Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

Özet

Farelerde Batı Nil virüsü mutant enfeksiyonuna karşı dendritik hücrelerin antijen sunma kapasitesini ve antijene özgü T hücresi yanıtlarını ölçmek için iki akış sitometrisi tabanlı yöntem - bir in vitro T hücre hazırlama testi ve hücre içi sitokin boyama kullanıldı.

Özet

Farelerde, vahşi tip Batı Nil Virüsü daha yüksek doğal sitokin ve T hücresi tepkilerini bağlı bir zayıflatılmış Batı Nil virüsü (WNV), bir yapısal olmayan (NS) 4B-P38G mutantı. Son zamanlarda, miyeloid farklılaşma faktörü 88 (MyD88) sinyal Batı Nil Virüsü NS4B-P38G mutant enfeksiyon sırasında, ilk T hücresi uyarılması ve bellek T hücresi gelişimi için önemli olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmada iki sitometri tabanlı yöntemler akış - Bir in vitro T hücre prime deneyi ve bir hücre içi sitokin boyama (ICS), - dendritik hücreler (DC) ve T hücre fonksiyonlarını değerlendirmek için kullanılmıştır. OTII transgenik farelerin, CD4 ⁺ T hücreleri etiketli - deneyi emişli T hücresi, hücre çoğalması karboksiflüoresein süksinimidil ester (CFSE) ile farelerin her iki grup DC'lerin ko-kültür, aşağıdaki akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Önemli ölçüde gelenek daha genel duyarlılık geliştirilmiş olan bu yaklaşım, CD4 ⁺ T hücreleri çoğalan yüzdesi doğru belirlenmesi sağlanırark radyoaktif reaktifler ile deneyleri. Bir mikrosantrifüj tüpü sistemi ICS protokolünün iki hücre kültürü ve sitokin boyama prosedürleri kullanılmıştır. Geleneksel doku kültürü plaka tabanlı sisteme kıyasla, bu değiştirilmiş prosedür biyogüvenlik düzeyi (BL) 3 tesislerinde gerçekleştirmek için daha kolay oldu. Ayrıca, WNV- enfekte olmuş hücreler BL3 dışındaki daha sonraki analiz etkin analizlerde içinde paraformaldehit ile işleme tabi tutuldu. Genel olarak, bu in vitro bağışıklık tahlilleri, etkili bir Batı Nil Virüsü enfeksiyonu esnasında hücre-aracılı bağışıklık karşılıklarının değerlendirmek için de kullanılabilir.

Giriş

Batı Nil virüsü (BNV), bir nörotrop, artı-hissedilen flavivirüs, gelişmekte olan bir halk sağlığı tehdidi olduğunu. Şu anda, hiçbir aşı beşeri ¹ için onaylanmıştır. Yapısal olmayan (NS) 4B protein bir P38G yer değişimine bir zayıflatılmış Batı Nil Virüsü soyu, vahşi tip Batı Nil Virüsü NY99 suşu ^2'den farelerde hiçbir farelerde ölümcül bulunmuştur ancak daha yüksek doğal sitokin ve T hücresi tepkilerini teşvik ettiği bilinmektedir. NS4B-P38G mutant ile bağışıklık kazandırılmış fareler öldürücü doğal tipte Virüsü ile ikinci bir sorun korundu. Bu NS4B-P38G mutant ideal aşı adayı için uygun özelliklere sahip olduğunu göstermektedir. NS4B-P38G mutant yüksek koruyucu adaptif bağışıklığı hangi mekanizmalar henüz net olarak anlaşılamamıştır. Patojen ilişkili moleküler desenleri tanımaya Toll benzeri reseptörler (TLR), viral enfeksiyon karşı doğal bağışıklığın başlamasında önemli bir rol oynamaktadır. Çekirdek TLR sinyal yolu miyeloid farklılaşma birincil yanıt ge kullanırBirincil adaptörü ^3,4 olarak ne 88 (MyD88). Yeni bir çalışmada, MyD88 sinyal farelerde ⁵ Batı Nil Virüsü NS4B- P38G mutant enfeksiyonu esnasında hücre aracılı bağışıklığın gelişiminde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Dentritik hücreler (DC'ler), viral enfeksiyonun ^6,7 sırasında birincil T hücresi tepkilerini başlatmak için benzersiz kapasitesini gösteren en önemli antijen sunan hücreler bulunmaktadır. CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ T hücreleri, uzun süreli koruyucu bağışıklık katkı ve vahşi tip Batı Nil Virüsü enfeksiyonu ^8,9 Aşağıdaki ana yaşaması için önemliyse her ikisi. İki immünolojik tahliller NS4B-P38G mutant amacıyla enfeksiyon bulaştırılan farelerde bu hücrelerin fonksiyonlarını belirlemek için bu çalışmada kullanılmıştır.

