Yöntem makalesi

Regioseçici Biolistik Modifiye Gen Tabancası kullanarak Organotipik Beyin Dilimleri Hedefleme

DOI:

10.3791/52148

⸱

24 Ekim 2014

 ,  ,  , 
1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 2MRC-Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organotipik beyin dilimi preparatlarındaki son gelişmeler, bunların biyoteknolojik uygulamalar için kullanılmasına izin vermiştir. Organotipik dilimler, fonksiyonel sinaptik bağlantılar da dahil olmak üzere in vivo biyolojinin yerel yapısal özelliklerini korur. Burada, bu dilimleri etiketlemek ve genetik olarak manipüle etmek için bölgesel seçici bir biyolistik dağıtım yöntemi sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo biyoloji birçok yönlerini koruyarak DNA transfeksivonu biyolojik bilimler ve organotipik beyin dilim hazırlıkları yapılan son gelişmeler ile çok değerli olmuştur, çeşitli heterolog genlerin etkisi böylece kolayca incelenmiştir olabilir. Geleneksel transfeksiyon yöntemleri gibi düşük verim ve canlılığı önemli kayıplara da zorluklarla dolu olmuştur hangi terminal farklılaşmış nöronların geçiştirilmesi için giderek artan bir ilgi olmuştur. Biyolistik transfeksiyon, memeli dokularında kullanmak için uygun olduğunu, bu zorlukların pek çoğu, ancak son zamanlarda bu teknik, modifiye edilmiş aşmak olabilir.

Gaz odasına modifikasyonlar gen tabancası ateşleme doğruluk gelişmiş transfeksiyon ve verimlilik kaybına neden olmaksızın daha düşük gaz basınç altında (50 psi) kullanımına imkan veren penetrasyon derinliklerinde olan artış yanı sıra, pa odaklanmış bir regioselektif yayılmasını izin adres3 mm dahilinde rticles. Buna ek olarak, bu teknik, anlaşılır ve hızlı sıkıcı mikroenjeksiyon daha yapılmasıdır. Epizomal sentezleme, 24 saat içinde tespit edilebilir ve hücrenin hayatta kalma, daha iyi ya da geleneksel yöntemlere en azından eşit olduğu gösterilmiştir burada geçici ve kararlı sentezlenmesi için her ikisi de nanopartikül bombardımanı ile mümkündür. Ancak bu teknik, bir çok önemli bir avantajı vardır: anatomik olarak heterolog gen etkilerini izole etmek için imkan tanıyarak tek bir ölçülü yarıçapı içinde lokalize olduğu transfeksiyon izin verir. Burada geliştirilmiş bir gen tabancası kullanarak transfeksiyonunu regioseçici için canlı yetişkin organotipik dilimleri hazırlamak ve bunları göndermek için derinlemesine bir protokol mevcut.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Başlangıçta biyolistik tekniği, "biyolojik balistik" için bir turn-of-deyim, bitki hücreleri 1 içine parçacık-aracılı gen transferi için kurulmuştur. Hücre dönüşümünün fiziksel olarak bu yöntem, örneğin, DNA ya da boyalar gibi yüklerin teslim etmek amacıyla geçirgen hücre zarlarının fiziksel engellerin üstesinden gelmek için yüksek hızda mikro veya nano-tanecikleri hızlandırır. Bu spesifik bir ligand-reseptör ve / ya da hücre yüzey membranları de biyokimyasal özelliklerine bağlı değildir, çünkü, partikül aracılı gen transferi, hali hazırda, Organotipik beyin kesitleri gibi biyolojik sistemleri çeşitli uygulanabilir.

In vivo biyoloji 2-4 ilgilendiren birçok anatomik ve biyokimyasal özelliklerini korumak beri kullanmakta organotipik dilimleri vitro platformlarda diğer üzerinde avantajlara sahip. Dilimler çoğunlukla onlar kökenli ve preser nerede gelen yerel mimari özelliklerinin korunmasınörokimyasal aktivite ve sinapsların bağlantı ettik. Temel araştırma beyin dilimlerinin kullanımı, ve ilaç çalışmalarında, eş zamanlı olarak ölçer ve bağlam 3,5-7 gibi in vivo beyin nörobiyolojik davranışlarını kontrol etmek mümkündür biyoteknolojik manipülasyon sayısı artmıştır. Organotipik dilim-bazlı analiz sistemlerinin kullanılması için önemli bir avantajı, kolay bir deney kontrolü sağlar ve hücre dışı durumlar kesin manipülasyonlara olanak sağlamasıdır.

Verimli bir, Organotipik dilim kültür sistemleri gibi beyin bölgelerinin çeşitli kurdu, ancak korteksi, omurilik ve beyincik 8-10, bunlarla sınırlı değildir edilmiştir. Ayrıca, alt kültürleri olarak bir dizi uzak beyin bölgeleri boyunca hem de nöronlar ve patolojik hücreler arası iletişime 11,12 arasında değerlendirilmesine imkan vermektedir ki, ispat edilmiştir. Birçok protokolleri zaten s kurulmuşturuccessfully kültür Organotipik dilimleri ve uzun vadede kalıcılığı korumak ve birçok yeni çalışmalar şimdi 13 membran arabirim yöntemleri ve çeşitli değişiklikler kullanmaktadır. Bu ilke, gözenekli bir zar filtre üzerinde dilimleri yerleştirerek orta ve Küvözün nemli bir atmosferde arasındaki ara yüzeyde Organotipik dilim korur. Orta Böylece kılcal hareket yoluyla organotipik dilimleri beslemek için yeterli besin sağlayabilir. Tipik haliyle dilimleri erken doğum sonrası hayvanlardan elde edilmiştir (- 9 günlük 3 P3 - 9). Ancak, bu dilimlerden beyin dokuları hücresel plastisite yüksek düzeyde gösterilecek ve canlı kültürleri elde etmek yararlı mekanik streslerin doğal bir direnç var, henüz olgun sinapslar ve Nöroanatomik devresi tamamen yaşı 2 ila 3 hafta kadar in vivo gelişmiş değil 14. Örneğin, önceki gözlemler P0 ile elde edilen hipokampal dilimleri göstermişti - 1 yenidoğanlar yüksek VIAB rağmenle hazırlanması sonrasında, yavaş yavaş bazı morfolojik özellikleri kaybetti. Esasen, yaşlı hayvanlarda 15,16 den organotipik kültürlere kıyasla-farklılaştığı de daha fazlaydı olgunlaşmamış hücreler düşündüren uzun vadeli kültürler için uygun olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle bizim yöntem olgunlaşma ve mimari gelişim onların terminal safhaya 13,17-21 ulaşmış hangi yetişkin organotipik beyin dilimleri için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, aynı zamanda, yenidoğan ve çocuk Organotipik dilim için uygundur.

