Bu protokol Proximity ligasyon Testi Drosophila larva nöromüsküler kavşakta yerinde protein-protein etkileşimleri tespit etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Bu teknikle, Diskler, büyük ve Hu-li tai shao postsinaptik bölgede bir kompleks, daha önce birlikte immunoprecipitation ile tespit dernek kurma gösterilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Algılama In Situ Protein-protein kompleksleri Drosophila Larva Nöromüsküler Junction
Bu makalede
Özet
Özet
Discs large (Dlg), membranla ilişkili guanilat kinaz ailesinin korunmuş bir üyesidir ve Drosophila'daki larva nöromüsküler kavşakta (NMJ) ana iskele proteini olarak görev yapar. Önceki çalışmalar, Dlg'nin larva NMJ'deki postsinaptik dağılımının, memeli addusinlerine bir homolog olan Hu-li tai shao'nunkiyle (Hts) örtüştüğünü göstermiştir. Ek olarak, Dlg ve Hts'nin, tüm yetişkin sinek lizatlarını içeren ko-immünopresipitasyon deneylerine dayanarak birbirleriyle bir kompleks oluşturduğu gözlenmiştir. Bununla birlikte, bu deneylerin doğası gereği, bu kompleksin larva gelişimi sırasında özellikle NMJ'de var olup olmadığı bilinmiyordu.
Proximity Ligation Assay (PLA), protein-protein etkileşimlerini yerinde tespit edebilen, daha çok hücre ve doku kültüründe kullanılan yeni geliştirilmiş bir tekniktir. Bu tahlilde, numuneler, standart immünohistokimyasal prosedürler kullanılarak ilgilenilen iki proteine karşı birincil antikorlarla inkübe edilir. Birincil antikorlar daha sonra, PLA probları olarak adlandırılan, özel olarak tasarlanmış bir oligonükleotid konjuge ikincil antikor çifti ile tespit edilir ve bu, yalnızca iki prob birbirine yakın bağlandığında bir sinyal üretmek için kullanılabilir. Böylece, bir kompleks içinde bulunan proteinler görselleştirilebilir. Burada, PLA'nın Drosophila larva NMJ'sindeki in situ protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir. Teknik, NMJ'lerin postsinaptik bölgesinde Dlg ve Hts arasında bir kompleksin gerçekten var olduğunu göstermek için larva vücut duvarı kas preparatları üzerinde gerçekleştirilir.
Giriş
Büyük Drosophila Diskler (DLG), plazma membranının belirli bölgelerde büyük protein komplekslerinin montaj orkestra yardımcı proteinleri iskele ve zara bağlı guanilat kinaz ailesinin bir korunmuş üyesidir. Bir tümör baskılayıcı protein, Dlg epitel apicobasal polarite 1,2,3 önemli bir belirleyicisi olarak hizmet gibi Başlangıçta belirledi. Dlg da larva gelişimi 4 sırasında glutamaterjik motor nöron nöromüsküler bileşke (NMJ) bir ana iskele modülü olarak hizmet vermektedir. Dlg larva NMJ farklı roller oynar ve onun pleyotropizm birden proteinler 5,6 ile ilişkilendirmek için kendi yeteneklerine bağlıdır. Böyle bir protein, Hu-Li Tai shao (HTS), esas olarak, 7 hücre iskeleti aktin-spektrin düzenlemedeki rolleri ile ilgili olarak tarif edilmiştir, memeli adducins bir homologudur. Daha önce Dlg ve Hts, in vitro göre birbirleri ile bir kompleks meydana getirebilir gösterilmiştir Bütün yetişkin sinek lizatlarını 8 içeren ko-immünopresipitasyon deneyleri. Bu sonuçların bir eksiklik, ancak, bu karmaşık formlar göstermemektedir olmasıdır. Immünhistokimyasal kullanımı ile, Dlg ve Hts dağılımları larva NMJs postsinaptik membran üst üste görülmektedir, ancak bu bölgede 8 bir kompleks vardır? Son zamanlarda gösterilen ve daha burada ayrıntılı olarak, Proximity ligasyon Testi (PLA) larva NMJ 27 de özellikle Dlg ve Hts arasındaki in situ dernek bir bakmak için kullanılır.
