Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

T hücrelerinin türetilmesi İn Vitro Fare Embriyonik Kök Hücreleri

10.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52119

⸱

14 Ekim 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College and Graduate Center, City University of New York, 2Sunnybrook Research Institute, Department of Immunology, University of Toronto

Bu makalede

Özet

Fare embriyonik kök hücreleri, OP9-DL1 ko-kültür sistemi kullanılarak in vitro olarak T hücrelerine farklılaştırılabilir. Bu prosedürde başarı, reaktif/hücre bakımına ve tekniğe duyarlı temel adımlara dikkat edilmesini gerektirir. Burada bu kritik parametreleri tartışıyor ve bu teknolojinin benimsenmesini teşvik etmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

OP9/OP9-DL1 ko-kültür sistemi, hem fare hem de insan kaynaklı embriyonik ve hematopoietik progenitörlerden farklılaşmış kan hücresi tiplerini türetmek için iyi bilinen bir yöntem haline gelmiştir. Şu anda hematopoez ile ilgili giderek artan çeşitlilikte karmaşık genetik, hücresel ve moleküler soruları ele almak için kullanılmaktadır ve bu temel bulguları terapötik uygulamalara dönüştürme çabalarının en ileri noktasında yer almaktadır. Prosedürler basittir ve rutin olarak sağlam sonuçlar verir. Bununla birlikte, in vitro olarak başarılı hematopoietik farklılaşma elde etmek, reaktif ve hücre kültürü bakımının ayrıntılarına özel dikkat gerektirir. Ayrıca, protokol, zor olmasa da, ustalaşmak için özen ve pratik yapan tekniğe duyarlı adımlar içerir. Burada, T lenfositlerinin fare embriyonik kök hücrelerinden (mESC) ayırt edilmesine yönelik prosedürlere odaklanıyoruz. İn vitro olarak tekrarlanabilir şekilde sağlam hücresel farklılaşmayı mümkün kılan kritik adımların ve parametrelerin tartışıldığı ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Hayvan kullanımını azaltma, maliyeti düşürme ve hem temel hem de translasyonel deneylerin zaman çizelgelerini kısaltma potansiyeline sahip olduğu için bu teknolojinin daha geniş çapta benimsenmesini düşünmek alanın yararınadır.

Giriş

Fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC) in vitro olarak T hücrelerine farklılaştırıldığı bir hücre kültürü sistemi kurulmuştur.1 Bu sistem, T hücresi farklılaşmasını sağlamak için Notch sinyalizasyonunun yeteneğinden yararlanır. 2 OP9-DL1 hücre hattı, kemik iliğinden türetilmiş OP9 hücrelerinin3 bir Notch ligandı, Delta benzeri 1 (DL1) ile dönüştürülmesiyle oluşturuldu. 4 Notch sinyal kaskadının in vitro aktivasyonu, diğer hücre soylarının dışlanmasına kadar T hücresi gelişimini kolaylaştırır. Uygun sitokinlerin dahil edilmesiyle, bu sistem, mESC'nin hematopoietik ve nihayetinde T hücresi soylarına doğru sıralı ilerlemesini destekleyen bir hücre kültürü "mikro ortamı" sağlar. Bu sistem, timusta normal T hücresi ontogenezisi sırasında görülen çeşitli gelişim aşamalarında T hücrelerinin akış sitometrik tanımlamasını destekler. T hücresi gelişimi ile ilgili seçilmiş soruları araştırmak için bu prosedür, fare embriyonik kök hücre türevli hematopoietik öncülerden T hücresi gelişimini ortaya çıkarmak için kullanılan in vivo bütün fare modellerine5 ve in vitro fetal timik organ kültürü yöntemlerine çekici bir alternatif haline gelmiştir. 6 OP9 ko-kültür sisteminin en büyük avantajı, standart ve basit hücre kültürü tekniklerini içermesi ve deney hayvanlarının sürekli kullanımına bağlı olmamasıdır.