Canlı organotipik dilimleri üretilen sonra dilim içeren tüm plaka biolistik montaj getirildi ve teslimat ve transfeksiyonunu regioseçici sunulabilir. (Dokuya açıklığından) doğrudan dilimleri üzerine, 10 mm'lik bir mesafede 90 ° yönlendirilmiş (Şekil 1 'de tarif edildiği gibi) gen tabancası Uygun montaj, 40 nm hızlı biyolistik gitmek verirld parçacık kargoları kaplı. Bu tür boyalar ve floresan bir DNA vektörleri gibi bu yüklerin, hem de ilgili herhangi bir gen, hali hazırda kolaylıkla uygulanabilir dilimlere teslim edilir. Bu nedenle bu yöntem, bir bölge seçici bir şekilde sunmak için gerekli protokolü tanımlamaktadır, uygun bir Organotipik beyin dilimler halinde kargo ile kaplanmış altın nano partiküller. Gen namlu ve en uygun montaj Şekil 1'de görülebilir. Geliştirilmiş namlu ve nanoparçacık balistik ilgili daha fazla bilgi için, ve ark. 17 O'Brien bakınız.

Sonraki iyileştirmeler aynı zamanda, kullanıcının mikro-taşıyıcı Yük Miktarı (MLQ) gibi tanımlanmıştır hedef alan başına iletilen altın miktarı uygun olarak koşullarının optimize edilmesi, ve DNA yükleme oranı olarak tanımlanan altın mg'ı başına yüklü DNA miktarını belirlemek için endikedir (DLR). Altın parçacıklar üzerine DNA çökelmesi ve gerçek gen tabancası 'kartuşlarını içermektedir Tefzel boru içine yükleme önce9 ;, dokularda ve koşullar arasında biraz farklı olabilir, her bir transfeksiyon için gerekli olan DNA ve altın miktarını hesaplamak için gerekli olan (oran 1 ila 1 mg altın ve 1 ug DNA arasında olmalıdır: 5). Bu şekilde, aksi takdirde, DNA ile kaplanmış altın partikülleri artış doku hasarı ve sitotoksiklik ile de biyolistik formanın homojenliği azaltabilecek beklenenden aglomerasyon, daha büyük oluşturarak birbirine bağlı olabilir dlr MLQ doğru oranını hazırlamak için hayati önem taşımaktadır.

Bu yöntem biolistik teslim son gelişmeleri, test edilmiş ve yenidoğan çocuk ve yetişkin organotipik beyin dilimleri için mükellef olduğu belirlenen edilmiştir gösterir. Bundan başka, gen tabancası namlu indirgenmiş biyolistik yayılmasını yararlanılarak, kullanıcı artık seçici olarak beyinde dakik bir bölgeyi transfekte edebilmektedir. Uygun enkübasyon süresinden sonra, 24 ile 48 arasında maksimum fiyat ulaşır floresan proteinleri ifadesaat, epifluoresan ve konfokal mikroskobu ile görülebilir. Bu flüoroforlar biyolojik ilgili yapıların içinde morfolojik analizi ve bireysel hücrelerin lokalizasyonu izin verir. Bununla birlikte, diğer heterolog genler tarafından Organotipik dilimlerin bölge seçici modülasyonu, aynı zamanda, bu preparatlar için uygun başka herhangi bir test ile izlenebilir. Lokalize gen aktarımı için mümkün olan bir çalışma stratejisi, Şekil 2'de sunulmuştur.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan ve hayvan dokularının kullanımı kesinlikle yerel kurallar ve düzenlemeler çerçevesinde etik komite onayı uymalıdır. Bütün dokular MRC-LMB en hayvan deneyleri kurallarına uyulması bu çalışma sırasında elde edilen.

Malzeme ve Kültür Medya hazırlanması 1.

  1. Millipore su kullanarak tüm çözümler hazırlayın; sadece analitik dereceli reaktif kullanınız. Hazırlayın ve (aksi belirtilmedikçe) RT'de tüm reaktifleri saklayın.
  2. HEPES-tamponlu tuzlu su (10 mM HEPES, 120 mM NaCI, pH 7.2) 500 ml olun. 0.2 um steril filtre ünitesi vasıtasıyla filtre edin. 4 ° C'de saklayın.
  3. (10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, pH 7.4 PBS) fosfat tamponlu tuzlu su, 500 ml olun. Otoklav ile sterilize edin.
  4. 100 N2 su: 25 mM HEPES,% 10 fetal dana serumu, 30 mM glukoz, 1 ile DMEM (Dulbecco'nun geliştirilmiş Eagle ortamı) ilave etmek suretiyle nöronal ortamı hazırlayınpplement, penisilin-streptomisin 1100 U / ml; pH 7.2. 0.2 um steril filtre ünitesi filtre. 4 ° C'de saklayın.
  5. 1 ml% 100 etanol içinde 20 mg PVP polivinilpirolidon (PVP) stok solüsyonu olun. -20 ° C'de 1 ml tutarlar, dondurma ve mağaza içine kısım bu. Kullanmaya hazır çözelti 0.05 mg / ml, bu nedenle% 100 etanol içinde her 4 ml PVP stok çözeltisi 10 ul eklenir.
  6. Millipore, su içinde 0.05 M spermidin bir stok çözelti hazırlayın; 7.2 pH'ı ayarlanır.
  7. (Steril bir vidalı kapaklı bir şişeye 100 ml DMEM içinde 2 gr elektroforezi derece agaroz) DMEM içinde,% 2 agaroz solüsyonu yapmak. Agaroz eriyene kadar bu mikrodalga. Gerekirse, birkaç hafta boyunca 4 ° C'de buzdolabında saklayın.