PLA çok yerinde 9, protein-protein etkileşimlerini tespit edebilir, hücre ve doku kültürü içinde kullanılan nispeten yeni bir tekniktir. Bu deneyde, ilgi konusu iki protein karşı birincil antikor türe spesifik antikorlarla bir çift tespit edilir, oligonükleotidlere konjüge olduğu PLA problar olarak adlandırılan (Şekil 1A, B). İki protein halindes, bağlı PLA sondaları arasındaki mesafe iki ek bağlayıcı oligonükleotidler (Şekil 1C) melezlenmesi ile köprülenebilir (nanometre bir kaç on içindeki) birbirine yakın temas içindedir. Bu uyum, bağlayıcı oligonükleotidler serbest uçları, her biri bir diğeri ile temas için yeterince yakın olan ve bir kapalı dairesel bir DNA molekülü, in situ ligasyon (Şekil 1D) üzerine oluşturulabilir. dairesel bir DNA molekülü PLA probları (Şekil 1E) konjüge edilmiş oligonükleotidlerin bir kişi tarafından hazırlanmış olan yerinde yuvarlanan çember amplifikasyonu için bir şablon olarak hizmet vermektedir. Elde edilen çoğaltılmış, concatemeric DNA ürününün içinde sekanslar daha sonra floresan etiketli tamamlayıcı oligonükleotid prob (Şekil 1F) ile görselleştirilebilir. Yükseltilmiş DNA PLA problarının bir protein-protein etkileşimi withi hücre içi lokalizasyonu bağlı kalır yanana doku kolayca tespit edilebilir.
Çeşitli yöntemler yaygın olarak, ko-immünopresipitasyon olarak in vitro teknikler de dahil olmak üzere protein-protein etkileşimlerini tespit (-aşağı çekme deneyleri ve maya iki-hibrid eleme ve bu Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) ve Biyomoleküller Floresan tamamlama gibi in vivo teknikler kullanılır BiFC). In vitro teknikler hatadır etkileşimi endojen nerede oluştuğunu Anılan in vivo teknikleri kendi endojen meslektaşları yerli davranışını yansıtmıyor olabilir füzyon proteinlerinin yapay ifadesini içerir iken onlar, tespit kalmamasıdır. PLA bir avantaj da FR karşılaştırılabilir olan bir sinyal üretmek için gerekli olan yakınlık derecesine sahip, bir doku içinde, birbirine çok yakın olan ve büyük olasılıkla bir kompleks oluşturan endojen protein uygulayıcı hücre içi lokalizasyonu belirleme kapasitesine sahip olmasıdırET ve BiFC. PLA nedeniyle antikor tanıma ve DNA amplifikasyonu bağlanması yüksek özgüllük ve duyarlılık ile etkileşimleri algılayabilir. Böylece, tahlil etkileşim kesin konumunu ortaya puncta şeklinde ayrık, parlak sinyaller üretebilir. Buna ek olarak, zor görülen antijenler tespit edilebilir. Son olarak, PLA gerçekleştirmek için nispeten basit bir tekniktir ve tamamlamak için standart bir immünohistokimyasal prosedürde daha uzun sürer. Bu nedenle, PLA genellikle uzun hazırlık süreleri ve kapsamlı sorun giderme ile boğulmuş diğer protein-protein etkileşimleri deneyleri üzerinde bir teknik avantaj sağlar.