^{- / -} Farelerde İlk olarak, in vitro T hücre prime deney Batı Nil Virüsü ile enfekte edilmiş yabani tip ve MyD88 arasında DC'lerin antijen sunan yeteneği karşılaştırmak için kullanılmıştır. Tahlil, naif CD4 + T hücreleri, 323 (OVA) peptidi tavuk ovalbümin için Vα2 / Vβ5 TCR ifade OTII transgenik farelerden izole edilmiştir OVA peptidi varlığında) -etiketli CD4 ⁺ T hücreleri. Ko-kültür içinde 5 gün sonra, hücreler hasat edilmiş ve paraformaldehit (PFA) ile tespit edilmiş ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Çoğalma tahlilleri geleneksel bir 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) veya toz haline getirilmiş timin deoxyriboside ⁽³ HTdr) ¹⁰ arasında dahil edilmesi yoluyla gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu deneyler radyoaktif ve / veya BNV çalışmalarının yapıldığı biyogüvenlik düzeyi (BL) 3 tesislerde, özel ekipman ihtiyacı ya vardır. CFSE, daha yaygın hale imünolojik deneylerde kullandı vital boyanın flüoresan yoğunluğu seri yarılanmasına lenfosit çoğalmasının akış sitometrik analizi, boya daha stabil olduğu gibive eşit, hücrelere dahil flow sitometri ile kolayca tespit ve ¹¹ radyoaktif olmayan bir. Tahlil, aynı zamanda, hücre bölünmesini belirlemek için yeteneği vardır. Batı Nil Virüsü çalışmalarda, bu tahlili kullanarak bir büyük avantajı,% 1-2 PFA ile enfekte olmuş hücrelerde tespiti, bir BL2 laboratuarda bir akış sitometresinde numune toplama sağlayacak WNV ^12, etkisiz olmasıdır.

Daha sonra, bir tadil edilmiş hücre içi sitokin boyama (ICS) prosedürü MyD88 NS4B-P38G mutantı ile enfekte olmuş farelerde Batı Nil Virüsü spesifik T hücre karşılıklarının düzenlenmesinde sinyalleme rolünü incelemek için kullanılmıştır. Bu tahlilde, enfekte farelerinden yalıtılmış splenositlerin Batı Nil Virüsü spesifik peptidler ile in vitro muamele edildi. Brefeldin bir hücre içinde sitokin tutmak için ilave edildi. 5 saat inkübasyondan sonra, hücreler toplandı, yıkandı ve T hücre alt-gruplar için boyandı. Hücreler daha sonra, PFA sabit geçirgenleştirildi ve interferon (IFN) -γ boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir.Hücreler tespit ve PFA içeren permeabilizasyon tampon maddesi ile muamele edilmiş bir kez başka akış sitometrisi bazlı bir deneyde olduğu gibi, enfekte örnekleri daha fazla işleme ve analizi için bir BL2 laboratuara aktarılır. Birkaç yayınlanan çalışmalarda, biz WNV-enfekte farelerde ^13,14 T hücresi efektör fonksiyonları ölçmek için ICS kullandık. Iyi kurulmuş oluyor rağmen, bu testin bir büyük dezavantajı prosedürü çok uzun ve BL3 tesisleri içinde yapıldığında alıcı daha fazla zaman olabilir olduğunu. Burada, mikro-santrifüj tüpü tabanlı ICS yöntem daha uygun, daha kolay devam etmek ve daha az zaman BL3 laboratuar içinde gerçekleştirilen zaman alıcı olduğu gösterilmiştir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Texas Tıp Şubesi Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Enfekte-Sigara ve BNV ile enfekte fareler ile DH'lere 1. izolasyonu