Organotipik Dilimleri 2. Hazırlık

  1. CO C57 Black 'dekapitasyon 2 boğulma, istenen yaş 6 fareler öldürülür. Lateral kafa kesim foramen magnum başlayan ve biten kullanarak beyin çıkarınkoku lobları. Yavaşça beyin maruz arkadan kafatasını kaldırın.
  2. Beyinciğe koku lob ve frontal korteks ve rostral arasında kesin. Yavaşça beynin rostral kısmını kaldırın ve optik sinirler kesilir. Son olarak, beyin kaldırmak ve buz üzerinde buz gibi soğuk HEPES-tamponlu tuzlu su ile doldurulmuş bir petri tabağına yerleştirin.
  3. Ince forseps kullanarak pia soymaya, bir mikroskop kullanarak; dikkatli beyin çevresinde kan damarları ve meninks çıkarın.
  4. Küçük bir alıcı kalıp içine taze beyin yerleştirin ve biraz RT yukarıda soğutulmuş agaroz çözeltisi ile kaplayın. Daha sonra hızla buz üzerine yerleştirerek 4 ° C kalıp soğutulur.
    NOT: canlılığının kaybolmasına önlemek için mümkün olduğunca hızla dilim işleyin.
  5. Agaroz kuruduktan sonra (5-10 dakika), kalıptan Agaroz yerleştirilen beyin kaldırmak (gerekirse kısaltılabilir), ve daha sonra vibroslicer platforma tutkal. Steril buz PBS içeren bir vibroslicer odasına bu yerleştirin. Didaha sonra kirletmesini en aza indirmek için% 70 etanol ile, kullanılmadan önce vibroslicer bölmesini sinfect.
  6. Bir özel inşa vibroslicer veya ticari eşdeğeri kullanılarak beyin kesin. Model kavramı dikey titreşimleri en aza indirirken, kanadın kenarına yatay büyük genlik ve yüksek frekans hareketleri üretebilecek bir doku dilimleyici tasarlamaktır.
  7. 1.5 'lik bir genişlikte, 90 Hz bir salınım frekansı kullanan - 2.0 mm ve yatay düzleme 15 °' lik bir açı oluşturacak şekilde konumlandırılmış kesme bıçağı; 1.7 mm / dk bıçak birimine doğru hareket ettirmek için Agaroz yerleştirilen beyin tutma yerleştirme bloğu ayarlayın. Bir bölme içeren buz gibi soğuk kültür ortamı içine bölümü (150 um) kazan (DMEM pen / strep +% 10 FCS) üretildi. Arsenault ve O'Brien 13 ek video olarak doku dilim Görünümü kesme ve manipülasyon.
  8. Yavaşça kültür med ile 6 çoklu-kuyu tepsi hücre kültürü ekler içine dilim (0.4 mikron, 30 mm çap) yerleştirininsertin dış la, ve% 5 CO2 ile 37 ° C sıcaklıkta nemlendirilmiş bir inkübatör içinde inkübe edilir.
    NOT: aktarma ve dilimleri işlenirken uygun doku canlılığı için son derece nazik olun. Ayrıca, çok fazla sıvı filtre elemanının zara yapışmasını Organotipik dilim önleyecektir. Bu durumda, aşırı sıvı kaldırmak veya yeniden plaka.
  9. Organotipik dilimleri, birkaç hafta boyunca kültüre olabilir rağmen, en iyi transfeksiyon verimi için kaplama sonra en geç 4 gün daha transfeksiyonundan geçin.
    NOT: Uzun süreli kültür koşulları, kullanım AraC veya serum serbest orta 2 glial üremesine önlemek için.

DNA kaplı Mikro & Nano-mermiler 3. hazırlanması

  1. 40 nm çapında altın partiküller kullanılarak nano mermiler hazırlayın. Kısaca, 0.05M spermidin ve altın parçacıkları, 10 mg, 1 mg / ml (pEYFP-N1) 10 ul DNA 50 ul ekle.
    1. Solüsyon karışımı kalsiyum ve spermidin ekleDNA-altın mikro sırasında Ture altın nano DNA moleküllerinin bağlanma yardımcı olmak amacıyla içinde preparasyonu ihtiva etmektedir.
      Not: altın taşıyıcıların mg (DLR) başına kullanılan DNA miktarı, altın 1 ug DNA başına 1 ile 5 mg arasında olmalıdır. Ayrıca, kartuşun (MLQ) başına çekilecek altın taşıyıcı parçacıkların miktarı, kendisinden 0,1 ila altın 0.5 mg arasında değişmesi gerekmektedir. DLR ve MLQ güvenilir ve inceleme altındaki belirli bir sistem hem de ikinci tanecik ve gen tabancası türüne bağlı olarak, her bir kullanıcı için optimize edilmelidir.
  2. 15 ul - yavaşça 10 kesirlerinde 1 M CaCl2 50 ul eklerken bir vorteks ile karıştırın. 30 saniye boyunca 1000 x g'de arada vorteks 5 dk santrifüj takiben, süpernatant kaldırmak. 0.075 M PVP 3.5 ml içindeki altın parçacık pelletini.
  3. Bir şırınga kullanılarak bir boru halinde bu süspansiyon, (2.36 mm iç çap) belirtir. Boru hazırlama istasyonu boru yerleştirin. İzinaltın parçacıkları yerleşmek ve bir şırınga ile aspirasyon ile süpernatant kaldırmak için. Dakika başına eşit, daha sonra 5 L 'de sabit bir nitrojen akışı altında kurutuldu altın parçacıkları, yaymak için boru döndürün.
  4. DNA mermi oluşturmak için, 1 cm uzunluğunda bir boru kesici kullanarak boru kesmek. Ya gen tabancası kartuşu içine hemen eklemek veya gerekli kadar kurutulmuş (4 ° C) tutun.

