Yöntem makalesi

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

DOI:

10.3791/52104

⸱

11 Kasım 2014

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center, The University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at Houston

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA-sıralama ve biyoinformatik analizler fare EMLcells Lin-CD34 + ve Lin-CD34 alt gruplarda anlamlı ve farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu transkripsiyon faktörleri kendini sürekli yenileyen Lin-CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-CD34 hücreleri arasındaki geçiş belirlenmesinde önemli rol oynayabileceğine.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoetik kök hücreler (HSC), lösemi ve lenfoma gibi birçok hastalıkta hastanın hematopoetik sistemi yeniden inşa etmek nakli tedavisi için klinik olarak kullanılmaktadır. HSC kendini yenileme ve farklılaşmasını kontrol eden mekanizmaların tanıtılması araştırma ve klinik kullanım için HKH'lerin uygulaması için önemlidir. Bununla birlikte, bunun nedeni, in vitro proliferasyonu edemedikleri için HKH'lerin büyük miktarda elde etmek mümkün değildir. Bu engeli aşmak için, bu çalışma için, bir model sistem olarak, bir fare kemik iliği türevi hücre hattı, EML (eritroid, miyeloid ve lenfositik) hücre hattı kullanılmıştır.

RNA sıralaması (RNA-Dizi) giderek artan bir gen ifade çalışmaları için mikrodizisi değiştirmek için kullanılmıştır. Biz burada EML hücre kendini yenileme ve farklılaşma düzenlenmesinde potansiyel anahtar faktörleri araştırmak için RNA-Sıra teknolojisini kullanarak ayrıntılı bir yöntem rapor. Bu yazıda verilen protokol üç bölüme ayrılmıştır. Ilk part nasıl kültür EML hücreleri ve ayrı Lin-CD34 + ve Lin-CD34 hücreleri açıklar. Protokolün ikinci bölümü, toplam RNA hazırlama ve yüksek sekanslama için daha sonra kütüphane yapımı için ayrıntılı prosedürler bulunmaktadır. Son bölüm RNA-Dizi veri analizi için yöntem açıklanır ve Lin-CD34 + ve Lin-CD34 hücreleri arasındaki farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri belirlemek için verilerin nasıl kullanılacağını açıklar. En önemli ölçüde farklı olarak ifade transkripsiyon faktörleri EML hücre kendini yenileme ve farklılaşmasını kontrol eden potansiyel kilit düzenleyiciler olduğu tespit edildi. Bu yazının tartışma bölümünde, bu deney başarılı performans için önemli adımlar vurgulayın.

Özetle, bu kağıt EML hücrelerinde kendini yenileme ve farklılaşma potansiyeli regülatörleri belirlemek için RNA-Sıra teknolojisini kullanarak bir yöntem sunar. Belirlenen anahtar faktörler in vitro ve i aşağı fonksiyonel analize tabi tutulurlarin vivo koşullarda.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoetik kök hücreler erişkin kemik iliği niş ağırlıklı olarak ikamet nadir kan hücreleridir. Bunlar, kan yeniden doldurmak için gereken hücreleri ve immün sistem 1 üretimi için sorumludur. Kök hücrelerin bir tür olarak, HSC kendini yenileme ve farklılaşma kabiliyetine sahip bulunmaktadır. HKH'lerin kaderi kararını kontrol mekanizmaların tanıtılması, kendini yenileme veya farklılaşma ya doğru, kan hastalığı araştırmalar ve klinik kullanım için 2 HKH'lerin manipülasyon değerli rehberlik sunacak. Araştırmacılar tarafından karşılaşılan bir sorun, HSC muhafaza ve çok sınırlı bir ölçüde, in vitro olarak genişletilebilir olabilir; soylarına büyük çoğunluğu kısmen kültür 2 ayrıştırılmıştır.

