Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Pro-floresan alt madde analog ile PAD4 Faaliyet flüoresan'a bağlı İzleme

9.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52114

⸱

5 Kasım 2014

 ,  , 
1Department of Chemistry, Lehigh University

Bu makalede

Özet

PAD4, peptidil-argininin peptidil-sitrüline dönüşümünden sorumlu bir enzimdir. PAD4'ün düzensizliği bir dizi insan hastalığında rol oynamaktadır. Kolay ve yüksek verimli uyumlu bir floresan bazlı PAD4 testi açıklanmaktadır.

Özet

Translasyon sonrası modifikasyonlar, birçok protein substratının yan zincirlerindeki kovalent varyasyonları artırarak protein fonksiyonel durumlarının değişmesine yol açabilir. Histon kuyrukları, tüm insan proteinleri içinde en yoğun şekilde değiştirilmiş uzantılardan birini temsil eder. Peptidil-arginin deiminaz 4'ün (PAD4), arginin kalıntılarını genetik olarak kodlanmamış sitrülin kalıntısına dönüştürdüğü gösterilmiştir. Bugüne kadar tarif edilen az sayıda tahlil, tatmin edici bir hassasiyetle operasyonel olarak kolaylaştırılmıştır. Bu nedenle, yeterli tahlillerin olmaması, güçlü kovalent olmayan PAD4 inhibitörlerinin yokluğuna muhtemelen katkıda bulunmuştur. Burada, PAD4 aktivitesinin izlenmesine izin veren yeni bir floresan bazlı test açıklanmaktadır. Proteaz tripsin ilavesi üzerine PAD4 enzimatik aktivitesini floresan serbest kalmasına bağlamak için bir pro-floresan substrat analoğu tasarlanmıştır. Testin yüksek verimli tarama koşullarıyla uyumlu olduğu ve güçlü bir sinyal-gürültü oranına sahip olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, tahlil, aşırı eksprese edilmiş PAD4 içeren ham hücre lizatları ile de gerçekleştirilebilir.

Giriş

Memeli proteinlerinin bir çok sayıda ağır ribozom tarafından proteinlerin sentezi, aşağıdaki enzimlerin etkimesi ile modifiye edilir. Bu post-translasyonel modifikasyonlar, (PTMS) büyük ölçüde protein 1-3 arasında (diğer özellikleri yanı sıra) boyut, yük, yapı ve oligomerizasyon durumunu değiştirerek Proteome fonksiyonel çeşitliliği artırabilir. Bunun bir sonucu olarak, protein yapısındaki bir değişiklik, örneğin protein bozulması, hücre farklılaşması, iletimde, gen ekspresyonunda modülasyonu ve protein-protein etkileşimleri gibi fizyolojik sonuçlara yol açabilir. Bu değişiklikler tüm insan proteinlerinin büyük bir yüzdesi görülürken histon proteinler kovalent modifikasyonlar 4 alışılmadık derecede yüksek sayıda geçmesi üzerine, terminal biter. Histon proteinler genomik DNA yoğunlaştırılmasını kolaylaştırır, yapısal proteinlerin bir ailesidir. Yapılandırılmamış histon kuyrukları Kovalent modifikasyonlar bir seride tarafından yürütülen ve düzenlenir, artıkları (yazarlar) ve kovalent modifikasyonunu katalize aynı değişiklikleri (silgiler), ters ve değişiklikler arasında ayrım enzimlerin s histon kuyrukları (okuyucu) 5-7 üzerine basılmış olan. Aslında, bilinen PTMS en metilasyon, fosforilasyon, asetilasyon, sumoylation, ubikitinasyon ve sitrülinlenmesine 8 de dahil olmak üzere histonun bu kısa segmenti içinde görülmektedir.