Bu yaklaşımı kullanarak deneylerimizde ayrıntılı, daha önce yayınlanmış bir protokolü takip ediyoruz. 7 Bu teknolojiyi, manipüle edilmemiş mESC klonlarının, kimerik embriyolar8 yapmak için özenle seçilmiş yüksek kaliteli mESC klonlarının ve doğrudan ilaç seçiminden çıkan stabil şekilde transfekte edilmiş ESC klonlarının hematopoietik farklılaşma ürünlerini incelemek için kullandık. 9 Bu modelde mESC'den mezoderm benzeri kolonilere ilk in vitro farklılaşmanın zamansal kinetiğinin bireysel klonlar arasında değişken olabileceğini not ettik. mESC-OP9 ko-kültürleri, mezoderme ilerleme açısından görsel olarak değerlendirilebilir. Bu genellikle ko-kültürün beşinci gününde tamamlanacak olsa da, bireysel klonlar arasında tamamlanma bir veya iki gün ertelenebilir. Optimal hematopoietik progenitör hücre (HPC) oluşumu ve sağlam lenfopoez elde etmek için transferden önce kantitatif (~% 80-90) mezoderm oluşumu sağlanmalıdır. Bu nedenle, birden fazla mESC klonu ile çalışırken, bu "5. gün" geçişi, tüm klonlar mezoderm benzeri kolonilere geçişi tamamlayana kadar en iyi şekilde geciktirilir. Bu, hematopoietik farklılaşma koşullarına aktarıldıktan sonra klonlar arasında müteakip gelişimin senkronizasyonunu sağlar. % 80-90 mezodermal oluşumların geçmesinden üç gün sonra, HPC'ler OP9 tek katmanlarından toplanır. HPC'ler, monositik, eritroid ve B hücre soylarının farklılaşmasına izin vermek için yeni OP9 hücrelerine ekilebilir. Alternatif olarak, HPC'ler OP9-DL1 hücrelerine ekilebilir ve T hücresi gelişimine doğru yönlendirilebilir. Tüm in vitro farklılaşma kültürleri, 5. günden itibaren Flt-3L sağlanır ve 8. günden itibaren IL-7 eklenir. Deney sırasında çeşitli zaman noktalarında gerçekleştirilen akış sitometrisi analizleri, hematopoietik farklılaşma ve T hücresi gelişiminin aşamaları ve soyları boyunca ilerlemenin izlenmesini sağlar. CD4 / CD8 çift pozitif (DP) T hücreleri, ko-kültürün 16. gününde ortaya çıkmaya başlar ve hem DP hem de CD8 tek pozitif (SP) hücreler 20. günde bol miktarda bulunur. Ortak kültürün genel sonucu ve sağlamlığı, büyük ölçüde, meydana gelen önemli gelişimsel dönüm noktalarının tamamlandığını görsel olarak tespit etme yeteneğine bağlıdır. Bu protokol, başarılı bir farklılaşmanın anahtarı olan bu kilometre taşlarının yanı sıra diğer kritik parametrelerin tanınması için bir rehber olmayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Kültür Medya, Sitokinlerle ve Jelleşmiş Plakaların 1. Hazırlık