Genom ölçeğinde kendini yenileme ve farklılaşma süreçlerini kontrol tuşuna regülatörleri tanımlamak için, biz bir model sistem olarak bir fare ilkel hematopoetik öncül hücre hattını EML kullanılır. Thhücre hattı fare kemik iliği 3,4 türetilmiştir edilir. Farklı büyüme faktörleri ile verildiğinde, EML hücrelerin in vitro 5 eritrosit, miyeloid ve lenfoid hücrelerine dönüştürmek olabilir. Önemli olarak, bu hücre hattı kültürü ortamı bunların multipotentiality tutma hala kök hücre faktörü (SCF) ihtiva eden ve büyük miktarda çoğaltılabilir. EML hücreler kendini sürekli yenileyen Lin-SCA + CD34 + alt popülasyonlar ayrılır ve kısmen yüzey belirteçleri CD34 ve SCA 6 dayalı Lin-SCA-CD34 hücreleri ayırt edilebilir. Kısa vadeli HKH'lerin, SCA + CD34 + hücrelerde de benzer kendini yenileme edebiliyoruz. Hızla Lin-SCA + CD34 + ve Lin-SCA-CD34 hücre karışık bir nüfus yeniden ve 6 çoğalmaya devam edebilirsiniz SCF, Lin-SCA + CD34 + hücre ile tedavi edildiğinde. Popülasyonlar morfolojik olarak benzer ve c-kit mRNA ve protein 6 benzer seviyelerine sahiptir. Lin-SCA-CD34 hücreleri, IL-3 yerine SCF3 ihtiva eden ortam içinde yayılan yeteneğine sahiptirler. Unveiling hematopoiez sırasında erken gelişimsel geçiş hücresel ve moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sunacak EML hücre kaderinin kararda kilit düzenleyiciler.

Kendini sürekli yenileyen Lin-SCA + CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-SCA-CD34 hücreleri arasındaki yatan moleküler farklılıkları araştırmak amacıyla, farklı şekilde ifade genleri tanımlamak için RNA-seg kullanılır. Transkripsiyon faktörleri hücre kaderini belirlemede önemli olduğu gibi, özellikle biz, transkripsiyon faktörleri odaklanmak. RNA-Seq profil ve genom 7,8 transkripsiyonu RNA'lar ölçmek için (NGS) teknolojileri yeni nesil dizileme yeteneklerini kullanan yeni geliştirilmiş bir yaklaşımdır. Kısaca, total RNA, poli-A, ilk template.The RNA şablonu ile sonra ters transkriptazı kullanılarak cDNA'ya dönüştürülür olarak seçilir ve parçalanmış. CDNA kütüphanesinin oluşturulması için sağlam olmayan bozulmuş RNA kullanılarak, tam uzunlukta RNA transkriptlerinin haritasını yapmak için önemlidir. Amaçlarlasekanslama poz, belirli bir adaptör dizileri cDNA'nm her iki ucuna eklenir. Daha sonra, bir çok durumda, cDNA molekülleri, PCR ile amplifiye edilmiş ve yüksek verimli bir şekilde dizildi.

Sekanslama sonra, elde edilen bir bir referans genom ve transkriptom veritabanına hizalanabilir okunur. Sayısı referans gen haritası sayılır ve bu bilgi gen salgılama seviyesini tahmin için kullanılabileceğini okur. Ayrıca sigara model organizmaların 9 transcriptomes incelenmesini sağlayan bir referans genom olmadan de novo monte edilebilir okur. RNA-DİZ teknolojisi aynı zamanda ek yeri izoformları 10-12, yeni transkriptler, 13 ve gen füzyonlarının 14 tespit etmek için kullanılmıştır. Protein kodlayan genlerin saptanması ek olarak, RNA Dizi aynı zamanda gibi kodlayıcı olmayan RNA'lar, transkripsiyonu seviyesini roman tespit ve analiz etmek için kullanılabilir uzun siRNA'nın vb 18 RNA 15,16, mikroRNA 17, kodlayıcı olmayan. Çünkü tBu yöntemin de hassasiyeti, tekli nükleotit varyasyonları 19,20 tespiti için kullanılmıştır.

RNA-Seq teknolojisinin gelişiyle önce, mikrodizin gen ifadesi profili analiz etmek için kullanılan ana yöntem oldu. Önceden tasarlanmış probları sentezlenebilir ve daha sonra, mikro-dizi slayt 21 oluşturmak üzere bir katı yüzeye bağlanır. mRNA, ekstre edilmiş ve cDNA'ya dönüştürülür. Ters transkripsiyon işlemi sırasında, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin cDNA dahil edilir ve cDNA mikrodizi slaytlar üzerine hibridize edilebilir. Belirli bir noktaya toplanan sinyalin yoğunluğu, bu noktada 21 spesifik prob bağlanma cDNA'nın miktarına bağlıdır. RNA-Seq teknolojisi ile karşılaştırıldığında, mikrodizin çeşitli sınırlamalar vardır. RNA-Seq teknoloji kullanımını zaman sınırlar görece yüksek arka plan düzeyinde roman transkript tespit edebiliyor iken Birincisi, mikrodizin, gen şerhin önceden varolan bilgiye dayanır gene ifade seviyesi düşüktür. Bağlı arka plan ve sinyallerin doymaya mikrodizisinin hassasiyeti de, yüksek ve aşağı ifade edilen genlerin 7,22 ile sınırlıdır, oysa Bunun yanı sıra, RNA-Dizi teknoloji, algılama (8.000 kat) 7 çok daha yüksek bir dinamik aralığı vardır. Son olarak, mikrodizi probları bir örnek 23 içindeki farklı transkriptlerinin nispi temsil seviyelerini karşılaştırırken sonuçları daha az güvenilir hale hibritleştirme verimlilikleri, farklıdır. RNA-Seq mikrodizisinden üzerinden pek çok avantajı olmasına rağmen, veri analizi karmaşık. Bu, birçok araştırmacılar hala RNA-Sek yerine mikrodizisini kullanmak nedenlerinden biridir. Çeşitli biyoinformatik araçları RNA-Dizi veri işleme ve analiz 24 için gereklidir.