Organotipik Dilimleri 4. Biolistici Transfeksivon

  1. Steril bir laminer akış kaputu içinde aşağıdaki adımları uygulayın.
  2. Helios gen tabancasının içine 9 V pil ve boş kartuş tutucusunu yerleştirin.
  3. Helyum hortumu ile helyum tankı gen tabancası takın. Yangın 2 - 50 psi 3 boşluklar (boş yuva) helyum hortumu ve tabanca rezervuarları basınç için.
  4. Kartuş sahipleri DNA ile kaplanmış altın içeren kartuşları yükleyin ve gen tabancası içine tutucusunu.
  5. Gen tabancası aralayıcıyı sökün ve takıngen tabancası değiştirilmiş gen tabancası varil.
  6. Steril forseps kullanarak, steril plastik tabak içine organotipik dilim içeren bir filtre yerleştirirler.
  7. Organotipik dilimleri bulunan ortamı çıkarın.
  8. 50 psi'de gaz basıncını ayarlar.
    NOT: Gözlerin korunması esastır ve kulak koruması tavsiye.
  9. 10 mm ölçülen montajı kullanarak, uygun mesafelerde gen tabancası yerleştirin. Dikkatle genetik teslimat için, arzu edilen bölgeye üzerindeki tüp haznesinin merkezi amaçlanmıştır.
  10. % 5 CO 2 inkübatör ile, yani, 37 ° C ateş sonra, taze medya ile geri onların çanak içine ekler yerine ve normal büyüme şartlarına onları geri.
  11. Bittiği, helyum tankı kapatmak gen tabancası gelen basıncı serbest bırakmak ve Helyum tankı gen tabancası ayırın.
  12. Kartuş yuvasını çıkarın ve kartuşları atmak ve gen tabancası temizleyin.
  13. Morfolojisi ve Visua tarafından başarılı penetrasyon için doku edinters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak dilimler lizing. Mikroparçacıkları kullanıyorsanız, eşit altın dağıtmak; dilim görülen altın partiküllerinin yoğun bölgeler olmalıdır. Küçük boyutları nedeniyle Nanopartiküller bilinen mikroskopi teknikleri ile tek bir birim olarak kabul edilemez.
  14. Uygun bir süre sonra (genellikle 1-2 gün), mikroskobik gözlem süresince% 4 paraformaldehit (PFA) içerisinde dilimleri düzeltin.
    NOT: PFA Tespit her zaman arzu edilmez. Canlı hücre görüntüleme için bu adımı kaçının.

5. Sabitleme ve Beyin Dilimleri Görselleştirme

  1. Biyolistik Transfeksiyondan sonra, 2 dakika süre ile PBS içinde iki kere dilimleri yıkayın.
  2. 20 dakika boyunca PBS içinde taze, buz gibi soğuk% 4 PFA içinde inkübe edilerek dilimleri sabitleyin.
  3. 2 dakika boyunca PBS içinde iki kere dilimleri yıkayın.
  4. Membran üzerinde bulunan bir dilim bozmadan, bir neşter kullanılarak destekler boyunca yavaşça kesti. Bir mikroskop lamı üzerine her membran destek / dilim yerleştirmek için forseps kullanabilir. Organotyp istirahatcam slayt, zarın üstünde ik dilimleri.
  5. Dilimin üstüne monte ortamının bir damla ekleyin ve Organotipik dilim ile doğrudan temas halinde herhangi bir kuvvet olmadan yumuşak bir şekilde lamel ekleyin.
  6. Tırnak cilası ince bir tabaka ile lamel sabitleyin.
  7. Uygun bir mikroskop dilimleri gör.

6. Eşodaklı Uygulamaları

  1. 60X / 1.4 Sayısal açıklık (NA) yağ daldırma objektif lens ile dik bir tarama lazer konfokal mikroskop kullanılarak dilimleri gözünüzde canlandırın.
    NOT: konfokal mikroskop en sorunlu özelliği dolayısıyla normalde floresan numune ile görüldü odak 'pus' bir out ortadan kaldırarak, tecrit ve odak düzlemi toplama yeteneğine sahiptir (1 AU ayarlanır) iğne deliği boyutudur. Ince ayrıntıları genellikle bu bulanıklık tarafından örtülmüş ve bir mikroskop nonconfocal tespit edilemez.
  2. 488 nm dalgaboyu Argon lazer ayarlayın ve em toplanması için optimize500-520 nm bandında itted ışığı. Tipik olarak, analiz edildi, her bir sinir hücresinin tam genişliğini kapsayacak şekilde 1,024 x 1,024 piksel ve 0.5 mikron aralıklarla z bölümlerin yığınları ile görüntüleri toplamak.
    1. Çekirdeğin morfolojisini gözlemlemek için, sayacı (- 4 40 nm 420 yılları arasında toplanan 405 nm ve emisyon ışık set dalgaboyu) Bu DAPI hücreleri leke. Emisyonu için 620 nm - Son olarak, kırmızı floresan incelenmesi için, uyarma için 561 nm ve 565 de lazer ayarlayın.
  3. Tipik olarak, 57.6 mikron 2 bir alanı kaplıyordu 4X tarama zoom kullanarak görüntü elde; görüntü boyutları 1,024 x 1,024 piksel bölgesinde idi. Tutanak 0.5 mikron aralıklarla z-bölümlerin yığınları ve 5 projeksiyonlar - Kombine 8 kare.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce 13,22 bildirildiği gibi Organotipik kesit canlılığı, laktat dehidrogenaz aktivitesi, propidyum iyodür etiketleme ve dUTP boyanması ile izlenebilir. Besbelli, dilim canlılığı ve bütünlüğü teslim genetik kargo uzun vadeli sürdürülebilir ifade için önemlidir. Organotipik dilimler halinde biyolistik olan teslimatı takiben, floresan heterolog genin ekspresyonu konfokal mikroskobu ile kontrol edilmiştir. Değiştirilmiş tamburunu kullanarak biyolistik yayılma sıkılığı Şekil 3A'da görülebilir. Şekil 3B, DNA ile kaplı altın nano-tanecikleri ile transfekte hipokampus bölgesinin bir temsili bir görüntüsünü gösterir. 4 transfekte edilmiş yetişkin fare Organotipik dilim için temsili resimlerini göstermektedir. Şekil 4A, Purkinje tabaka arayüzünde ve cer molekül tabakası bulunan dikkate değer bir dendritik bir liman ile, Purkinje nöronda görülebileceği gibi,ebellum pEGFP-N1 ile geçici biolistik nakli takiben belirgin etiketleme gösterir. Şekil 4B dikenleri görülebilir bu dendritlerin daha yüksek bir büyütme göstermektedir. Şekil 4C pDSredFP kaplı altın nanopartiküllerin biolistik doğumu takiben hipokampus CA1 bölgesinde bulunan piramidal bir hücre gösterir .