  1. Yüksek glikoz ve sodyum piruvat ile Eagle Medium (DMEM) içinde Dulbecco modifikasyonu kullanılarak bir ES hücre ortamı hazırlayın. % 1 HEPES Tamponu,% 1 non-essential amino aist,% 0.1 gentamisin (50 mg / ml) ve% 0.1 (Fetal Sığır Serumu (FBS) Kalifiye% 20 ESC,% 1 Penisilin / Streptomisin,% 1 L-glutamin, ekleme 55 uM), β-mersaptoetanol eklenir. Süzme ile ES hücre ortamı sterilize edin.
  2. Üreticinin talimatlarına göre toz Alfa Minimum Esansiyel Medium (α-MEM) 1 L yaparak OP9 ortamı hazırlayın. % 20 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 Penisilin / Streptomisin ekleyin. Karıştırmak için ters. Iki adet 500 ml'lik alikota süzme ile sterilize edin.
    NOT: tozundan yapılan medya kullanımı tavsiye ve geliştirilmiş OP9 hücre bakım ve in vitro farklılaşma sonuçları elde etmek muhtemeldir. Bu yaklaşım standart bir prosedür haline gelmiştir. Ancak, biz de tha dikkatt biz bazen yeterli başarı ile önceden yapılmış sıvı α-MEM kullandık.
  3. % 90 FBS,% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) eklenerek ortam dondurma hazırlayın. Yavaşça karıştırınız ve süzülerek sterilize. 4 ° C'de saklayın.
  4. 10 ug / ml tam ortam içinde OP9 insan rekombinant Flt-3, ligand (Flt-3 L) içinde çözülmesiyle 2,000x Flt-3, ligand (10 ug / ml) hazırlayın. -80 ° C'de 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri içine kısım saklayın. Istikrar ve depolama ile ilgili tedarikçinin tavsiyelerine uyun.
    Not: Flt-3L stabilitesi (4 ° C 'de 3 ay -80 ° C de 1 ay) kısadır.
  5. Tam OP9 ortamını kullanarak 1,000x, IL-7 (1 ug / ml) hazırlayın. -80 ° C'de 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri içine kısım saklayın. Istikrar ve depolama tedarikçinin önerileri izleyin (IL-7 -80 ° C'de 12 aya kadar dayanır).
  6. LİF i 7 10 adet 1:10 seyreltme ile 1,000x, lösemi önleyici faktörü (LİF) ya da (10 ug / ml) hazırlayınn, ES hücre ortamı. 4 ° C'de muhafaza kısım. Kısım şişeler üzerinde üretici tarafından sağlanan son kullanma tarihini not ettiğinizden emin olun.
    NOT: Ürün üretim tarihinden itibaren konsantre veya seyreltilmiş formu en az 18 ay stabildir.
  7. Jelatinleştirilmiş 6 oyuklu plakalar hazırlamak ile 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1.5 ml% 0.1 jelatin solüsyonunu ilave edin. Kaplama için en az 30 dakika izin kapakları ile oda sıcaklığında steril bir muhafaza içinde yemekler bırakın. Yemekler de nemlendirilmiş bir inkübatör içinde bir gece boyunca kalabilir. Sağ cep tohumlamadan önce herhangi bir artık jelatin çözüm çıkarın. Jelatin çözüm tamamen kuyuda kurumasına izin vermeyin.

2. Hazırlık ve Besleyici Hücreleri ve Fare Embriyonik Kök Hücreleri Bakım (Mesc)

NOT:% 5 CO2 ile nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör tüm hücreleri inkübe edin.