Birkaç nesil dizileme (NGS) platformlar arasında, 454, Illumina, KATI ve İyon Torrent en yaygın kullanılan olanlardır. 454 ilk ticari NGS platform oldu. Diğer sıralama platformlar aksineBu tür Illumina ve bir katı halinde, 454 platformu okunmayacak oluşturur uzunluğu 25 (ortalama 700 baz kaydeder). Nedeniyle daha uzun daha yüksek verim 25 monte onların için transcriptiome ilk karakterizasyonu için daha iyi okur. 454 platformunun ana dezavantajı dizisinin megabase başına yüksek maliyet. Oluşturmak Illumina ve KATI platformları sayısının artması ve kısa uzunluklarda okur. Dizisinin megabase başına maliyet 454 platformu çok daha düşüktür. Nedeniyle Illumina ve SOLID platformları için okur kısa, çok sayıda, veri analizi çok fazla hesaplama yoğundur. İyon sel platformu için sıralama için alet ve reaktiflerin fiyatı ucuzdur ve sıralama süresi 25 daha kısadır. Ancak, hata oranı ve dizinin megabase başına maliyeti yüksek Illumina ve SOLID platformlara karşılaştırılır. Farklı platformlar kendi avantajları ve dezavantajları vardır ve veri analizi için farklı yöntemler gerektirir. Platform sıralama amacı ve finansman durumuna göre seçilmelidir.

Bu yazıda, bir örnek olarak Illumina RNA-Dizi platform almak. Biz EML hücre kendini yenileme ve farklılaşma anahtar düzenleyicileri araştırmak için bir model sistem olarak EML hücresi kullanılan ve ifade seviyesi hesaplama ve roman transkript tespiti için RNA-Dizi kütüphane yapımı ve veri analizi yöntemleri ayrıntılı sağladı. Biz EML model sisteminde 2 RNA-seq çalışma, zaman fonksiyonel testi (örn ShRNA demonte) hematopoetik farklılaşma erken aşamalarında moleküler mekanizmasının anlaşılması açısından güçlü bir yaklaşım sağlamak ile birleştiğinde bizim önceki yayın göstermiştir, ve bir olarak hizmet verebilir genel olarak hücre kendini yenileme ve farklılaşma analizi için bir model.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. EML Hücre Kültürü ve Sistem ve sıralama Manyetik Hücre kullanma Lin-CD34 + ve Lin-CD34 Hücrelerinin Ayırma Floresan aktive Hücre Ayırma Yöntemi