Bunun yerine, floresan kodlanan bir DNA yüklerin boyalar da Organotipik dilim morfolojik özelliklerini görselleştirmek için benzer şekilde kullanılabilir. Plazma zarları etiketler DIO, daha hızlı bir şekilde tek tek hücre veya morfolojileri tasvir regioselection onaylamak için aynı bölgesine iletilen bir DNA kaplı biyolistik ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Şekil 5A'da görüldüğü gibi hipokampta DIO lekelenmiş bir nöron, canlı da çok sayıda dikenler uzun dendrit gösterir. Bir ok dentrit kıyasla sinaptik boutons varlığı ile tanımlanır akson gösteriric diğer neurites dikenlerin. Şekil 5B, çekirdeğini etiketlemek için. Şekil 5C, bir çok paralel dikenler dendritler bu tür daha yüksek bir büyütme gösteren bir DAPI karşı leke olan çok sayıda çıkıntılar, hipokampal CA1 özeti, bir başka örneğini göstermektedir.

Besbelli, bu görüntüler hücresel etiketlenmesi aşağıdaki morfolojik özellikleri göstermektedir. Hiçbir şey altın nanopartiküllerinin üzerine kaplanan ekzojen genler için de herhangi bir sayıda sağlamak için uygulanan aynı yöntem engeller. Başarılı transfeksiyon görsel bir onay izin vermek için, tek bir plazmid, ilgi konusu gen ile aynı vektör üzerinde bir flüoresan raportör proteini, hem birlikte-ifade etmek için inşa edilebilir.

figure-results-1
Şekil 1. Gen tabancası varil ve montaj. (A) geliştirmek parçacık hızlanma için gerekli basıncı düşürerek doku hasarı minimize kısıtlı biolistik yayıldı MRC-LMB'dan Dr O'Brien tarafından geliştirilen d varil. (B) optimize gen tabancası yan görünüm Dr Henderson tarafından geliştirilen montaj ve Toronto Üniversitesi'nden Dr Andras Nagy. Montaj tam 90˚ Organotipik dilim dik doğru biyolistik dağıtım arasındaki mesafeyi kontrol etmek için kullanıcıya izin verirken, söz konusu gen silahı tutar. Optimum biolistik koşullar için varil diyafram organotipik dilimleri bir 10 mm mesafeden ilgi bölge üzerinde doğrudan konulmalıdır. Montaj gen tabancası (C) Geri görünüm. Transfekte edilecek ilgi alanı namlu açıklığı altına yerleştirmeye gerekir. Hedefleme boya (diolistic) veya floresan proteini transfeksiyonu (bombardımanı) ile teyit edilebilir.ank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2. Organotipik dilim hazırlık ve regioseçici hedefleme. (A) dilimleme için hazır bir DMEM gömülü yetişkin fare beyni. (B) kalıp bir dilim kesmek için hazır bıçak ile montaj vibroslicer üzerine yapıştırılmış. (C) regioseçici heterolog gen ekspresyon koronal Organotipik beyin dilimler halinde biolistik teslimat için stratejiler. Allen Beyin Atlas anatomik referans atlas 23 elde resimlerden hazırlanan Görüntüler. Sol paneli örneğin hedeflenen iki farklı beyin bölgelerini göstermektedir. Sol hemisfer kortikal alana gen ifadesini (1) kısıtlamak için. Beyin, hipotalamus bölgesine heterolog gen ekspresyonu (2) kısıtlamak için. Orta paneli tha gösteririki normalden farklı genlerin ekspresyonunu t (3 ve 4) izole edildi ve esas etkilerinden uzak çapraz-karışma olasılığı gidermek için farklı bölümler kullanım ve / veya verilmesi herhangi bir sapmayı önleyerek, aynı organotipik dilim, iki yarıküre olabilir hipokampus karşılaştırır Bu genler. Sağ panel, başka bir gen (6) bir apayrı henüz üst üste kortikal alan ifade ederken transgenik teslimat olası örtüşme kesin bir kortikal bölgedeki ilk gen (5) ifade etmek için göstermektedir. Bu, aynı dilim içinde birlikte yalnız ve ayrıca her heterolog genin genetik modülasyon etkisini analiz etmek için izin. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3. Biyolistik dağılma modeline filt görülener, kağıt, düşük büyütme görüntü (A). geliştirilmiş namlu altın parçacıklarının yayılmasını belirlemek için filtre kağıdı üzerine atıldı. Sağ panel, normal namlu gösterirken sol tarafı gelişmiş namlu dağılımını göstermektedir. Siyah çubuk: 1 cm. Görüntü ve ark. O'Brien alınan biyolistik yayılmış 6 haftalık farelerde hipokampal bölgesi içinde 3 mm dahilinde stokastik transfeksiyon kalıbında 17 gösteriyor. (B) büyütme görüntü. Beyaz çubuğu:. 100 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
6 haftalık farelerin organotipik dilimler halinde floresan protein kodlanmış DNA Şekil 4. Biolistik teslim. (A) InverteBir pEGFP-N1 kaplı altın parçacıkları transfekte Purkinje hücre beyincik sabit organotipik dilim d konfokal görüntüler. Resim 40X büyütmede alınmıştır. Siyah çubuğu:. 30 mikron (B) dikenleri vurgulamak için başka bir Purkinje hücresinin dendritik limanının bir 60x büyütme gösterir. Siyah çubuğu:. 5 mikron (C) DSredFP piramidal hücreleri transfekte dört 60x büyütme hipokampal bölgeden alınan sabit dilim odaktaş yansımasını gösterir. Siyah çubuğu:. 10 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-5
Organotipik dilimler halinde membran etiketleme floresan boyalar Şekil 5. Diolistic kargo. (A), hipokampal l canlı görüntüleme gösterir20X büyütme altında Dio ile abeled. Dentritik dikenler açıkça dendritik dikenler yokluğunda ve beyaz bir okla gösterilen sinaptik boutons varlığı ile tanımlanan akson hem de gözlenebilir. Beyaz çubuğu:. Hipokampal bölge dio ile etiketlenmiş ve DAPI ile zıt 30 mikron (B) telaffuz boyama. Beyaz çubuğu:. Hipokampusun CA1 bölgesinde bulunan dendritik dikenler 30 mikron (C) Yükseköğretim büyütme (60x). Beyaz çubuğu:. 5 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol gelişmiş bir gen tabancası kullanılarak erişkin organotipik dilimler halinde boyalar ve genetik materyaller sunmak için yaklaşımlar anlatılmaktadır. Esasen, boya çeşitleri ve olası genlerin biyolojik çeşitlilik sorular geniş bir yelpazede cevap bu yöntem çok yönlü ve uygun hale. Belirli bir beyin bölgesinde, bu durumda, ikinci bölge seçici bir dağıtım yöntemi, bir biyolojik olarak uygun bir mimari içinde lokalize alanlarında heterolog gen düzenlenmesi gibi deney için yeni yollar açılmadan önce kolayca uygulanabilir değildir. Daha önce bu yöntem birçok hafta 13 için daha iyi şekilde hücre yaşamım ve heterolog gen ekspresyonu gösterdi olgun sinaps tamamen oluşturulur yetişkin Organotipik dilimleri hakkında kullanılabileceğini belirledik. Memeli beyin için yeni ve geliştirilmiş bir kültür koşulları gibi diğer dokuların ile birlikte, genetik bölge seçici modülasyon kullanımı Biyokimyasal geniş bir yelpazesi için yararlı olacakmical analiz eder.