  1. Çözülme Fare Embriyonik Fibroblastlar (MEF)
    1. Donmuş bir flakon (~ 5 x 10 6 Hızlı-çözülme hücre / mitomisin C ile tedavi (veya başka mitotikal tutuklandı) MEF'lerin flakon) ve onları bir 15 ml tüp transfer.
    2. Yavaş yavaş dondurma ortamından DMSO sulandırmak için damla damla olarak, çözülmüş hücrelere ES hücre ortamı 8 ml ilave edilir.
    3. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 400 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve ES hücre ortamı, 3 ml hücre pelletini.
    4. Önceden ısıtılmış ES hücre ortamı 33 ml 50 ml'lik bir santrifüj tüpü hazırlayın. 36 ml nihai hacme getirmek üzere yeniden süspansiyon haline getirilmiş MEF'lerin 3 ml ilave edilir.
    5. İki jelatinleştirilmiş 6 oyuklu plakaların her bir kuyunun içine yeniden süspanse MEF'lerin 3 ml dağıtın. Hücreler takın ve onlara mESCs, tohumlamadan önce yaymak için izin vermek üzere en az altı saat süreyle tekrar inkübatör içine tabak yerleştirin. Medya her 2-3 günde bir değiştirilir ise bu mitotikal tutuklandı besleyici katmanlar, ilk ekimden birkaç gün boyunca kullanılabilir olabilir.
      NOT: Taze tutuklandı MEF'ler da kullanılabilir.
    6. Tohumlama mESCs
      1. 37 ° C su banyosu içinde dondurulmuş Mesc klon ile bir şişe hızlı çözünmesi ve 2.1.1-2.1.3 tarif edildiği gibi hücrelerini hazırlamak.
        NOT: Bir 6-çukurlu plaka bir birleşik kuyusundan Mesc 2 şişe dondurma.
      2. (Adım 2.1.5 hazırlandı) tutuklandı MEF tek tabakasıyla 6-plaka (Mesc klonu itibarıyla) bir kuyudan ortamları çıkarın ve MEF tek tabaka üstüne mESCs ve 3 ml tohum. 1,000x LİF (10 ng / ml), 3 ul ekleyin. Kuvöz içine yemekleri dönün.
    7. ES hücre bakım ve tripsin aracılı geçit
      NOT: Mesc izdiham göre değiştir günlük medya, ya da bölünmüş. Optimal, hasat ve split / yeniden-plaka hücreleri her gün.
      1. ES hücre ortamı çıkarın ve 2 ml PBS ile mESCs yıkayın. PBS çıkarın. % 0.25 tripsin 1 ml ilave edilir ve 3-5 dakika 37 ° C'de inkübe edin.
      2. Tripsinize hücreleri toplamak ve 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine transfer edin. Şiddetle m topaklannı kırmaya hücre süspansiyonu pipetleyinEKH. Tripsin nötralize etmek için hücre süspansiyonu tam ES hücre ortamı 2 ml ilave edilir.
      3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücreleri. Süpernatantı ve 3 ml ES hücre medya pelletini.
      4. Hazırlanan tutuklandı MEF tek tabakaları ihtiva eden 6 oyuklu plakalar ortamı çıkarın. Her bir oyuğa ES hücre ortamı, 3 ml (istenilen bölme oranına göre) hücre süspansiyonu uygun miktarda ekilmiş edin. 1,000x LIF 3 ul ekleyin. 2 gün içinde geçiş için hazır olacak 6: Birleşik bir Mesc de 1 bölün.
    8. OP9 / OP9-DL1 hücrelerin bakım
      1. OP9 hücrelerin bir şişe çözülme (adımları izleyin 2.1.1-2.1.3 OP9 medyayı kullanarak)
      2. 10 cm doku kültürü çanak 7 mi OP9 ortam ekleyin. Plaka boyunca hücrelerin dağıtılması, damla damla bir şekilde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler 3 ml ilave edilir. Gece boyunca inkübatör içinde hücreleri yerleştirin.
      3. Ertesi gün hücrelerin OP9 izdiham kontrol edin. Çanak birçok ölü yüzen hücreleri içeriyorsa, remoOrtamı ettik ve taze ortam OP9 10 ml ekleyin. Neredeyse tam izdiham görülmez ise inkübatör tabak dönmek. 4 yakın birleşik OP9 monolayer: Split 1 (tripsin kullanarak).
        NOT: Tabaklar yaklaşık 2 gün içinde tekrar aynı izdiham düzeyine ulaşması gerekir. Aşırı yapışık hale OP9 hücreleri bırakmamaya özen gösterin.
      4. Genişleme hisse senetleri gibi OP9 hücrelerin erken pasajlar dondurun.
        NOT: konfluen 10 cm çanak yakın birinden OP9 hücrelerin 2 şişe dondurma. Genişletme stoklar Her bir ampul, aşağıda daha ayrıntılı olarak Mesc ko-kültür deneyleri kullanılan çalışma stoğu oluşturmak için çoğaltılabilir. Değişen sıcaklıklara olumsuz donar kalitesini etkileyebilir, çünkü daha -80 ° C'de derin dondurucuda daha sıvı azot içinde dondurulur, tüm OP9 stokları tutun.