Sitrülinlenmesine olmayan T RNA kodlanmış peptidil-sitrulin (Şekil 1A) peptidil-argininin dönüştürülmesini kapsar. Bu yan zinciri nötrleştirme sorumlu proteinleri, PAD üyesi olan kalsiyum-bağımlı enzimler olması her biri. 9,10, protein ailesini (s rginine D eiminase peptit). Bugüne kadar, PAD ailesinin beş üyesi (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 ve PAD6) 'de tarif edilmiştir. Bu ailenin her üyesi farklı hücresel proteinleri hedef görünür ve aynı zamanda uni görüntülerque doku dağılımı profilleri. PAD4 bir nükleer lokalizasyon dizisi 11 ile çekirdek içinde lokalize olduğu bilinmektedir, bu protein ailesinin tek üyesidir. Bu duruma göre, histon H2A arginin kalıntısının 3, PCR'ın N-terminal kuyrukları arginin yan zincirler (H2R3), H + 3 (H3R2, H3R17 ve H3R26) ve H4 (H4R3) 12 nükler hedeflerin bir dizi deiminate gösterilmiştir, 13. PAD izozimlerinin, her özel ve kritik fizyolojik işlevlere sahip olsa da, PAD4 dolayı hastalıklı ve sağlıklı hücrelerinin her ikisinde de, insan gibi bir dizi işlem rolünü önemli ölçüde daha fazla ilgi çekmektedir. Son zamanlarda, PAD4 Pluripotency transkripsiyonel ağı 14 üye olduğu gösterilmiştir. Her iki PAD4 sentezleme seviyeleri ve aktivite, farelerde yeniden programlama ve taban durumu, pluripotent durumlarında yüksek olduğu gösterilmiştir. Kök hücre genlerin düzenlenmesini kontrol edilerek, PAD4 hücre yeniden programlama veriminde önemli bir rol tutabilirler. PAD4 de implike edilmiştirüzerine patojenlerin bağlanmasını nötrofil hücre dışı tuzakları, oluşumu kendi sistem açıklığı sağlar. PAD4 histon proteinleri hypercitrullination dolayısıyla bakteriyel enfeksiyonların 15,16 sakınma, hücre dışı tutucusu ile, patojen bakterilerin kapsüllenmesi için taban malzemesi olarak hizmet eden kromatin yoğunluk azaltılmasından neden olur.

Buna ek olarak, PAD4 insan hastalıklarının bir dizi aktif bir rol oynadığı tespit edilmiştir. Daha önce PAD4 anormal ekspresyon romatoid arteritin başlamasında ve şiddeti ile ilişkili olduğu gösterilmiştir, Alzheimer, Parkinson hastalığı ve multipl skleroz 17. Aslında, bir anti-sitrülin proteinin antikorların varlığı romatoid artrit 18 arasında en güvenilir ve kesin bir teşhis ve prognostik biyolojik biridir. Benzer şekilde, bozulmuş PAD4 aktivitesi en son yumurtalık, meme, akciğer, bir de dahil olmak üzere insan kanserlerinin bir dizi gözlenmiştird özofagus kanserleri 19-22. PAD4 ve kanser arasındaki bağlantı, p53 tümör bastırıcı bir protein 22,23 ELK1 onkogen üzerinden veya yoluyla aracılık ettiği gösterilmiştir ve önceki iş PAD4 bir yeni anti-kanser terapötik hedef 17,24,25 olabileceğini öne sürdü. Ilke çalışmanın bir kanıtı olarak, kolorektal kanser hücre çizgisi, HCT116 olarak shRNA ile PAD4 tükenmesi apoptoz ve hücre döngü yakalanmasını 26 uyarılması için yeterli olduğu bulundu. Son yıllarda geliştirilmiş olan geri dönüşü olmayan bir PAD4 inhibitörünün farelerde 27 tümör kütlesinde bir yetmiş oranında azalmaya yol açmıştır. Oldukça önemli ölçüde, PAD4 inhibisyon dönüştürülmemiş hücreleri ayırarak, kanser hücrelerinin seçici ölümüyle sonuçlanan bir hedefe yönelik bir tedavi olarak hareket ortaya çıktı.