Biz başkaları 24 tarafından belirtildiği burada ve daha önce vurgulamak olacaktır olarak, birçok farklı faktör kolayca biolistik teslim doğruluğunu ve güvenilirliğini etkileyebilir. İlk olarak, boyalar ya da DNA'ya bağlanmış, altın parçacığı hazırlanması yeterli birarada toplanmasını önlemek üzere, kartuş yük çıkışının kolaylaşması için dengelenmelidir. DNA-altın mikro parçacıklar çözelti içinde kalsiyum ve spermidin altın nano DNA moleküllerinin bağlanmasını yardımcı olabilir. Indirgenmiş basınç altında hücrelere nüfuz etme yeteneği nanopartiküller için daha önce 17 tespit edilmiştir. İkinci olarak, gen tabancası doğru açı ve mesafe ile mümkün olduğu kadar sabit bir şekilde monte edilmelidir. Güvenilir bir basınç göstergesi doku bütünlüğünü korumak için, ve uygun amaçlanan hedeflere altın partiküllerin akışını hızlandırmak için, aynı zamanda yeniden üretilebilirlik için gereklidir. Gerçekten de, ekipman mesafe, yönlendirme ve stabilitesi de t için önemli faktörlerdirargeting ve bölgesel seçici teslimat hassasiyet. Bu beyin yapıları çok küçük olduğundan, ateşleme açısı içinde küçük varyasyonları kolayca tüm prosedür daha az güvenilir hale getirebilir. Ve nihayet, hazırlanması ve canlı organotipik dilimleri bakım farklı hayvanlar, beyin bölgelerinde, yaş ve cocultures henüz bol ve güvenilir protokolleri şu anda 2,4,25,26 mevcut on yıllar boyunca zorluklarla dolu edilmiştir. Bu prosedürler kullanıcı optimize biolistik prosedürlere dokuları göndermeden önce olmalıdır. Bu hali hazırda daha tarafsız bir biyolistik parçacıkların darbe etkisine ve kendi kültürler üzerinde heterolog gen etkisini tespit etmek için kullanıcıya izin verecektir. Bu amaçla, EYFP ve EGFP gibi floresan genlerin kullanımının, hassas hedef test etmek ve de zaman 13 arasında bir süreç boyunca, heterolog gen ekspresyonu sureti ile hücresel viabileteyi takip eden yeni bir kullanıcı izin tutulabilir. Için güvenilir kritik adımların birçoğuve bu protokolün tekrarlanabilir kullanımı şu üç paragrafta vurgulanır.

Etkili transfeksiyon için, DNA konsantrasyonu, uygun olmalıdır. Çok yüksek konsantrasyonlar, nanopartiküllerin kümelenmesine neden olurken, çok düşük konsantrasyonları, transfeksiyon verimi engel olur. Altın Büyüklükleri dramatik, transfeksiyon verimini düşürür düzensiz dağılımları neden ve artan sitotoksisite ve oksidatif strese yol açabilir olabilir. Spermidin çözeltinin bitiminden (her 2-3 ayda bir değiştirilmelidir) bağlı olarak kaplama randıman problemleri ile muhtemeldir. Yeterli bir biyolistik yayılması için, etiketleme hatta olmalıdır. Altın nanopartikül / DNA süspansiyonu, homojen olmayan bir etiketleme PVP çözeltisi ile bağlı olabilir. Aynı zamanda, her 2-3 ayda bir değiştirilmelidir. Altın nanopartiküllerinin yüksek bir kaplama MW bandı 27 gibi agaroz jel elektroforezi ile görülebilir.