    3. OP9-DL1 Ortak kültür Prosedür

    1. Eş-kültür preparatlar
      1. Yaklaşık bir hafta önce, bir ortak-kültürünün başlatılmasından MEF'ler, mESCs ve OP9 Hücre çalışma STO çözülmecks. OP9-DL1 hücrelerinin ko-kültür gününde 8 kadar gerekli olmadığından, ko-kültür başlangıcından sonraki ilk üç gün boyunca OP9-DL1 hücrelerini eritin. Bakım ya da gerektiği gibi tüm hücreleri dondurmak.
      2. Deneyin ölçeği dayalı gün 0 ko-kültür ile% 80 kaynaşmaya eriştikten hazır OP9 hücre tekli katmanları, 10 cm tabaklar başlangıç ​​sayısını belirlemek (örneğin, Mesc klonların sayısı ve ayırt edilmesi için ortak-kültür zaman noktalarının sayısı ile ) analiz edilebilir. 4 ve 1: bir ko-kültürü hazırlamak için, 1 ila OP9 hücrelerinin konfluent çanak yakınındaki bölme 6 iki gün önce mono tabakalar gerekli olacaktır ne zaman.
        NOT: Bir ÇIK klon başına en az bir levha gerekir. Gün 5 pasaj altı tabak tohum için yeterli hücrelerin vermelidir 0. günde (aşağıda tarif edildiği gibi), genellikle, tek bir ESC klon, tek bir plaka üzerinde tohumlandı. Her gün 5 tabak bir sonraki analiz zaman noktasını sağlayacaktır.
      3. OP9 monokatmanlar sürekli ko-kültür geçişi için gerekli olacak bu yana, bakımı her zaman HAYATIMIN almakko-kültür ile paralel olarak ilave OP9 kültür plakalarının yeterli sayıda.
    2. Gün 0: ortak-kültürünün başlatılması
      1. 2.3.1-2.3.4 gibi Mesc toplayın. Hücreleri saymak.
      2. Her bir klon için Mesc plaka başına OP9 ortam, 10 ml 5 x 10 4 Mesc hazırlar.
        NOT:. Biz kullanılan olmasına rağmen, biz alternatif bir orta α-MEM,% 10 FBS oluşan ve 5 x 10 β-mercaptoethanol da farklılaşma ko-kültürlerinde kullanılmak üzere rapor edilmiştir -5 M 10 unutmayın
      3. OP9 yemekleri eski ortamları çıkarın ve plaka boyunca eşit hücrelerini dağıtmak için özen yemekleri Mesc süspansiyonu 10 ml ekleyin. 37 ° C inkübatör yemekler yerleştirin.
    3. 3. Gün: Medya değişiklik
      1. Inkübatör yemekleri çıkarın ve mikroskop altında gözlemlemek. Koloniler üzere parlaklık kaybetmek ve basık görünür başlamalıdır.
      2. Yemekler ortamı kaldırın ve yavaşça taze OP9 10 ml ekleyinmedya.
      3. Inkübatör ko-kültür yemekleri dönün. Görsel kolonilerin% 80-90 görsel mezoderm-benzeri morfolojiye sahiptir ~ kadar gerçekleştirilemeyen gereken bir sonraki geçidin (gün 5) için, besleyici OP9 tek tabaka hazırlama zamanlama bilgi günlük mezoderm gibi koloni oluşumunu izlemek. 5 gün hücre transferi, aşama fazla erteleme 2 gündür.
    4. 5. Gün: ön-kaplama ile Tripsin aracılı geçit.
      NOT: optimal konfluen OP9 hücreleri ile önceden 10 cm yemekleri yeterli sayıda hazırlayın. Ko-kültürler görsel aşama 3.3.3 açıklanan özellikler gösterir yalnızca sonraki adımlara devam (ayrıca Temsilcisi Sonuçlar bakınız).
      1. Ko-kültür yemekleri ortamı çıkarın. Yıkamak için 4 ml PBS ilave edin. PBS girdap ve çıkarın. % 0.25 tripsin 4 ml ilave edilir ve ~ 5 dakika boyunca inkübatör yemekler yerleştirin.
      2. Dikkat ederek kadar, aşırı hava kabarcıkları tanıtmak için, güçlü pipetleme ile tripsinize edilmiş hücre katmanı bozabilirHomojen, çoğunlukla tek bir hücre süspansiyonu elde edilir.