PAD4 işlevini kapatmak için küçük moleküllerin kullanımı, kanser hücrelerini hedef veya mevcut kanser, kemoterapi 28 artırmak için yeni ve güçlü bir strateji olduğu ispat edebilir. Ne yazık ki, POÇadır geri dönüşümlü PAD4 inhibitörü henüz keşfedilmeyi etti. Kovalent önleyicileri bir dizi alt-tabakanın arginin 27,29,30 taklit ile sağlıklı ve hastalıklı durumu hücrelerinin her ikisinde de PAD4 rolünü anlamak için pratik araçlar olduğu kanıtlanmıştır kloro / floro dj pirimidin kolu kullanarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu molekül, benzer etki ile, aktif pedlerin her inhibe eder. Bu nedenle, PAD4 aktivitesine ilişkin raporlar, basit bir deneme için olan ihtiyaç çok önemlidir. Bugüne kadar, PAD4 deneyler, kolorimetrik bir okuma 31 ile reaksiyondan amonyağın serbest bağlantı tarif edilmiştir, floresan polarizasyon tahlili için 32 flüoresan chloroamidine alt-tabaka analog kullanmaktadır glioksal ve sitrulline 33 arasındaki asit yardımlı reaksiyon üzerine dayanır ve bağlanma aşamasının 34 dequenching bir floresan PAD4 faaliyet. Bunlardan sadece kovalent değiştirici haloacetamidine stratejisi, yüksek verimli Scre ile uyumlu olduğu kanıtlanmıştırsürmesi gelen platformlar 32,35,36. Biz güvenilir PAD4 aktivitesini ölçen basit floresan dayalı tahlil açıklar. Güçlü bir sinyal-gürültü oranı, analiz hızı ve ölçüm sağlamlık gösterir deneyi, gerçekten kuvvetli ve seçici PAD4 inhibitörü keşfetmek için potansiyele sahiptir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. PAD4 Dönüşüm, Expression ve Arıtma

  1. PAD4 Dönüşüm için, kimyasal olarak, yeterli E. içine PAD4 GSTfüzyonunu içeren pGEX plazmid dönüşümü Aşağıdaki prosedür kullanılarak protein ifadesi için E. coli (E. coli türü BL21 (DE3) ') hücreleri. Kimyasal yetkili (kalsiyum klorür) hazırlayın E. Standart protokollere göre coli (E. coli türü BL21 (DE3) ') hücreleri.
    1. Önceden hazırlanan kimyasal yetkili BL21 (DE3) hücreleri buz üzerinde 50 ul çözülme ve 5 ml kültür tüpü içinde PAD4 genini içeren pGEX plazmidin 1 ul ile karıştırılır. Yavaşça her 2 dakikada çalkalayarak 10 dakika süreyle buz üzerinde inkübe karışımı.
    2. Isı 40 sn için 42 ° C su banyosu içinde karışımın yerleştirerek hücreleri şok. Hemen hücrelerinin iyileşmesi için verilen 2 dakika geri buz üzerinde hücreye plazmid karışımı yerleştirin. Karışıma steril LB et suyu 1 ml ilave edilir ve 1 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.
    3. 1 250 rpm'de çalkalanarak, 37 ° C'de hücreler şok ısı inkübehr. Pipet 75 bir ampisilin dayanıklı agar plakası üzerinde dönüştürülmüş hücrelerin ul ve 15 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 4 ° C'de muhafaza plaka.
  2. PAD4 ifadesi.
    1. 1x ampisilin içeren LB 5 ml ampisilin agar plaka ve yerden BL21 (DE3) hücreleri 1 koloni seçin. Küvöze ve 37 ° C'de O / N sallayın.
    2. 1x amfisilin trihidrat içeren steril LB (MW 403,45 g / Mol) 1 L LB (başlangıç) ve 5 ml aktarın. 37 ° C'de çalkalama inkübatöründe yer büyüme. Büyüme OD 600 izler. Büyüme 600 0.3 bir OD ulaştığında, inkübatör sallayarak 16 ° C içine büyüme taşıyın.
    3. OD 0.6 600, 0.3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / Mol) ile hücrelerin uyarılması ulaştıktan sonra. Hücreler 16 ° C'de 15 saat boyunca çalkalanır izin verin.
    4. 0 ° C'de 20 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüj ile hasat hücreleri. -80 ° C'de süpernatant ve mağaza pelet kapalı dökün.
  3. PAD4 saflaştırma
    1. Yeniden askıya 50 mM NaCI (MA 58.44 g / Mol), bir tampon maddesi içinde hücreleri BL21 (DE3) 'de ifade edilen PAD4 içeren pelet, 300 mM NaH 2 PO 4 (MW 119,98 g / Mol), 10 mM imidazol (MW 68,077 g / mol), 0.1 mM fenilmetilsülfonil flüorür (PMSF, MW 174,94 g / Mol) ve 1 mM ditiyotretol (DTT, 154,25 g / Mol), pH = 8.0.
    2. 4 ° C'de 15 dakika süreyle sese tabi tutularak ile lizleyin hücreleri. Sonikasyonun ardından, 0 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 x g'de hücre lizat santrifüj. Dökün ve süpernatant kaydedin. Toplu, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca glutatyon (GSH) agaroz boncuklar ile yüzer.
    3. Gravite ile GST boncuk / sütundan süpernatant boşaltın. Oda sıcaklığında 1 x PBS'de (fosfat tamponlu tuz çözeltisi, pH = 8.0) ve 4 x 25 ml boncuk yıkayın.
    4. Zehir PAD4 2 x 10 mi elüsyon tamponu ile, 50 mM tris (hidroksimetil) aminometan (Tris baz, MW 121.14 g / mol), 10 mM glutatyon (GSH, MW 307,32 g / Mol), pH = 8.0.
    5. 100k MW kesme o kullanarak PAD4 Konsantreff santrifüj tüpleri ve santrifüj 4 ° C'de 20 dakika boyunca 4000 x g'de. -80 ° C'de kısım 1.0 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde 200 ul hacim içinde, protein saklayın.