1. Yaş ve cinsiyet maç 6-10 haftalık, vahşi tip C57BL / 6 (B6) ve MyD88 ^{- / -} fareler. Periton boşluğu içine (ip) ve Batı Nil Virüsü NS4B- P38G mutantının 500 plak oluşturan birim (pfu) ile inoküle. ^{/ - -} CO ₂ ile fareler gün 3 sonrası enfeksiyon, B6 ve MyD88 euthanize. Kontroller olarak her iki grupta da enfekte olmayan fareler kullanın. Her gruptan üçer fare kullanın.
2. Islak% 70 etanol kullanılarak kurban farenin sol tarafındaki kürk ve ön ve arka bacaklarının arasına yarım hakkında, farenin sol tarafındaki kürk kesip. Vücut boşluğu açmak kesin. Forseps kullanarak dalak çıkarın. RPMI ile Petri kabındaki dalak yerleştirin.
3. Göre anti-CD11c manyetik boncuk kullanılarak dalak DC'leri izole edinüreticinin talimatları.

2. Arıtma ve OTII Transgenik Farelerde T hücrelerinin Etiketleme

1. Bir naif OTII fare Hasat bir dalak Yukarıda adım 1.2 tarif ve iki slaytlar buzlu uçları arasında dalak homojenize olarak. 14 ml RPMI orta kadar ekleyin, bir 15 ml konik tüp hücre süspansiyonu aktarın. Süspansiyon 5 dakika oturup yeni bir 15 ml konik tüp bunun 13 ml aktarmak edelim.
2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir CD4 ⁺ T hücresi izolasyon kiti kullanılarak dalak CD4 ⁺ T hücreleri izole edin.
3. 50 ml'lik bir konik tüp içine Aktarım hücreleri, PBS ile iki kez yıkanır. Süspanse ml başına 1 x 10 ⁶ hücre,% 0.5 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) içeren PBS içinde hücreleri ve CFSE 0.5 umol / ml ekleyin. Işıksız bir ortamda 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
4. % 10 ısı ile etkisiz hale getirilen fötal sığır serumu, 5 ml soğuk tam bir ortam (RPMI-1640 ekleyin, 1/100 hacimantibiyotikler / antimikotikler, 1/100 hacim L-glutamin ve 1000 x 2-merkaptoetanol, 1 / 1,000 hacim) konuldu.
5. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Yıkama Hücreler bir kez PBS ile,% 2 PFA 0.2 x 10 ⁶ etiketli CD4 ⁺ T hücreleri saptamak ve bir akış sitometresi üzerinde kazanır. KAKE bazal düzeyini belirlemek için bu örnek kullanın. Tam ortamda etiketli hücrelerin geri kalanını yeniden askıya.

Batı Nil Virüsü ile enfekte Fareler DCler ile 3. Ortak kültür OTII T hücreleri

1. Kültür 2 x 10 OTII farelerin ⁵ saflaştırılmış CD4 ⁺ T hücreleri, tek başına ya da vahşi tip veya MyD88 saflaştırılmış DCler ile ^{- / -} OVA tortu 323-339, bir 24 oyuklu bir plaka içerisinde fareleri (2 x 10 ⁴⁾ (1 g oyuk başına 1 mi tam bir ortamda / ml).
2. 5 gün boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri. Hücreleri, (% 1 FBS, PBS) FACS tamponunda iki sefer yıkama ve 0.25 mi% 2 PFA sabitleyin. Vortex hemen.

In Vitro 4. Akım Sitometri Analizi </ Em> T Hücre Astar

1. Edinimi için, çift yazılım simgesi flow sitometri tıklayın. SSC-A 200.000 FSC-A 200.000'den ve 0 lineer FSC-A vs doğrusal SSC-A yoğunluk arsa, kanalları seçmek için 0. (Şekil 1A bakınız P2) Ardından, canlı hücreleri üzerinde bir kapı oluşturun.
2. KAKE floresan yoğunluğunu analiz etmek, FL1 kanalı için histogramı açmak ve kapı nüfus 20.000 olayları kazanır. Tek başına kültürlenen (Şekil 1A) OTII hücreleri için örnekler üzerinde bir işaret ayarlayın.
3. Vahşi tip DCler (Şekil 1B) veya MyD88 birlikte kültürlenmiş OTII hücreleri için numuneler elde edin ^{- / -} DCler (Şekil 1C) benzer bir şekilde.