  1. Kök hücre faktörü toplanması için bebek hamster böbrek (BHK) hücre kültür ortamının hazırlanması:
    1. 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatöründe,% 5 CO2 seviyesinde 25 cm2 bir şişede (Tablo 1)% 10 FBS içeren DMEM aracı madde içinde kültür BHK hücreleri.
    2. Hücreler 80 genişlediğinde, -% 90 birleştiği, 10 ml PBS ile bir kez hücreleri yıkayın. Tek tabaka için% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi 5 ml ilave edilir ve hücreler, müstakil kadar oda sıcaklığında (RT) 1-5 dakika boyunca kuluçkalayın.
    3. Pipet hafifçe aşağı çözüm yukarı ve hücrelerin öbekler kırmak için. Tripsin aktivitesi durdurmak için şişeye bitmiş DMEM 5 ml. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile hücreler toplanır.
    4. Ortamı çıkarın ve taze BHK hücre kültür ortamı, 10 ml hücre pelletini.
      5. Transferi 2 yeni bir 75 cm'lik 2 şişeye aşama 1.1.4 gelen hücre süspansiyonu ilave edildi ve şişeye taze BHK hücre kültür aracı maddesi 48 ml ilave ediniz.
  2. Kültür BHK iki gün hücreler ve kültür ortamının toplanması. Geçişi, bir 0.45 um filtre içinden ortamı. Bir sonraki kullanıma kadar -20 ° C 'de orta saklayın.
  • EML hücre kültürü:
    1. Bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde BHK hücre kültür ortamı (Tablo 1) ihtiva eden EML bazik bir ortamda kültür EML hücreleri (süspansiyon).
    2. Tepe yoğunluğu en az 6 x 10 5 hücre / ml düşük hücre yoğunluğunda (0.5-5 x 10 5 hücre / ml) EML hücreleri koruyun. 1 oranında her 2-3 günde bir hücreleri bölün: 5'tir. Passage EML hücreleri nazikçe ve 10 nesiller için pasaj sonra kültürünü atın.
  • Soyu pozitif hücrelerin tükenmesi:
    1. 200 xg FO santrifüj ile EML hücreler hasatR, 5 dakika, bir kez PBS ile hücreleri yıkayın. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile hücreler toplanır.
    2. Hücrelerin PBS ile yeniden süspanse edin ve bir hemositometre ile hücreleri sayın. (Hücre izolasyon sisteminin sağlayıcı tarafından sunulan talimatlara bakınız) hücre sayısına bağlı olarak takip eden hücre ayrıştırma aşamasında antikor konsantrasyonunu belirler.
    3. Soy negatif (Lin-) izole nesilli antikor kokteyli (biyotin-konjuge monoklonal antikor kokteyli hücreleri, CD5, CD45R (B220), CD11b, anti-Gr-1 (Ly-6G / C) 7-4 ve Der-119 ) ve üreticinin talimatlarına göre, bir manyetik etkinleştirilmiş hücre tasnif sistemi.
  • Lin-CD34 + ve Lin-CD34 hücre ayrımı:
    1. 5 dakika boyunca 200 xg'de adım 1.3.3 gelen Lin hücreleri aşağı doğru döndürün. PBS ile hücre pelletini ve bir hemositometre ile hücreleri sayın.
    2. FACS tamponu ile iki kez hücreler yıkanır ve 200 x g'de, hücreleri topaklamak5 dakika karıştırıldı.
    3. Sırasıyla sayı 1, 2, 3, 4, 5, beş, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri etiketleyin. 10 6 hücre (tüp başına 10 6 hücre) başına 100 ul FACS tamponu ile tekrar süspansiyon hücreleri.
    4. Tüp 1 ve tüp 2 Anti-Mouse CD34 FITC antikor 1 ug ekleyin ve hafifçe tüpleri karıştırın.
    5. Karanlıkta 1 saat boyunca 4 ° C 'de tüm tüpler inkübe edin.
    6. Borunun 1, APC-konjuge Köken Kokteyl antikor 0.25 boruyu 3 PE-konjuge anti-Sca1 antikorun ug ve 20 ul ila Köken Kokteyl antikorlar, APC-konjuge PE-konjuge anti-Sca1 antikorun 0.25 ug ve 20 ul ekle tüp 4.
    7. Nazikçe tüpleri karıştırın ve karanlıkta bir 30 dakika boyunca 4 ° C'de kuluçkalayın.
    8. Hücrelere FACS tampon 300 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün.
    9. Üç kez FACS tampon 500 ul hücreleri yıkayın.
    10. FACS met 500 ul hücre pelletiniffer.
    11. Tazminat kurma borular 2, 3, 4, ve 5 'de hücreleri kullanır. FACS Aria kullanarak tüp 1 Lin-SCA + CD34 + ve Lin-SCA-CD34 hücreleri izole.