Tamponlar 2. hazırlanması Stok Çözümleri

  1. Sodyum klorür (NaCI, MA 58.44 g / mol) tartıldı ve 2M solüsyon hazırlanır. Berrak kadar çözüm karıştırın.
  2. Tris (hidroksimetil) aminometan (Tris baz, MW 121,14 g / Mol) tartın ve = 8.0, 2 M çözelti, pH hazırlar. Berrak kadar çözüm karıştırın.
  3. Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2 2H 2, O, MW 147,01 g / Mol) tartılır ve 500 mM'lik çözelti hazırlayın. Berrak kadar çözüm karıştırın.
  4. Tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP, MW 250,19 g / Mol) tartılır ve 200 mM'lik çözelti hazırlayın. -20 ° C'de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın.
  5. Ditiyotretol (DTT, MW 154,25 g / mol) tartıldı ve 1 M solüsyon hazırlanır. -20 ° C'de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın.
  6. HazırlamakTriton X-100% 0.5 çözeltisi.
  7. Etilendiamintetraasetik asit (EDTA, MW 292,24 g / Mol) tartılır ve 100 mM'lik çözelti hazırlayın. Berrak kadar çözüm karıştırın.
  8. Hidroklorür (ZRcoum MW 621,69 g / Mol) metilkumarin Z Arg- Arg- -7- amido- 4- tartın ve dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mM'lik bir çözelti hazırlayın.

37 ° C'de 3 PAD4 Deneyi

  1. 10 mM ZRcoum stoklar kaynaktan su içinde ZRcoum bir 125 uM solüsyon hazırlanır. Bu 125 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak
  2. 62.5 mM NaCI, 62.5 mM Tris, 12.5 mM CaCI2, 6.25 mM DTT tamponu ve 5 uM PAD4 (pH = 8.0) hazırlayın. Bu çözelti olacak B.
  3. 62.5 mM NaCI, 62.5 mM Tris, 12.5 mM CaCI2, ve 6.25 mM DTT (pH = 8.0) 'in bir tamponu hazırlayın. Bu çözelti C olacak
  4. (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. Berrak kadar çözüm karıştırın ve -20 ° C'de saklayın° C. Bu çözelti, D olacak
  5. 96 oyuklu bir plaka elde edilir ve bir kontrol için kuyu numarasına (PAD4) ve test kuyuları (+ PAD4) işaret etmektedir.
  6. Pipet testi kuyular ve pipet kontrol kuyulara Çözüm C 160 ul içine Solüsyon B 160 ul. 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  7. Pipet 40, tüm oyuklara Eriyik A ul ve 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  8. Test kuyularının kontrol kuyuları yarısı ve yarısı dH 2 O Pipet 10 ul. Kontrol bölümlerinin ve test kontrolleri, bir pipet, 37 ° C'de 10 dakika boyunca Çözelti D inkübe 10 ul diğer yarısına.
  9. 345 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm'lik bir emisyon dalga boyunda bir çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir.