Her biyolojik sistsoruşturma altında em yanı sıra nakil ve biolistik yayılması optimize seviyelere ulaşmak için gaz basıncında küçük değişiklikler yapılması gerekebilir kullanılan her farklı enstrüman. Önemli bir parametre plastik kartuştan mikro veya nano taşıyıcılar şerit ve doku içine itmek için gerekli olan helyum darbenin basınçtır. Bu hedef üzerinde şok dalgaları oluşturmak ve bozacak ya da matris 17'den dokuyu ayırmak çünkü yüksek gaz basıncı, hücre yaşamını etkileyecektir. Gen tabancası namlusunu hedefleyen ve tamamen dikey dokuya cihazlarına sahip doğru biyolistik dağıtım için önemlidir. Seçilen alan dış açıklığından tam 10 mm haznenin doğrudan merkezi yerleştirilmelidir. Bu üssü çevresinde altın parçacığı, bir teslimat 3 mm çapında sonuçlanır. Gen silah namlusu her kullanımdan sonra% 70 etanol ile temizlenmelidir. , Büyük bir tanecik agregadan dokuyu korumak için, namlu ayrıca gösterilmemiş bir naylon örgü içerenoptimum performans sağlamak için düzenli olarak değiştirilmelidir lirtilmelidir. Değiştirmek için örgü kapağı, kapağın ve O-halkası arasında yeni bir naylon ağ eklemek çıkarın.

2 gün merkez üssü etrafında transfeksiyonundan sonra - floresan ile işaretlenmiş hücreler en az 1 görünür olmalıdır. Yokluğu veya etiketleme hiza gen tabancası montaj yetersiz hazırlanması ve istikrarsızlık neden olabilir. Konfokal mikroskopi kullanılarak hücrelerin gözlemler bir dizi faktöre bağlıdır: uyarma / emisyon ışığın dalga boyuna, iğne deliği boyutunu, objektif lens NA ışık yolu bileşenlerin kırılma indisi, doku ve hizalanma derinliği alet. Bu faktörler, inceleme altındaki her sistem için optimize edilmelidir.

Biyolistikler son gelişmeler bu yöntemin başarısı için istismar edildi. Bu çalışmada kullanılan gen silah namlusu gerekli kuvveti azaltmak ve biyolistik huni amacıyla değiştirilmişBir daha kısıtlı ve belirli bir alanda 17,19 içine dağılım paterni. Diğer varil modifikasyonlar biolistik yayılmasını kısıtlamak ve çıkış basıncını 28 azaltmaya çalıştık ama Dr O'Brien tarafından tasarlanan bu özel olarak tasarlanmış gen tabancası varil standart Helios Gen tabancası takılan tek bir bileşenidir. Daha sonra, alt-mikrometre altın parçacıkları hücresel hasar ve sonuç olarak, devam eden heterolog gen ifadesinin kaybına yol daha önce belirlenmiş olan mikrometre partiküllerinin invazivliğini azaltmak için kullanılmıştır. Biyolistik prosedüre Bu değişiklikler yöntemi 13 genel fizibilite ve tekrarlanabilirlik geliştirmiştir. Böyle Organotipik beyin dilim hazırlık derinlemesine dilimleme işlemi giderilebilir, beyin korumak için bir DMEM-Agaroz matrisi kullanılarak, ve sayısız diğer yararlı gelişmeler olarak dilim hazırlanması ile ilgili diğer gelişmeler daha önce 13 yetişkin dilim kullanımı keşfetmek için etkin bildirdi olgun geliştirdiksinaptik ağlar.

Çalışmamızda esas transfeksiyon verimliliği üzerinde okuma ve görüntü için bir yeteneği fare beyin dokularında nöronların morfolojik özellikleri gibi hücre morfolojisi görselleştirmek için boyalar ve floresan heterolog genleri kullanılmaktadır. Tanımlanmış bir yarıçap içinde stokastik teslimat gürültü oranı sinyal tamamen yerli bağlamında tek bir hücrenin dendritik limanı izole sağladı. Sayısız çabalar, bu morfolojik özelliklerini incelemek için kullanılan gibi, haritalama 'connectomics' veya çeşitli analizler için tek hücreleri etiketlemek için, bu yöntem kolay gibi elektrofizyoloji ve nörit ölçümleri 29,30 gibi mevcut protokolleri ile kombine edilebilir. Şurası açıktır ki, floresan heterolog genlerin kombinasyonları floresan proteinleri stokastik dağılımı olarak tek hücrelerden oluşan bir çok daha sağlam çizilmesine olanak verebilir ve bunların kombinasyonu, tek tek hücrelerin 31,32 rengini belirleyecek. Bu synapsin ve heterolog genin ekson üst akışında glial fibriler asit proteini olarak hücre özel hızlandırıcıların kullanılması da alt popülasyonlarının 33 için ifadeyi kısıtlayabilir. Gerçekten de, genetik materyalin sonsuz çeşitleri, aynı zamanda, bu aynı prosedür kullanılarak altın nanopartiküllerinin bir bölge seçici bir şekilde teslim edilebilir. Toplam Transfekte bölgeler böylece geleneksel yöntemlerle, örneğin diseksiyon gibi ve heterolog genin lokalize etkisini analiz etmek için batı imünoblotlama bu bölgeyi sunulması ile analiz edilebilir.