    • 2. Yüksek verim dizinleri için RNA Hazırlama ve Kütüphanesi İnşaatı

    1. İzolasyon, kalite analizi ve RNA ölçümü:
      1. Üretmektedir 'protokol takip edilen Lin-CD34 + ve sırasıyla TRIzol kullanılarak Lin-CD34 hücrelerden toplam RNA ekstrakte edin.
      2. Üreticinin protokolü takip edilerek, kirlenmiş DNA'sı kullanılarak deoksiribonükleaz I (DNase I) çıkarın. İsteğe bağlı olarak, daha fazla kullanım için bu aşamada -80 ° C'de RNA saklayın.
      3. Tedarikçi tarafından sunulan talimatlara göre Bioanalyzer kullanan toplam RNA kalitesini değerlendirmek. RNA Bütünlük sayısı (RIN) 9 daha lager RNA örneği kullanın.
    2. Kütüphane İnşaat ve yüksek verim sıralama:
      NOT: Bu protokol Illumina platformu kullanılarak RNA-seg açıklar. IçinDiğer sıralama platformlar, farklı kütüphane hazırlama yöntemleri gereklidir.
      1. Kütüphane hazırlanması için numune başına yüksek kaliteli toplam RNA 0,1-4 mikrogram kullanın. Normal olarak, toplam RNA, 2 ug 10 5 EML hücrelerinden elde edilebilir.
      2. RNA, saflaştırma ve parçalanma, birinci ve ikinci dizi cDNA sentezi, son tamir, 3, RNA'ya dizileme örnek hazırlama sisteminin kullanımı, 'sağlayıcının talimatlarından ayrıntılı standart prosedürler takip edilerek, PCP, adaptör ligasyonu ve PCR amplifikasyonu sona erer.
        1. Olumlu oligo-dT manyetik boncuklar kullanılarak PolyA mRNA seçin ve mRNA fragmanı.
        2. CDNA'nın elde edilmesi ve daha sonra çift şeritli cDNA oluşturmak için cDNA, ikinci dalı sentez etmek için, rastgele primerler kullanılarak ters transkripsiyon gerçekleştirin.
        3. 3 'çıkıntılar ve 5 doldurun' Kaldır DNA polimeraz tarafından çıkıntılar. Adenilat 3 'birbirlerine bağlanması ile ilgili cDNA fragmanlarının önlemek için sona erer.
        4. DscDNA her iki ucuna multipleks indeksleme adaptörleri ekleyin. DNA fragmanlarının zenginleştirilmesi için PCR gerçekleştirin.
      3. Bir spektrofotometre kullanılarak kütüphanenin konsantrasyonu hakkında bilgi edinmek için A260 / A280 ölçün.
      4. Kütüphane kalitesi değerlendirildi ve Bioanalyzer kullanılarak DNA parçalarının boyut aralığı ölçer.

    3. Veri Analizi

    Bu bölümde kullanılan yazılım referans için (Tablo 2) bakınız.