Bu protokol, PLA yerinde endojen protein-protein etkileşimlerini tespit etmek amacıyla, Drosophila larva NMJ uygulanabilir gösterilmiştir. Burada, PLA Dlg ve Hts gerçekten NMJs postsinaptik bölgede bir kompleks var olduğu gösterilmiştir larva vücut duvarı kas hazırlıkları yapılır. PLA önce larva NMJ incelemek için kullanılan olmamıştır, ve Drosophila dokusunda bu testte kullandık yayınlanan bildiri sadece bir avuç şu anda vardır. Bu Drosophila topluma PLA daha pozlama başka, daha yaygın olarak kullanılan protein-protein etkileşimleri deneyleri tamamlamak için ek bir araç olarak artan kullanımı neden olacağı ümit edilmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Vücut Duvar Hazırlık
. NOT: Daha önce Brent ve arkadaşları 10, ya da Ramachandran ve Budnik ağacının 11,12 tarif edildiği gibi (vücut duvarı kasları innerve NMJs bir çalışma için), üçüncü evre larvaların gövde duvarları hazırlanması ancak bazı tadilatlar ile, gerçekleştirildi.
- Teşrih
- Standart prosedürler kullanılarak 13 beş-altı gün boyunca 25 ° C'de sinek stokları ve haçlar kaldırın.
- İnce forseps kullanarak şişeleri ya da şişe Üçüncü dönem larva tarama seçin.
- Herhangi bir gıda parçacıkları çıkarmak için fosfat tamponlu salin (PBS) ihtiva eden küçük bir Petri kabındaki larvaları yıkayın.
- Sylgard diske tek larva yerleştirilir ve buz soğukluğunda PBS birkaç damla içinde bırakın. Buz gibi soğuk PBS işlemek için daha kolay hale larva stun yardımcı olacaktır kullanma. Diseksiyon boyunca, hazırlık her zaman kurumasını önlemek için PBS batmış olduğundan emin olun.
- La yerleştirindorsal tarafı, iki trakea yolları bir mikroskop (Şekil 2A) altında görünür şekilde yukarı bakacak şekilde RVA. Forseps kullanarak, bir minutien pimi kavramak spiracles (Şekil 2B) yakınında arka ucunda larva aşağı pin. Başka bir iğne ile, ağız kanca yakın ön ucundaki manikür delip. Yavaşça, sonra boyuna larva germek (Şekil 2B) aşağı pin.
- Mikrodissek- makas kullanarak, küçük bir açıklık oluşturmak için pin yakın arka ucunu çimdik. kesi sadece manikür geçmesine yeterli yüzeysel olmalıdır.
- İki trakea yolları (Şekil 2C) arasındaki dorsal orta hat uzunluğu boyunca kesilmiş, kesi içine makas alt bıçak ucu yerleştirilmesi. Ventral vücut duvarı kasları zarar vermemek için keserken hafifçe yukarı doğru makas bıçakları yöneltin.
- Biraz mesaja ön bir küçük yatay kesi yapmakeriorly yerleştirilmiş pim (Şekil 2C). Benzer başka bir kesi biraz öne yerleştirilmiş pim (Şekil 2C) posterior olun. kesiler sadece manikür geçmelidir.
NOT: Bir benzemelidir kombine adımlar 1.1.7 ve 1.1.8 üç kesiler "
Tamamlandığında ", yani, larva vücudunun sırt tarafında bir sol ve sağ kanat imal edilmelidir. - Dikkatle forseps ile iç organları dışarı temizleyin. PBS birkaç damla kuvvetli ekleme, larva vücut dışına organları yerinden böylece daha kolay bunları kaldırmak için yapım yardımcı olacaktır. Vücut duvarı kasları zarar verir gibi larva vücudu alay kaçının.
- Açık larva vücudu fora ve aşağı köşeleri (Şekil 2B) pin. Iğneleme zaman eşit olarak gerilmiş bir dikdörtgen oluşturmak üzere yatay ve dikey olarak gövde duvarını streç (see Şekil şekil için 2G), dikkat çekici sürecinde vücut duvarı kasları gözyaşı değil.
- Kalan iç organları (Şekil 2E) kaldırarak bitirin.
- Sabitleme ve Permeabilization
- Bouin Çözüm birkaç damla tutturulmuş beden duvarları daldırın. Buz üzerinde 15 dakika süreyle inkübe edin. Seçenek olarak ise, alternatif bir sabitleyici olarak% 4 paraformaldehit (PFA) kullanır; 30 dakika kuluçkada bırakın.