5. izolasyonu ve sitokin tahlilleri için splenositler uyarılması

1. Ste de anlatılan ile aynı prosedür kullanılarak Batı Nil Virüsü NS4B-P38G mutant farelere ^{- / -} B6 ve MyD88 Infects 1.1. Günde 30 sonrası enfeksiyon anda, yeniden meydan günlerinde 8 ve ikincil enfeksiyonu takiben 21 ilköğretim sonrası Batı Nil Virüsü enfeksiyonu veya 4. günde de yabani tip BNV suşu ip 2000 PFU'nun ile fareler hayatta, dalak toplanması için CO ₂ ile fareler euthanize .
   NOT: Her bir zaman noktası için, grup başına 2-3 fare kullanıldı.
2. Aşama 1.2 ve adım 2.2 tarif edildiği gibi dalak tek bir hücre süspansiyonu yapmak. Hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısı 10 ml tam orta bunları yeniden askıya.
3. 2.5 x 10 ⁶ hücre / ml komple ortam ile hücrelerin seyreltin. 1.5 ml mikro santrifüj tüpü içinde splenositlerin 1 ml ilave edilir.
4. DMSO içinde 1 mg / ml Batı Nil Virüsü özgü NS4B ve E peptidler (SSVWNATTA ve IALTFLAV), CD8 ⁺ T hücreleri simüle sulandırmak. CD4 ⁺ T hücrelerinin uyarılması için, DMSO içinde 1 mg / ml Batı Nil Virüsü özgü NS3 ve E peptidler (RRWCFDGPRTNTILE ve PVGRLVTVNPFVSVA) seyreltin. Followe hücrelere peptidlerin 10 ul ekleBrefeldin bir solüsyonun 1 ul d. Kontroller olarak peptidler, tedavi olmaksızın hücreleri kullanır. Hücreleri karıştırın.
5. Tüpün kapağının bir 18 G iğne ile iki delik Punch. 5 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.

6. Hücre içi Sitokin Boyama

1. Yeni bir mikro-santrifüj tüp hücreleri aktarın. 300-400 xg'de 5 dakika boyunca hücreleri Spin ve süpernatant kapalı dökün. 300-400 xg'de 1 ml FACS tampon, spin 5 dk ekleyin ve 120 ul FACS tamponu ile pipetleme hücreleri askıya yeniden.
2. 2 ul Fc engelleyici ilave edin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkalayın. Her bir tüpe 1 mL FACS tampon ekleyin. Spin 300 5 dk - 400 x g.
3. 300 ul FACS hücreleri askıya Yeniden tampon ve üç tüpler (tüp başına yaklaşık 0.8 x 10 ⁶ hücre) bölebilirsiniz. Tablo 1 'de gösterildiği gibi, fare IgG-PE boyaması için her bir kültür durumda ilk tüp tutar. İkinci boru için, CD4, anti-CD4 APC 3 ul peptit ile muamele edilmiş hücreler, 3 μCD8 peptidler ile muamele edilmiş hücreler ya da peptidler, tedavi olmaksızın hücrelere iki eden antikorlara karşı anti-CD8 FITC l. Tazminat boyama üçüncü tüp kullanın. Her kültür koşulu için, APC-konjuge CD4, FITC konjuge CD8 veya FL1, FL2 ve FL4 kanalları için tazminat kontrolleri gibi yalnız PE etiketli CD3 antikorları (tüp başına 3 ul) ile boyanmış hücrelerin üç tüpleri kullanın.
4. Kısaca girdap hücreleri. 20 dakika boyunca buz üzerinde boş ve ışıktan korur. 1.4 mi FACS tampon ekleyin. 300-400 xg'de 5 dakika Spin ve süpernatant kapalı dökün.
5. Hücre pelet (veya kısaca girdap) bozmaya çalkalayın. 250 ul sabitleme / permeabilizasyon solutionby pipetleme hücre pelet yeniden askıya. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve ışıktan korur.
6. 1.2 mi FACS tampon ekleyin. 300 ul FACS tampon 300-400 xg ve tekrar süspansiyon hücreleri de Spin 5 dakika.
   NOT: Bu noktada, hücreler u ışıktan daha fazla işlenmek üzere bir BL2 laboratuara aktarılır ve saklanan bir buzdolabı ve korunabilirÜç gün p.
7. 500 ul FACS tampon ekleyin. Sıkma 1x permeabilizasyon / yıkama tamponu içinde 500 ul 300-400 xg ve tekrar süspansiyon hücreleri de 5 dak. Sıkma 300-400 x g'de 5 dak.
8. Daha önce ayrılmış bir tüp içinde aşama 6.3 ve 3.5 ul fare IgG-PE CD4 antikor ve / veya CD8 T hücresi belirleyicileri ilave boruya 3.5 ul anti-IFNy-PE eklemek, 100 ul 1x Perm / Wash hücrelerin yeniden askıya ve buz üzerinde 25 dakika süre ile, IgG kontrolü için ışıktan koruyunuz. 1x permeabilizasyon / yıkama tamponu 1.4 ml ekleyerek hücreleri yıkayın. Sıkma 300-400 x g'de 5 dak. 1.4 ml 1x permeabilizasyon / yıkama tamponu ekleyerek yıkama adımı tekrarlayın.
9. 300-400 xg'de 5 dakika Spin ve süpernatant süzün. FACS tampon 1.4 ml ilave edilmesi ve nihai edinimi için FACS tampon 400 ul yeniden askıya hücreleri yıkayın.