      3. Tam OP9 medya 4 ml ekleyin ve pipetleme karıştırın. 30 dakika boyunca inkübatör yeni, boş bir 10 cm çanak ve yerine hücreleri aktarın OP9 hücreleri çanak uymak için izin vermek. Bu "ön kaplama" aşaması eş-kültür bir sonraki adıma aktarılmıştır OP9 hücrelerin sayısını azaltır.
      4. 40 mikron hücre süzgeçler ile 50 ml santrifüj tüpleri hazırlayın.
      5. Ön kaplama çanak yapışkan olmayan hücreler toplanır ve daha sonra tüpe hücre süzgecinden yoluyla geçmektedir. 6 ml PBS'de hafifçe bulaşık yıkama ve arkasında bağlı OP9 hücreleri bırakarak aynı süzgecinden geçirin.
      6. 4 ° C'de 400 x g'de 5 dakika santrifüjleyin hücreleri. Süpernatantı ve tam OP9 medya 3 ml pelet hücreleri tekrar süspansiyon. Hücreleri saymak.
      7. Optimal Konfluent OP9 hücreleri ile 10 cm plakalardan ortamı çıkarın.
      8. Her analiz zaman noktası için, OP9 mono 5 x 10 5 hücre tohum10 ml nihai hacim içinde katmanı.
      9. 5 ng / ml insan rekombinan Fit-3L ekleyin ve inkübatör yemekler yerleştirin.
    5. 8. Gün: Hematopoetik progenitör Hücre (HPC) koleksiyonu
      NOT: Bu aşama için süre içinde bu olacağı şekilde önceden OP9 veya OP9-DL1 hücre mono tabakaları ile 6 oyuklu plakaların yeterli sayıda Hazırlama ~% 80 konfluent.
      1. 40 mikron filtreli, 50 ml santrifüj tüpleri hazırlayın.
      2. Inkübatör yemekleri çıkarın ve mikroskop altında gözlemlemek. Yüksek basınçlı bir parlak kümeleri gevşek OP9 tek tabaka eklenmesi gerekmektedir. Bir pipet ile OP9 tek tabaka ve yemeğin üzerine mevcut medya yıkanması (ama aşırı rahatsız değil) mümkün olduğunca bu hücrelerin birçok toplayın. Köpük oluşumu önlemek için, her zaman bu HPC toplama / yıkama aşaması sırasında pipet ucuna ortamın en az 1 ml bırakın.
      3. Bir tüp içine 40 um süzgecinden hücreleri geçirin. , Tüm HPC aynı plaka 8 ml PBS ilave edin ve bir mikroskop altında kontrol bizyeniden toplandı. Daha kuvvetli bir yıkama ile (eğer gerekli ise) PBS Yıkama / toplama aşamasından tekrar edilmelidir. Zaten aynı Hücreleri plakadan içeren tüp içine hücreleri süzün.
      4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje hücreleri.
      5. 5 ng OP9 ortam (levha, 5. günde tohumlanır başına) 3 ml 'lik bir ana karışımı hazırlayın / ml Flt-3L ve 1 ng / ml IL-7.
      6. Fit-3L + IL-7 ana karışımı ile OP9 medya (işlenen her 10 cm çanak için 3 ml) süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. OP9 hücrelerine sahip bir 6-yuvalı plakanın bir oyuğuna Her levhadan toplanan hücreler aktarın.
        1. , Monositik, B hücreleri ya da eritroid soylar doğru pillerinin OP9 hücreler üzerine hücreler toplandı tohum için. T hücreleri elde etmek için, OP9-DL1 hücre mono tabakaları üzerine hücreleri tohum.
      7. Inkübatör içine 6 oyuklu plakalar yerleştirin.
    6. Gün 10: Medya değişiklik
      1. Her biri farklı klon Mesc besleyici hücre tipi Combina bir 15 ml santrifüj tüpü hazırlayınko-kültür tion.
      2. Flt-3L 5 ng / ml IL-7 ve 1 ng / ml 'si ile OP9 ortamın bir ana karışımı hazırlayın. Her bir oyuk için 3 ml hazırlayın.