    1. Alt analizi için veri dosya işleme:
      1. .bcl (Baz çağrı dosyası) dönüştürmek casava yazılımı (Illumina, sürüm 1.8.2) kullanarak dosya .fastq dosya.
        1. Linux sistemi 'Terminal' ateş. Bir Illumina HiSeq2000 dizileme makineden veri dosyasını içeren veri klasörüne gidin. Sonuç klasör 'NASboy1 / JiaqianLabData / HiSeq_RUN / 2013_07_11 / 130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX /' türü olduğunu varsayalımŞekil S1a içinde komuta ve veri klasörünü girin.
        2. Linux sistemi casava 1.8.2 yükleyin. , Outputfolder 'Hizalanmamış' olduğunu varsayalım dönüştürmek için yapılandırma dosyası hazırlamak için Şekil S1B yılında komutunu kullanın. Sadece bir .fastq dosya her bir numune için oluşturulan sağlamak için --fastq-küme sayımı 0 seçeneğini kullanın. Oluşturulan .fastq dosyası Gz biçimindedir. Alt analizi (Şekil S1B) için açın.
        3. 'Hizalanmamış' klasörü oluşturulduktan sonra, 'Hizalanmamış' klasöründe (Şekil S1C) gidin.
        4. Dönüştürme işlemini başlatmak için Şekil S1D yılında komutunu kullanın. '-j' Parametresi kullanılacak cpu sayısını sağlayan.
        5. Sistem dönüştürme işlemini bitirdikten sonra, 'Hizalanmamış' klasörü (Şekil S1E) kapsamında sonuç klasörüne gidin.
        6. <Şekil S1F içinde komutunu kullanın/ Strong> Her numune klasörü altında .fastq dosyasının içine .fastq.gz dosyayı açmak için.
    2. Roman transkript algılamak ve smokin Suite 26 ile ifade düzeyini değerlendirmek:
      1. RNA-Seq (elde ucsc sürümü MM9, fare referans genomuna okur eşleştirilmiş sonu haritada http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html kullanır) Tophat yazılımını kullanarak (versiyon 1.3.3) 27 Papyon mapper (sürüm 0.12.7) 28 okuyun. Tophat ifade seviyesi tahmin doğruluğunu geliştirmek için "-hayır-roman-juncs" seçeneği ile verilir.
        1. Haritalama işlemi uygulanacak bir klasörde .fastq dosyaları koydum. Bir paired-end dizileme numune için 2 .fastq dosyaları (Example1.read1, Example1.read2 yeniden adlandırmak) olduğunu varsayalım eşleme (sistem ayarına göre parametrelerini ayarlamak) yapmak için Şekil S2 komutunu kullanın."-p" Parametresi kullanılacak cpu sayısını sağlayan. "R" ve "-mate-std-dev" parametreleri kütüphane QC elde edilen veya (Şekil S2) hizalanmış bir alt kümesi okur varılabilir.
      2. Kol Düğmesi yazılımını kullanarak RNA transkriptleri okur eşlenen (versiyon 1.3.0) 29 birleştirin. Açıklama bilinen genlerin dosya (tophat tarafından kullanılan aynı .gtf dosyası) ve tophat tarafından üretilen .bam dosyasını kullanarak çalıştırın Kol Düğmeleri.
        1. Tophat çalışmasını tamamladıktan sonra, aynı klasörde, transcriptome ve tahmin transkript ifade seviyesini oluşturmak için kol düğmeleri çalıştırmak için Şekil S3A yılında komutunu kullanın. 'GenomeSeqMM9' klasöründe 'mm9_repeatMasker.gtf' ve genom dizisi dosyaları UCSC Genom Browser elde edilebilir.
        2. Elde edilen genes.expr ve transcripts.expr dosyaları genler ve transkript (izoformları) olarak ifade değerini içerir. Kopyalama ve yapıştırmabir Excel dosyası içeriğini dosya ve hesap tablosu uygulaması (Şekil S3 B) ile işleyebilirsiniz.
        3. Yeni transkript belirlemek için referans 'mm9_genes.gtf' dosyasına çıkan 'transcripts.gtf' dosyası karşılaştırmak için Şekil S3C yılında komutunu kullanın.
        4. Elde edilen .tmap dosyası karşılaştırma sonucunu içerir. Kopyalayın ve bir Excel dosyası için dosya içeriğini yapıştırın ve elektronik tablo uygulaması ile manipüle. Sınıf kodu ile deşifreleri 'u' (Şekil S3D) sağlanan dosyası .gtf referans ile karşılaştırıldığında 'roman' olarak kabul edilebilir.
          NOT: değerleri 0.1 altında ise aşağı analiz kolaylık sağlamak için, 0.1 FPKM değerlerini ayarlayın.
          NOT: Adım 3.2.3 - 3.2.6 roman transkriptlerinin 'ifadesi tahminin doğruluğunu geliştirmek isteyenler için isteğe bağlıdır. Haritalama ve transcriptome inşaat r olması gerekir, çünkü bu, çok daha uzun bir zaman alacakun birden çok kez.
      3. Varsayılan parametrelerini kullanarak Tophat çalıştırın ve daha sonra Şekil S3E içinde komutunu kullanarak oluşturulan .gtf dosyaya kol düğmeleri çalıştırın.
      4. Şekil S3F yılında komutunu kullanarak referans genom .gtf dosyaya çıkan .gtf dosyasını karşılaştırın.
      5. Aşama 3.2.2.4 tarif edildiği gibi nihai .tmap dosyasını çözümler. Kopyalayın ve bir Excel dosyası için dosya içeriğini yapıştırın ve elektronik tablo uygulaması ile manipüle. Sınıf kodu ile deşifreleri 'u' olarak kabul edilebilir 'roman' sağlanan dosyası .gtf referans ile karşılaştırıldığında.
      6. Aşama 3.2.5 sonra, referans .gtf dosyası olarak kullanılabilir klasördeki bir .combined.gtf bir dosya vardır. Yeni transkriptler, daha doğru bir şekilde tahmin FPKM elde etmek için aşama 3.2.1 ve 3.2.2'de tarif edildiği gibi TopHat ve kol düğmeleri ikinci bir çalışma yapılabilir.
    3. Differentiall Algılamay DESeq paketi 30 kullanılarak genleri dile getirdi.
      1. DESeq giriş bir ham okuma sayar tablodur. Böyle bir tablo elde etmek için, HTSeq web sitesinden indirilebilir HTSeq Python paketi ile dağıtılan htseq-sayısı komut dosyasını kullanabilirsiniz ( http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html ) .
        1. Samtools, piton ve htseq-sayımı programsare sistemde yüklü olduğundan emin olun. Şekil S4a yılında komutunu kullanarak tophat çıkışından ham okuma sayısı numaralarını edinin.
        2. 'Raw_Count_Table.txt' Excel kullanarak, 'ExperimentDesign.txt' dosyalarını hazırlayın. Kopyala ve DESeq R paketi (Şekil S4B) için .txt formatında içeriği kaydedebilirsiniz.
        3. Sistemde R programı yükleyin. Terminalde, yazın 'R' basın ENTER.A ekran mesajı olacak appearas Şekil S4C gösterdi.
        4. 'Raw_C OkuŞekil S4D yılında komutunu kullanarak R içine ount_Table.txt ',' ExperimentDesign.txt '.
        5. Şekil S4E yılında komutunu kullanarak DESeq paketi yükleyin.
        6. R (Şekil S4F) olarak çarpanlara koşulları.
        7. Normalize sayım masaya olumsuz bimominal testi çalıştırmak için Şekil S4G yılında komutunu kullanın.
        8. Bir .csv dosyasında çıkış önemli diferansiyel ifade edilen genlerin Şekil S4H yılında komutunu kullanın.
    4. Excel kullanarak numunelerin genelinde Arama transkripsiyon faktörleri '(TF) FPKM değerleri. Kesişim DE gen masa ve TF'ler tablo. Genler farklı şekilde transkripsiyon faktörlerini ifade hem tabloya ait.
      1. Web sitesine gitmek http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php ve transkripsiyon faktörleri indirin. Ardından <(Excel'de DE transkripsiyon faktörlerini arama strong> Şekil S5).
    5. UCSC genom tarayıcı görselleştirme için .bigwig dosyası oluşturuluyor.
      1. Web sitesinden 'bedtools' yazılım paketi indirin https://github.com/arq5x/bedtools2 ve sistemde 31 yazılımı yükleyin. Web sitesinden ucsc aletler 'bedGraphToBigWig' indirin http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ ve sistemdeki yazılımı yükleyin.
      2. .bam Dosyasını içeren klasörü, .bed dosyasına tophat tarafından oluşturulan .bam dosyayı dönüştürmek için Şekil S6A yılında komutunu kullanın.
      3. .Yatakta Dosya üretildikten sonra, .bigwig dosyası oluşturmak için Şekil S6B yılında komutunu kullanın. Dosya 'ChromInfo.txt' Aşağıdaki url elde edilebilir:arget = "_blank"> http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz.
      4. UCSC Genom Browser bir özel parça gözlemlemek. Web sitesine bakın http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html UCSC genom tarayıcısı kullanarak özel bir iz görüntülemek için nasıl.