Hücre içi Sitokin Boyama 7. Akım Sitometri Analizi

1. Adım 4.1 aynı satın alma ayarları kullanın. Create canlı hücreler üzerinde bir kapı (P2, Şekil 2A 'ya bakınız). Her grup için tazminat tüpler kullanılarak gerilimleri ayarlayın.
2. Açık iki yeni nokta araziler, bir vs FL1 için toplanan verileri görüntülemek için. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), diğeri vs FL4 için toplanan verileri görüntülemek için. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Her numunenin kapılı nüfus için 50.000 olayları Edinme.

Sonuçlar

^{- / -} OVA peptidlerinin varlığında veya yokluğunda, farelerde T hücresi priming tahlilde, CFSE etiketli, CD4 ⁺ T hücreleri, NS4B-P38G mutantı ile enfekte edilmiş yabani tip ve MyD88 arıtılmış DCler ile kültürlenmiştir. 5 gün negatif kontroller olarak kullanılmıştır için etiketli T hücreleri ya da OVA olmaksızın tek başına kültürlenmiştir. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, toplam T hücre FL1 kanal flüoresans yoğunluğu analizi için kapı edildi. işaretleyici DC'lerin ko-kültür olmadan ço...

Tartışma

BNV bir BL3 patojendir. Nedeniyle güvenlik yönetmeliklerine, WNV-enfekte örnekleri ile immünolojik testler genellikle BL3 tesisleri veya gerçekleştirmek için daha uzun ve sıkıcı bir ekipman durumu ile sınırlıdır. Yeni bir çalışmada, biz Batı Nil Virüsü enfeksiyonu ^5. sırasında hücre aracılı bağışıklık yanıtlarını incelemek için iki akış sitometri tabanlı yöntemler kullanılır. Analizlerde, Batı Nil Virüsü ile enfekte edilmiş hücreler,% 1-2 PFA doğrudan ya da% 4 PFA içeren sabitleme / permeabilizasyon çözeltisi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
RPMI 1640	Invitrogen	11875	37 ° C'de ısınma & C
anti-CD11c manyetik boncuklar	Miltenyi Biotec	130-052-001	üreticiyi takip edin S talimatları
anti-CD4 manyetik boncuklar	Miltenyi Biotec	130-095-248	üreticiyi takip edin s talimatları
CFSE	Invitrogen	C34554
OVA kalıntısı 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Peptitler	Proimmün	PC0AD-D
Brefeldin A çözeltisi	BD Bioscience	555029
Fare Fc Engelleyici	e-Bioscience	14-0161-85
APC konjuge CD4	e-Bioscience	17-0041-81
FITC-konjuge CD8	e-Bioscience	11-0081-82
Fiksasyon/Geçirgenleştirme Çözeltisi	BD-Bioscience	554722
Geçirgenleştirme/yıkama tamponu	BD-Bioscience	554723
anti-IFNγ-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Accuri akış sitometresi	BD Bioscience