- Triton Fosfat Tamponu Tuzlu Su (PBT) ile üç kez yıkayın.
- Ince forseps kullanarak, dikkatli işaretçilerine kaldırmak ve bir silikonlu 0.65 ml mikrosantrifüj tüp içine köşesinden beden duvarları aktarın.
- PLA için hazır olana kadar 4 ° C'de PBT gövde duvarı saklayın. En iyi sonuçlar için, bir gün veya diseksiyon iki içinde beden duvarları immün başlar.
NOT: reaktif tasarruf etmek ve tüm vücut duvarları tahlil sırasında eşit muamele sağlamak için, farklı genotip tek yerleştirilebilirtüp. Genotipleri (örnekler için Şekil 2F bakınız) farklı beden duvarları köşelerini keserek ayırt edilebilir.
2. İmmünohistokimya
Not:. Üçüncü instar larva gövde duvarlarının immün önce Brent ve diğerleri, 14 ve Ramachandran ve Budnik ağacının 11'de tarif edildiği gibi gerçekleştirildi, ancak bazı değişiklikler 11,14 ile yapıldı.
NOT: Aksi belirtilmedikçe, oda sıcaklığında ve yumuşak çalkalama ile tüm adımları.
- Bloke etme
- 10 dakika her PBT ile üç kez vücut duvarları yıkayın.
- 1 saat süre ile% 1 Sığır Serum Albümini (BSA) ile bloke edin.
- Immün
- İlgili iki proteinlere karşı fare, tavşan, birincil antikorlar ile gövde duvarı inkübe, oda sıcaklığında 2 saat, ya da gece boyunca 4 ° C'de (% 1 BSA içinde seyreltilmiş). 250 tavşan a: Bu durumda, 01:10 Fare anti-Dlg 1 kullanımınti-HtsM 15,16. Olmayan fare ya da tavşan yapılır markerlere karşı antikorlar da dahil edilebilir - örneğin 1 kullanın: 200 keçi anti-HRP nöronal membranları araştırmak.
- 10 dakika her PBT ile üç kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 2 saat, ya da gece boyunca 4 ° C'de (% 1 BSA içinde seyreltilmiş) ile markalama maddeleri tespit etmek için florofor-konjuge sekonder antikor ile inkübe edin. Keçi anti-HRP antikoru saptamak için 200, FITC-konjuge anti-keçi, örn: 1 kullanmak - PLA sinyali, daha sonra kırmızı bir florofor ile görüntülenmiştir, başka bir flüorofor işaretleyici tespit etmek için kullanılmalıdır. Nedeniyle ışığa duyarlı reaktiflerin kullanılması ile, Bu noktadan itibaren karanlıkta tüpleri tutun.
NOT: PLA konfokal mikroskobu altında kırmızı kanalda görsel sinyal ile, fare ve tavşan büyüdü primer antikorlar arasında gerçekleştirilecek için kullanılan kiti izin verir. Arzu edildiği takdirde, diğer kitleri deney primadonnanın ile yapılması için izin vardırry antikorlar diğer türlerde kaldırdı, ve sinyal diğer kanallar görsel.
3. Proximity ligasyon Testi
NOT: Aksi belirtilmedikçe, oda sıcaklığında ve yumuşak çalkalama ile tüm adımları.
- PLA Sondalar
- 10 dakika her PBT ile üç kez vücut duvarları yıkayın.
- 37 ° C'de 2 saat süre ile (5 seyrelti,% 1 BSA içinde, her biri 1) PLA probları ile inkübe edin. Bu durumda, 5-10 gövde duvarlarının doğru daldırma ve karışmasını sağlamak için PLA sistemi anti-fare eksi 40 ul, PLA sistemi anti-tavşan PLUS 40 ul% 1 BSA, 120 ul kullanın. PLA bir prob 1:25 seyreltme kadar devam (bu deney için, yani,) uygun bir sinyal-gürültü oranı elde edilmesine neden olabilir.