      3. Yavaşça aynı ESC klon besleyici hücre tipi kombinasyonunu içeren çoklu ortam çukurlardan birleştirerek 6 oyuklu plakanın her bir medya toplar.
      4. Her bir kuyuya OP9 ortam ana karışımı 2 ml (3.6.2) ekleyin.
      5. Santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de toplanmıştır ortam. Kuyu başına OP9 medya ana karışımı 1 ml her pelet (görünür eğer çok küçük) (3.6.2 bakınız) başlangıçta adımda 3.6.3 toplanan süpernatant kaldırmak ve tekrar süspansiyon.
      6. Lütfen, her oyuğa ortam başlangıçta 3 ml her bir hazne içinde toplanmıştır hacmi getiren başka içine hücre 1 ml dağıtın. Inkübatör yemekleri dönün.
    7. Gün 12: Hayır tripsin pasaj
      Not: Bu s onlar optimal zamanında birleştirilebilmeli böylece önceden OP9 veya OP9-DL1 hücreleri ile 6 oyuklu tabaklarda yeterli sayıda hazırlayındım. Gün 12 geliştirme eritrosit, monositik ve erken evre T hücreleri akış sitometrisi analizleri için idealdir.
      1. Bir ana karışımı Fit-3L 5 ng / ml IL-7 ve 1 ng / ml 'si ile OP9 ortam (ko-kültür içinde devam edecek her çukuruna 3 ml) hazırlayın.
      2. 40 um süzgeçler (ko-kültür, her klon-ESC besleyici hücre tipi kombinasyon için bir adet) ile 50 ml'lik bir santrifüj tüpü hazırlayın.
      3. Kuvvetlice kuyuda (tek tabaka da dahil olmak üzere) tüm hücreleri parçalamak için her bir oyuğa mevcut ortamı pipetle. Tek bir hücre süspansiyonu andıran bir kıvama gelinceye kadar güçlü pipetlenmesiyle devam edin.
      4. Tüp içine süzgecinden toplanan hücreler geçirin. Kalan tüm yıkama hücreleri ve toplamak için, her bir oyuğa PBS 3 ml ilave edilir. Aynı süzgecinden hücrelere geçerler. Aynı ESC klon-besleyici hücre tipi kombinasyonu içeren çoklu kuyu hücreleri birleştirin.
      5. Kullanılan hücre süzgeç atın ve bir kuyuya bir kısım eşdeğer kaldırmak (~ 6 ml) İstenilen için(ya da başka) akış sitometrisi o gün yürütülecek analiz eder. Kullanımdan önce buz üzerinde, bu alikotları saklayın.
      6. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje hücreleri. Süpernatantı. Oyuk başına ana karışımı 3 ml, 50 ml santrifüj tüpünden elde edilen pelet yeniden tohumlu edilmesi. Uygun besleyici bir hücre tipi için her hücre süspansiyonu, göz başına 3 ml ilave edilir ve kuluçka makinesi içindeki yemekler yerleştirin.
    8. Gün 14: Medya değişiklik
      1. Bölüm 3.6 özetlenen adımları izleyin.
    9. Gün 16: Hayır tripsin pasaj
      NOT: Bu aşama için önceden en uygun konfluent OP9 veya OP9-DL1 hücreleri, 6 oyuklu kapları hazırlayın.
      NOT: Flow sitometri B lenfositleri ve orta evre T hücrelerinin analizleri için günlük 16 idealdir.
      1. Bölüm 3.7 özetlenen adımları izleyin.
    10. Gün 18: Medya değişiklik
      1. Bölüm 3.6 özetlenen adımları izleyin.
    11. Gün 20: Hayır tripsin pasaj
      NOT: Gün 20 iAkış sitometri için s ideal bir T hücrelerini gelişmekte geç sahneye orta analizleri.
      1. Bölüm 3.7 özetlenen adımları izleyin. İstenirse, hücreleri son gün 20 alternatif medya değişikliği ayırt taşımak ve hiçbir tripsin lenfosit genişleme oranı günlük izlenmesi ile, her iki gün geçitleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