    figure-protocol-1
    Şekil S1: .bcl dosya dönüştürme casava yazılımı kullanarak dosyayı .fastq için.

    figure-protocol-2
    Şekil S2: Haritalama Tophat kullanarak genom referans okur.

    figure-protocol-3 Şekil S3: roman transkript ve ifade seviyesi tahmini Algılama.

    figure-protocol-4
    Şekil S4: package DESeq kullanarak diferansiyel ifade geni çağrılıyor.

    figure-protocol-5
    Şekil S5: farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörlerinin belirlenmesi.

    figure-protocol-6
    Şekil S6: veri görselleştirme için haritalama sonucu dönüştürme.

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Sonuçlar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Lin-CD34 + ve Lin-CD34 EML hücrelerinde farklı olarak ifade genlerin analiz etmek için, biz RNA-Dizi teknolojisi kullanılmaktadır. Şekil 1 prosedürlerin iş akışını gösterir. Manyetik hücre sıralama ile soy negatif hücrelerin izolasyonu sonra, Lin-SCA + CD34 + ve FACS Aria kullanılarak Lin-SCA-CD34 hücreleri ayrıldı. Lin-zenginleştirilmiş EML hücreleri, anti-CD34, anti-SCA1 ve soy kokteyl antikor ile boyandı. Sadece Lin- hücreleri Sca1 CD34 ifade analizi için geçitlendi. İki popülasyonları (SCA + CD34 + ...

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Tartışma

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Memeli transcriptome 34-38 çok karmaşık. RNA-Seq teknoloji It gen ifadesi analizi için diğer yöntemlere göre birçok avantajı vardır transcriptome analizi, roman transkript tespiti ve tek nükleotid varyasyon keşif vb çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Girişte de belirtildiği gibi, mikrodizi hibridizasyon eserler üstesinden gelir ve yeni bir transkript de novo tanımlamak için kullanılabilir. RNA-sıralamasının bir sınırlama Sanger dizileme karşılaştırarak göreli kısa okumak uzun...

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Açıklamalar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

    Teşekkürler

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    JQW, SZ, SD ve KC, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Staman Ogilvie Fonu—Memorial Hermann Vakfı'ndan alınan hibe ile desteklenmektedir.