- Ligasyon
- 5 dakika her biri için iki kez Yıkama Tampon A ile gövde duvarı yıkanır.
- 1 saat için a bağlama çözeltisi (bağlama tamponu içinde Ligase 1:40 seyreltme) ile inkübeT, 37 ° C'dir. Bu durumda, 5-10 gövde duvarlarının doğru daldırma ve karışmasını sağlamak için Ligase 5 ul, 5 ligasyonu tampon maddesi 40 ul ve yüksek saflıkta su 155 ul kullanın.
- Amplifikasyon
- 2 dakika her iki Yıkama Tampon A ile beden duvarları yıkayın.
- 37 ° C'de 2 saat boyunca amplifikasyon solüsyonu (Amplifikasyon tamponu Polimeraz 1:80 seyreltme) ile inkübe edin. Bu durumda, 5-10 gövde duvarlarının doğru daldırma ve karışmasını sağlamak için Polimeraz 2.5 ul 5 Amplifikasyon tamponu 40 ul ve yüksek saflıkta su 157,5 ul kullanın.
- Görüntüleme için hazırlık
- 10 dakika her biri için iki kez Yıkama Tampon B ile gövde duvarı yıkanır.
- 1 dakika boyunca bir kez 0.01x Yıkama Tampon B ile yıkayın.
- Montaj önce en az 30 dakika boyunca monte çözeltisinin bir kaç damlası dengeye ya da 4 ° C'de bir gece boyunca muhafaza ediniz.
- Ince forseps kullanarak, dikkatli bir platformu slayt w üzerine beden duvarları aktarmaki kendi tırnak etlerini aşağı bakacak. Satır ve mountant bir damla ya da iki içinde aynı yönde beden duvarları yerleştirin. Daha sonra şeffaf tırnak cilası ile slayt mühür, hava kabarcıkları üretmek için değil hazırlık alarak bakım üzerinde 22 mm x 40 mm lamel yerleştirin.
- Konfokal görüntüleme için hazır olana kadar -20 ° C'de karanlıkta slaytlar saklayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yabani tip Üçüncü dönem larva NMJs ise, Dlg ağırlıklı tipi boutons mı daha Dlg immünoreaktivite düzeyleri tip Ib boutons daha belirgin olmak, tip I glutamaterjik boutons postsinaptik membranda bulunan (Şekil 3A) 4. Hts kas boyunca mevcut ama Hts immünoreaktivite düzeyleri hem tip I boutons eşit görünen ile postsinaptik bölgede yoğunlaşır ve aynı zamanda (Şekil 3A ') 8,17 presynaptically bulunur. Dlg ve Hts dağılımları ölçüde postsinaptik bölgede (Şekil 3A '...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu rapor PLA Drosophila larva NMJ uygulanabilir gösterilmiştir. Deney NMJ endojen protein-protein etkileşimlerini tespit etmek amacıyla larva vücut duvarı kaslarında gerçekleştirilir. Bu teknik ile, Dlg ve Hts birbirine yakın olması ve bu nedenle, özellikle postsinaptik bölge 27'de, bir kompleks içinde bulunması gösterilmektedir. Bu sonucun desteklemek, bir önceki çalışmada aşağıdaki verileri ile dernek kanıtlar sunmuştur: Dlg ve Hts immünoreaktif dağılımları larva NMJs postsinaptik bölgede üst ü...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz sinek stokları sağlamak için Bloomington Drosophila Stok Merkezi'ne teşekkür ederiz. Biz de antikorlar sağlamak için Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası ve Dr. Lynn Cooley (Yale Üniversitesi) teşekkür ederim. Özel bir teşekkür yazının üzerine ona yardım için AhHyun Yoo gider. Bu çalışma Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi (Krieger), William ve Ada Isabelle Çelik Fonu (Krieger) ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (Harden) hibe ile desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Forseps (ince # 5) | Almedic | A10-704 | |
| Sylgard Disc | World Hassas Aletler | SYLG184 | Elastomer tabanı ve kürleme maddesini 10:1 oranında karıştırın. 30 dk için ayarlayın. Bir kalıba dökün (örn. 12 oyuklu bir hücre kültürü plakası kullanın). En az 24 saat kürlenmeye bırakın. Diseksiyon sırasında 60 x 15 mm'lik bir Petri kabı kapağının kapağına yapıştırın. |
| Minutien Pimleri (0.0125 mm uç çapı) | İnce Bilim Aletleri | 26002-10 | |
| Mikrodiseksiyon Makası (ultra ince) | İnce Bilim Aletleri | 15200-00 | |
| Platform Slaytları | İki adet 22 x 22 mm2 lamelleri şeffaf oje ile bir mikroskop lamı üzerine yapıştırın, bir < Numune montajı için arada 20 mm boşluk. | ||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stok Merkezi | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stok Merkezi | 10989 | Hisse senedi, bir GFP dengeleyici üzerinde yeniden dengelendi, böylece homozigot mutantlar GFP sinyalinin yokluğuna bağlı olarak seçilebilir. |