LİF mevcudiyetinde MEF'ler üzerinde yetiştirildiğinde, mESCs farklılaşmamış bir halde muhafaza edilebilir. İdeal koşullar altında, bunlar faz kontrast mikroskopisi parlak bir halosu ile çevrili olan hücrelerin yoğun kolonileri (Şekil 1) olarak görünür. Bu kültürler günlük olarak takip edilmelidir. Hücrelerin birleştiği bağlı olarak, ortam değiştirilebilir ya da hücre ayrılabilir. Komşu Mesc koloniler birbirleri ile temas noktasına gelmemeli. Farklılaşmamış mESCs bir normal, sağlıklı kültür, in vitro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

OP9-DL1 ko-kültür sistemi, kök hücreleri, kan hücre tiplerinin gelişimi esnasında, gen rolünü incelemek için kullanılmıştır. 8,12,13 Ayrıca gen düzenleyici DNA fonksiyonlarını incelemek için etkin bir modeli olduğu kanıtlanmıştır hücre farklılaşması sırasında. 9,14 zaman ve hematopozun birçok temel soruları deneylerin maliyeti önemli ölçüde tasarruf elde edebilirsiniz tüm fare modellerine alternatif olarak bu yaklaşımı kullanarak. Bununla birlikte, bu amaçlar için, bu protokol adaptasyonu, bu işlem...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Uzman akış sitometrisi yardımı için Joon Kim'e teşekkür ederiz. Yazarların laboratuvarlarındaki araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin SCORE programı (BDO'ya SC1-GM095402 hibesi) ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (JCZP'ye) tarafından desteklenmektedir. J.C.Z.P., Kanada Gelişimsel İmmünoloji Araştırma Başkanı tarafından desteklenmektedir. Hunter College'ın biyomedikal araştırma altyapısı, kısmen NIH Azınlık Kurumlarındaki Araştırma Merkezleri (RCMI) programı tarafından hibe MD007599 yoluyla desteklenmektedir. Ayrıca, New York Eyaleti Kök Hücre Bilimi Programına (NYSTEM) Hunter College'da kök hücre araştırmalarının başlatılmasına hibe C023048 yoluyla verdiği destek için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMCorning15-013-CV
Kök hücre nitelikli FBSGemini100-125Isı ile etkisiz hale getirilmiş
Penisilin / StreptomisinCorning30-002-CI
L-alanil L-glutaminCorning25-015-CI
HEPES tamponu ve nbsp;MilliporeTMS-003-C
Esansiyel Olmayan Amino AsitlerThermoScientificSH30853.01
Gentamisin Regent Çözeltisi (50 mg/ml)Life Technologies 15750-060
β-merkaptoetanol (55 mM);21985-023
Filtre ÜnitesiMilliporeSCGPU05RE 0.22 & mu; m PES membran
Hücre Kültürü Sınıfı SuCorning25-055-CM
& alfa ; -MEM & nbsp;Yaşam Teknolojileri 12000-022Toz, üretim önerisine göre sulandırıldı
Sodyum bikarbonat ve nbsp;SigmaS5761-500G
FBSThermoScientificSH 30396.03Gerekli bireysel lotların testi 
Dimetil Sülfoksit SigmaD2650
Rekombinant İnsan Flt-3 Ligand R& D Sistemleri308-FK
Rekombinant Murin IL-7PeproTech217-17
LİF MilliporeESG1107
%0.1 jelatinli Utrapure suMilliporeES-006-B
MEF'ler mitomisin C ile muamele edilmişMilliporePMEF-CFMitotik olarak tutuklanan herhangi bir MEF kullanılabilir
DPBSCorning21-031-CV
Hücre süzgeci (40 & mu; m)Fisher22363547
Doku kültürü kabı 100 x 20 mmBD Falcon353003
Multiwell 6 kuyuluBD Falcon353046
1.5 ml mikrosantrifüj tüpleriUSA Scientific1615-5500
15 ml santrifüj tüpleriBD Falcon352096
50 ml santrifüj tüpleriBD Falcon352070
5 ml Polistiren Yuvarlak Tabanlı Tüp, Hücre Süzgeç KapaklıBD Falcon352235FACS için Tüpler 
ES R1 hücreleriATCCSCRC-1011
OP9 hücreleriHücreler, Riken Laboratuvar Hücre Deposundan (Japonya) elde edilebilir.
OP9-DL1 hücreleri       Hücreler Zú'den talep edilebilir; ñ iga-Pflü Cker Laboratuvarı.
FlowJo yazılımı Laboratuvarımızda Tree StarFACS veri analizleri
Akış SitometresiBDFACScan, FACSCalibur ve FACSVantage kullanılmıştır
DPBS Life Technologies'de ,,

Kaynaklar

  1. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
  2. Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
  3. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
  4. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  5. Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
  6. de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
  7. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
  8. Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
  9. Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
  10. Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
  11. Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
  12. de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
  13. Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
  14. Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

T Hücresi DiferansiyasyonuOP9 Ko-kültür SistemiHematopoetik Progenitör HücrelerAkış Sitometrisi AnaliziHücre Kültürü BakımıStromal Hücre MonotabakasıT Lenfosit Gelişimiİn Vitro ModelCD4 CD8 Çift Pozitif
T hücrelerinin türetilmesi İn Vitro Fare Embriyonik Kök Hücreleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.