Oda sıcaklığında 4 PAD4 Deneyi

  1. 10 mM ZRcoum stoklar kaynaktan su içinde ZRcoum bir 50 uM solüsyon hazırlanır. Bu 50 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak
  2. 100 mM Na bir tampon hazırlayınCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, 2 mM TCEP,% 0.02 Triton X-100 ve 8 uM PAD4 (pH = 8.0). Bu çözelti olacak B.
  3. 100 mM NaCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, 2 mM TCEP,% 0.02 Triton X-100 (pH = 8.0) 'in bir tamponu hazırlayın. Bu çözelti C olacak
  4. (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. -20 ° C'de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın. Bu çözelti, D olacak
  5. 384 oyuklu plaka elde edilir ve kontrol (hiçbir PAD4) ve test deliklerine (+ PAD4) için kuyu işaret etmektedir.
  6. Pipet testi kuyular ve pipet kontrol kuyulara Çözüm C 25 ul içine Solüsyon B 25 ul. Oda sıcaklığında 20 dakika oyuklarda kuluçkalanması PAD4 olmadan / tampon izin verir.
  7. Tüm kuyulara C çözeltisi pipetle 25 ul ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir.
  8. Test kuyularının kontrol kuyuları yarısı ve yarısı dH 2 O Pipet 10 ul. Kontrol bölümlerinin ve test kontrollerin diğer yarısı, pipett için10 dakika boyunca oda sıcaklığında Çözelti D inkübe e 10 ul.
  9. 345 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm'lik bir emisyon dalga boyunda bir çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir.

37 ° C'de ve oda sıcaklığında 5. PAD4 saat Sahası Tahliller

  1. 10 mM ZRcoum stoklar kaynaktan su içinde ZRcoum bir 125 uM solüsyon hazırlanır. Bu 125 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak
  2. 62.5 mM NaCI, 62.5 mM Tris, 12.5 mM CaCI2, 6.25 mM DTT tamponu ve 5 uM PAD4 (pH = 8.0) hazırlayın. Bu çözelti olacak B.
  3. (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. -20 ° C'de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın. Bu çözelti C olacak
  4. (Kaç zaman noktalarında bağlıdır kuyuların #) 2 96-iyi plakaları ve pipet kuyuların # miktarda içine Solüsyon B 160 ul edinin.
  5. 37 ° C'de bir 96 oyuklu plaka inkübe edin. Oda sıcaklığında, diğer 96 plaka inkübe edin.
  6. Ölmekette hemen 40 hem 96 oyuklu plakalar içinde, tüm oyuklara Eriyik A ul ve t = 0 dakika kuyulara çözelti C, 10 ul pipetle. Tüm kuyuları söndürüldü edilinceye kadar belirli zaman noktalarında Çözüm C 10 ul ekleyerek devam edin.
  7. 345 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm'lik bir emisyon dalga boyunda bir çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir.

RT'de 6 PAD4 Engelleme Deneyi:

  1. 10 mM ZRcoum stoktan, su ZRcoum bir 83 uM solüsyon hazırlanır. Bu 83 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak
  2. Cı-amidin (MW 424,8 g / Mol) tartıldı ve 100 uM stok solüsyonu hazırlanır. Bu çözelti olacak B.
  3. 100 mM NaCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, 2 mM TCEP,% 0.02 Triton X-100 ve tampon ve 8 uM PAD4 (pH = 8.0) hazırlayın. Bu çözelti C olacak
  4. 100 mM NaCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, 2 mM TCEP,% 0.02 Triton X-100 (pH = 8.0) 'in bir tamponu hazırlayın. ThÇözüm D. olacak olan
  5. (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. -20 ° C'de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın. Bu çözelti, E. olacak
  6. 384 oyuklu plaka elde edilir ve kontroller için kuyu (Resim PAD4) Test oyuklarını (+ PAD4) ve inhibisyon kuyu (PAD4 + CI-amidin) işaret etmektedir.
  7. Pipet testi kuyular ve pipet kontrol kuyulara Çözüm D 25 ul içine Çözüm C 25 ul. Oda sıcaklığında 20 dakika oyuklarda kuluçkalanması PAD4 olmadan / tampon izin verir.
  8. Inhibisyon kuyulara Çözelti B'nin pipetle 10 ul ve RTE'nin 20 dakika süreyle inkübe edin.
  9. Tüm kuyulara Çözelti A'nın Pipet 15 ul ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir.
  10. Pipet tüm kuyulara Çözüm E 10 ul. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  11. 345 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm'lik bir emisyon dalga boyunda bir çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir.