| 1x PBS (Fosfat Tamponlu Salin): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7.0 | NaH2PO4 (Caledon Laboratuvarları - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1) | ||
| Bouin'in Çözümü | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| %4 PFA (Paraformaldehit): 1x PBS'de %4 PFA | PFA (Anakimya Bilimi - 66194-300). Çözümün nasıl yapılacağına ilişkin talimatlar için doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006'ya bakın. | ||
| [header] | |||
| 1x PBT (Tritonlu Fosfat Tamponlu Salin): %0.01 Triton | Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787) | ||
| %1 BSA (Sığır Serum Albümini) ile 1x PBS: 1x PBT | BSA'da %1 BSA (Bioshop Canada - ALB001). 4 ° C'de saklayın. | ||
| fare anti-Dlg (Büyük diskler) | Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bank | 4F3 | %1 BSA'da 1:10 seyreltmede kullanın. |
| tavşan anti-HtsM (Hu-li tai shao) | tarafından sağlanmıştır. % 1 BSA'da 1:250 seyreltmede kullanın. | ||
| tavşan anti-Pak (p21 ile aktive edilmiş kinaz) | tarafından sağlanmıştır. % 1 BSA'da 1:500 seyreltmede kullanın. | ||
| fare anti-Wg (Kanatsız) | Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bank | 4D4 | %1 BSA'da 1:5 seyreltmede kullanın. |
| keçi anti-Hrp (Yaban turpu peroksidaz) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | % 1 BSA'da 1:200 seyreltmede kullanın. |
| FITC konjuge eşek anti-keçi | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | % 1 BSA'da 1:200 seyreltmede kullanın. |
| Duolink Yerinde PLA Probu anti-fare EKSİ | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink Yerinde PLA Probu anti-tavşan ARTI | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Duolink Yerinde Algılama Reaktifleri Kırmızı | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1x Yıkama Tamponu A: 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, %0.05 Tween 20, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337) |
| 1x Yıkama Tamponu B: 0.2 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| 0.01x Yıkama Tamponu B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratuvarları - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| Sigma-Aldrich | ile Duolink Yerinde Montaj Ortamı | DUO82040 |
Kaynaklar
- Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
- Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth. Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, 823-835 (1994).
- Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).
- Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations. J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).
- Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. Adducin: structure, function and regulation. Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).
- Wang, S., et al. Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane. Dev Biol. 357, 392-403 (2011).
- Soderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
- Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis. Development. 134, 703-712 (2007).
- Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination. Neuron. 69, 1114-1131 (2011).
- Spradling, A. C., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153, 135-177 (1999).
- Bokoch, G. M. Biology of the p21-Activated Kinases. Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).
- Bahri, S., et al. The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation. Development. 137, 2023-2032 (2010).
- Albin, S. D., Davis, G. W. Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology. J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).
- Koles, K., Budnik, V. Wnt signaling in neuromuscular junction development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111, 319-330 (2002).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).
- Wang, S., et al. Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction . Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
