yöntemi için beklenen sonuçlar, ilk (Şekil 2) Mde RNA ligaz ile PCP tabi tutuldu DNA oligonükleotidin büyüklüğünde tek bir nükleotid vardiya (artış) gözlenmesi gerekir. 3 'bağlanmasından sonra, akrilamid jel görselleştirme (bakınız Şekil 3), jel, 100-300 nükleotid bölgesinde barizdir net, yüksek molekül ağırlıklı bant gösterir. Bu kullanılan toplam RNA numunesi yüksek kalitede olduğunu gösterir (bozulmuş değil). İkinci olarak, bir aşırı olan jelli 25 nükleotid bölges...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu tarifnamede anlatılan yöntemler, bağlama verimliliği, yani PEG, randomize bağlayıcıların kullanımı yüksek konsantrasyonlarda ve bağlayıcıların 2,6,9 yüksek konsantrasyonu en üst düzeye çıkarmak için birkaç anahtar değişkenlerden kullanır. Bu yaklaşım, total RNA örnekleri 2 güvenilir kantitatif sıralama kütüphaneleri izin verir. Biz giriş RNA'nın çoklu titrasyonlarını yaptık ve önceki metodoloji (veriler gösterilmemiştir) 1-8 mikrogram aralığında toplam RNA tutarlar için en uygun olduğu sonuc...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bağlayıcı tasarımı ve ligasyon verimlilikleri ile ilgili verimli tartışmalar için Yi laboratuvarı üyelerine, özellikle Zhaojie Zhang'a ve bu çalışmayı JEL ile doktora sonrası burs (#125209) aracılığıyla destekleyen Amerikan Kanser Derneği'ne teşekkür eder. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Artrit ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü tarafından da Ödül Numarası altında desteklenmiştir R01AR059697 (R.Y.'ye) ve Linda Crnic Down Sendromu Enstitüsü'nden bir araştırma bursu. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3' Bağlayıcı (5' fosforillenmiş, 3' bloke edilmiş)Entegre DNA Teknolojileriözel
5' BağlayıcıEntegre DNA Teknolojileriözel5' bloke edilmiş, HPLC saflaştırılmış
T4RNL2 (1-249 K227Q)New England BiolabsM0351SÖnceden adenillenmiş DNA adaptörlerinin ligasyonu için uzmanlaşmıştır
10x Ligasyon tamponu (ATP olmadan)New England M0351S
10x Ligasyon tamponu ile Birlikte Verilen Biolabs (ATP ile)New England BiolabsM0204L
RNaseOUTInvitrogen10777-019
Polietilen glikol ile Birlikte Verilir (mol. Wt. 8,000)New England BiolabsM0204L
Nükleaz içermeyen suAmbionAM9937ile DahildirBir damıtma cihazından toplanan suyun eşit kalitede olduğunu bulduk.
T4RNL1New England BiolabsM0204L
Superscript III RT kitiInvitrogen18080-051 
Phusion PCR kitiNew England BiolabsM0530S
Illumina RP1 astarıEntegre DNA TeknolojileriözelDizi bilgileri Illumina'dan temin edilebilir Illumina
RT astarıEntegre DNA TeknolojileriözelDizi bilgileri Illumina'dan temin edilebilir
Illumina indeks primer(ler)iEntegreDNA TeknolojileriözelIllumina'dan temin edilebilen dizi bilgileri
%40 AkrilamidFisher ScientificBP14081
ÜreSigma AldrichU6504
Amonyum persülfatSigma AldrichA3678
Tetrametilendiamin (TEMED)Sigma AldrichT9281
2x Denatüre RNA yükleme tamponuNew England BiolabsDahil M0351S
Tıraş bıçaklarıile VWR55411-050
SpinX Centricon tüpleriCostarCLS8161
Düşük tutma mikrofüj tüpleriFisher Scientific02-681-320
Sybr AltınInvitrogenS-11494
Adenilasyon kitiNew England BiolabsE2610L

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
  2. Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109(2013).
  3. Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
  4. Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  5. Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
  6. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141(2011).
  7. McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
  8. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54(2012).
  9. Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
  10. Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
  11. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
  12. Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
  13. Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

K k RNA LigasyonuOligon kleotid Adapt rlermiR Seq Y ntemiRNA Ligasyon Verimlili iJel PurifikasyonucDNA SenteziPolimeraz Zincir ReaksiyonuSentetik miRNA lar

İlgili makaleler