7. ham hücre lizatının DeneyiRT'de

  1. 50 mM Tris, 50 mM NaCI, 0.1 mM fenilmetilsülfonil flüorür (PMSF, MW 174,94 g / Mol) ve 1 mM ditiyotretol (DTT, 154,25 g / Mol), pH, 10 ml PAD4 1 L gelişme gelen süspansiyon hücreleri hücrelerin hasat edilmesinden sonra, = 8.0.
  2. 4 ° C'de 15 dakika süreyle sese tabi tutularak ile lizleyin hücreleri. 0 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 x g'de hücre lizatı santrifüjleyin. 100k MA kesme santrifüj tüpleri kullanılarak 4 ° C'de 4,000 rpm'de santrifüjleme ile yarım hacme berrak bir aktif madde konsantre edilir.
  3. 10 mM ZRcoum stoklar kaynaktan su içinde ZRcoum bir 250 uM solüsyon hazırlanır. Bu 250 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak
  4. 100 mM NaCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, ve 2 mM TCEP (pH = 8.0) 'in bir tamponu hazırlayın. Bu çözelti olacak B.
  5. (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. -20 ° C'de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın. Bu çözelti C olacak
  6. Siyah, 384 oyuklu plaka ve tasarım elde edilirkontroller (hiçbir hücre dağılma) ve test kuyuları (+ hücre dağılma) için kuyu yedik.
  7. Pipet testi kuyulara bütün kuyuları ve hücre lisatından pipet 60 ul içine Çözüm B 100 ul. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
  8. Tüm kuyulara Çözelti A'nın Pipet 40 ul ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir.
  9. Pipet tüm kuyulara Çözüm C 10 ul. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  10. 345 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm'lik bir emisyon dalga boyunda olan çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Başlangıçta ZRcoum 96 oyuklu bir plaka biçiminde, PAD4 aktivitesi rapor göstermiştir edilmiştir. Wells, alt-tabaka ZRcoum ve PAD4 varlığında / yokluğunda inkübe edildi. 475/15 nm filtre (Şekil 2A), - 37 ° C 'de 45 dakikalık bir inkübasyon döneminden sonra, floresan, bir 340/40 ile ölçüldü. Beklendiği gibi, floresans seviyesi ZRcoum (veya sitrülin ZRcoum) içindeki florofor olarak düşük kalmıştır kilitli halde kalmıştır. Çözeltiye, fazla ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, PAD4'ün aktivitesini izleyen floresan bazlı bir test başarıyla geliştirilmiştir. Testin bir dizi yüksek verimli koşulda inanılmaz derecede sağlam olduğu kanıtlanmıştır ve ayrıca tüm hücre lizatları37 ile uyumludur.

Histon proteinleri ile onu çevreleyen DNA zincirleri arasındaki afinite, sitrülinasyon üzerine arginin yan zincirindeki pozitif yükün nötralizasyonu nedeniyle gevşer. Arginin yan zincirinin nötralizasyonunun, PAD4 aktivitesini izlemek için benzer şekilde kullanıla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Lehigh Üniversitesi Başlangıç Paketi tarafından desteklenmiştir. Protein ekspresyonu için GST-PAD4 plazmidini sağladığı için Dr. Walter Fast'a teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
LB Et Suyu, Değirmen (LURIA-BERTANI)AmrescoJ106-2KGhttp://www.amresco-inc.com
Ampisilin Trihidrat (Kirli Beyaz Toz), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP902-25 http://www.fishersci.com
İzopropiltiagalakton (IPTG)Life Technogolies15529-019<a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com
Tüm Tampon Tuzları Fisher Scientific, Fisher Scieintifc'ten satın alabilir; VWR; Akros; Sigma-Aldrich; ve saire.
Protino Glutatyon (GSH) agaroz Machery-Nagel745500.104 > C; http://www.mn-net.com/
Kloroamidin Cayman Kimya 10599-20 & derece'de saklayın; C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLwww.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plakaları (96 ve 384)Corning'den satın alın; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control mikroplaka okuyucu yazılımıwww.tecan.com
>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filterhttp://www.perkinelmer.com

Kaynaklar

  1. Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
  2. Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
  3. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
  4. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
  5. Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
  6. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  7. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
  8. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
  9. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
  10. Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
  11. Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
  12. Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).
  13. Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).
  14. Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
  15. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  16. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
  17. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
  18. Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
  19. Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
  20. Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7(2010).
  21. Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
  22. Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
  23. Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676(2012).
  25. Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
  26. Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
  27. Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
  28. Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
  29. Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
  30. Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
  31. Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).
  32. Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
  33. Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
  34. Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
  35. Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
  36. Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
  37. Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
  38. Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
  39. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Floresan Tabanlı AnalizPro-floresan SubstratTripsin AktivasyonuProtein EkspresyonuGST PurifikasyonuYüksek Kapasiteli TaramaFloresan ÖlçümüEnzim İnhibisyonuHam Lizat
Pro-floresan alt madde analog ile PAD4 Faaliyet flüoresan'a bağlı İzleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.