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Malzemeler

    Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
    AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    Antibiyotik-AntimikotikInvitrogen15240-062BHK hücre kültürü
    Anti-Fare CD34 FITCeBioscience11-0341-81FACS sıralama
    Anti-Fare Ly-6A/E (Sca-1) PEeBioscience12-5981-81FACS sıralama
    APC Fare Soy Antikor KokteyliBD Biosciences558074FACS sıralama
    BD FACSAria Hücre SıralayıcıBD BiosciencesÖzel teklif sistemiFACS sıralama
    Corning & trade; Hücre Kültürü ile İşlem Görmüş Şişeler 75 cm2Corning,Hücre kültürü
    Corning & trade 430641 dahil edilmiştir; Hücre Kültürü İşlem Görmüş Şişeler 25 cm2< / sup>Corning dahil430639Hücre kültürü
    Deoksiribonükleaz I, Amplifikasyon DerecesiInvitrogen18068-015Kütüphane hazırlığı
    DMEMInvitrogen11965-092BHK hücre kültürü
    DPBSGibco14190Hücre kültürü
    HI FBSInvitrogen16140071BHK hücre kültürü
    At SerumuInvitrogen16050-122EML hücre kültürü
    IMDMHyCloneSH30228.02EML hücre kültürü
    L-GlutaminInvitrogen25030-081Hücre kültürü
    Soy Hücre Tükenme Kiti, fareMiltenyi Biotec130-090-858Soy negatif hücrelerinin izolasyonu
    NanoVue Plus spektrofotometreGE Sağlık28-9569-62Kalite kontrol
    Thermo Scientific & Trade; Napco ve ticaret; 8000 Su Ceketli CO2 İnkübatörleriThermo Scientific15-497-002Hücre kültürü
    Penisilin-Streptomisinİnvitrojen15140-122EML hücre kültürü
    TRIzol® ReaktifInvitrogen15596-018RNA eksraksiyonu
    TruSeq & trade; RNA Numune Hazırlama Kiti v2 -Set B (48 rxn)IlluminaRS-122-2002Kütüphane hazırlığı
    2100 Elektroforez Biyoanalizör CihazıAgilentG2939AAKalite kontrol
    %0.25 Tripsin-EDTAGibco25200Hücre kültürü
    0.45 & mikro; m Şırınga FiltreleriNalgene190-2545Hücre kültürü

    Kaynaklar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Chambers, S. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential. Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).
    2. Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS genetics. 8, (2012).
    3. Ye, Z. J., et al. Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).
    4. Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development. Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).
    5. Weiler, S. R., et al. D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells. Blood. 93, 527-536 (1999).
    6. Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).
    7. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).
    8. Chu, Y., Corey, D. R. RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation. Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).
    9. Hornett, E. A., Wheat, C. W. Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species. BMC genomics. 13, 361(2012).
    10. Eswaran, J., et al. RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations. Scientific reports. 3, 1689(2013).
    11. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
    12. Wu, J. Q., et al. Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).
    13. Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing. Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).
    14. Edgren, H., et al. Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing. Genome biology. 12, 6(2011).
    15. Ilott, N. E., Ponting, C. P. Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing. Methods. 63, 50-59 (2013).
    16. Sun, L., et al. Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study. BMC bioinformatics. 13, 331(2012).
    17. Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).
    18. Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection. BMC molecular biology. 11, 16(2010).
    19. Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq. Nucleic acids research. 37, 106(2009).
    20. Djari, A., et al. Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing. BMC genomics. 14, 307(2013).
    21. Murphy, D. Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects. Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).
    22. Chen, K., et al. RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level. PLoS one. 8, 72567(2013).
    23. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome research. 18, 1509-1517 (2008).
    24. Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. How to analyze gene expression using RNA-sequencing data. Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).
    25. Glenn, T. C. Field guide to next-generation DNA sequencers. Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).
    26. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature protocols. 7, 562-578 (2012).
    27. Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
    28. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25(2009).
    29. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature. 28, 511-515 (2010).
    30. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome biology. 11, 106(2010).
    31. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
    32. Cheranova, D., et al. RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells. J Vis Exp. , (2013).
    33. Zhang, H. M., et al. AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database. Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).
    34. Wu, J. Q., et al. Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome. Genome Biol. 9, 3(2008).
    35. Wu, J. Q., et al. Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones. Biotechniques. 36, 690-696 (2004).
    36. Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing. Genome Res. 14, 665-671 (2004).
    37. Dewey, C., et al. Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat. Genome Res. 14, 661-664 (2004).
    38. Wu, J. Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , LAP Lambert Academic Publishing. (2011).

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Yeniden basım ve izinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

    İzin iste

    Etiketler

    EML H creleriCD34 PozitifCD34 NegatifTranskripsiyon Fakt rleriFloresan Aktive H cre Ay rmaK t phane Olu turmaDiferansiyel Ekspresyon Analizi

    İlgili makaleler