Organotipik dilim prosedürlerinde iyileştirmeler de daha geniş, uzun vadeli denemeler için beyin dokularının kullanımının yanı izni gibi diğer dokularda ve cocultures kullanımına izin verecektir ve transfeksiyon prosedürleri kolaylaştıracaktır. Lipid ve polimer transfeksiyon önce 34 ve sık sık te geçiştirilmesi için çok düşük verim göstermek membran homeostazını, içselleştirilmesi, protein geçirgenliğini etkilediği bildirilmiştirrminally nöronlar farklılaşmış. Hücre spesifik yük hedeflendirme interne için gerekli olan hücre yüzey reseptörlerini ifade eden hücrelere de uygundur ve bu yöntem son derece seçici olmasına rağmen, bu nokta seçilerek 35 hedef yoksundur olabilir. Viral vektörler, aksi takdirde, üretmek çoğu zaman zor ve maliyetlidir sıkı düzenlemeler gerektiren ve vesileyle sahip güvenlik kaygıları gösterdi. Biyolistik teslim böylece bölge seçici uygun bir doku içindeki nöronlar ve diğer hücre tiplerinin transfeksiyonu için eşsiz bir yeteneği vardır. Altın gibi non biyolistikler kullanımında toksik başkaca Hastaların böyle bir transdermal ilaç teslimat, invaziv olmayan in vivo gen teslim, hem de viral olmayan gen terapileri lokalize olarak Biyomedikal kullanım için zemin hazırlayabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. John A. O'Brien, geliştirilmiş gen tabancası namlusu için patentlere sahiptir. ABD patent numarası 10/380,452 ve Avrupa patent numarası 01974517.3.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar takviyeli gen ile silah namlusunun üretimi için MRC-lmb atölye teşekkür ederim. Biz de ekipman ve kaynakların kullanımı için Toronto Üniversitesi'nden Dr David R. Hampson teşekkür etmek istiyorum.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Helios gen tabancası sistemiBio Rad165-2431Gen tabancası ve tüp hazırlama istasyonu
HEPES Sigma83264-100ML-F
NaClSigmaS7653-250G
KClSigmaP9333-500G
Na2HPO4SigmaS7907-100G
KH2PO4SigmaP9791-100G
0.2 ve mikro; m steril filtre ünitesiMiliporeSCGPU05REortamı filtrelemek için
DMEMGibco21885-025
Fetal buzağı serumuGibco10270-098
D-GlikozSigmaG8270-100G
N2Yaşam Teknolojileri17502-048
Penisilin / StreptomisinSigmap4333
PolivinilpirolidonSigma856568-100G
Etanol ve nbsp;Sigma277649-100ML
SpermidinSigmaS2626
AgarozBio Rad161-3100EDU
VibroslicerLaicaVT1200Özel tasarım
Gen tabancası montajıU of T'de evde inşa
Nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatörü
Altın nanopartiküllersitodiagnostikG-40-20
pEYFP-N1Clontech
Boru kesiciBio Rad165-2422
Tefzel boruBio Rad165-2441
NamluLMB tarafından özel olarak üretilmiştir
Hücre kültürü ekiMilliporePICM0RG50
ParaformaldehitSigma76240 Kolaylık sağlamak için Fluka
Diseksiyon mikroskobu
Konfokal mikroskopkullanıcı kullanım için tanımlanmış
Cam slaytVWR2588-CA48323-185
Mikro kapak camıVWR2448-CA48366-067-1
Vectashield montaj ortamıVektör laboratuvarlarıH-1400   
kullandık edilmiştir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klein, R. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Biotechnology. 24, 384-386 (1987).
  2. Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacolog., & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
  3. Morin-Brureau, M., De Bock, F., Lerner-Natoli, M. Organotypic brain slices: a model to study the neurovascular unit micro-environment in epilepsies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 11(2013).
  4. Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale Journal of Biology and Medicine. 85, 501-521 (2012).
  5. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45, 117-127 (2004).
  6. Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2013).
  7. Drexler, B., Hentschke, H., Antkowiak, B., Grasshoff, C. Organotypic cultures as tools for testing neuroactive drugs - link between in-vitro and in-vivo experiments. Current Medicinal Chemistry. 17, 4538-4550 (2010).
  8. Oishi, Y., Baratta, J., Robertson, R. T., Steward, O. Assessment of factors regulating axon growth between the cortex and spinal cord in organotypic co-cultures: effects of age and neurotrophic factors. J Neurotrauma. 21, 339-356 (2004).
  9. Baratta, J., Marienhagen, J. W., Ha, D., Yu, J., Robertson, R. T. Cholinergic innervation of cerebral cortex in organotypic slice cultures: sustained basal forebrain and transient striatal cholinergic projections. Neuroscience. 72, 1117-1132 (1996).
  10. Barateiro, A., Domingues, H. S., Fernandes, A., Relvas, J. B., Brites, D. Rat Cerebellar Slice Cultures Exposed to Bilirubin Evidence Reactive Gliosis, Excitotoxicity and Impaired Myelinogenesis that Is Prevented by AMPA and TNF-alpha Inhibitors. Molecular Neurobiology. 49 (1), 424-439 (2013).
  11. Franke, H., Schelhorn, N., Illes, P. Dopaminergic neurons develop axonal projections to their target areas in organotypic co-cultures of the ventral mesencephalon and the striatum/prefrontal cortex. Neurochemistry International. 42, 431-439 (2003).
  12. Mingorance, A., et al. Regulation of Nogo and Nogo receptor during the development of the entorhino-hippocampal pathway and after adult hippocampal lesions. Molecular and Cellular Neurosciences. 26, 34-49 (2004).
  13. Arsenault, J., O'Brien, J. A. Optimized heterologous transfection of viable adult organotypic brain slices using an enhanced gene gun. BMC Research Notes. 6, 544(2013).
  14. De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
  15. Laywell, E. D., et al. Neuron-to-astrocyte transition: phenotypic fluidity and the formation of hybrid asterons in differentiating neurospheres. J Comp Neurol. 493, 321-333 (2005).
  16. Walder, S., Zhang, F., Ferretti, P. Up-regulation of neural stem cell markers suggests the occurrence of dedifferentiation in regenerating spinal cord. Dev Genes Evol. 213, 625-630 (2003).
  17. Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
  18. Brien, J., Unwin, N. Organization of spines on the dendrites of Purkinje cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1575-1580 (2006).
  19. Brien, J. A., Lummis, S. C. Nano-biolistics: a method of biolistic transfection of cells and tissues using a gene gun with novel nanometer-sized projectiles. BMC Biotechnology. 11 (66), 1472-6750 (2011).
  20. Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistic labeling of neuronal cultures and intact tissue using a hand-held gene gun. Nature Protocols. 1, 1517-1521 (2006).
  21. Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends in Biotechnology. 25, 530-534 (2007).
  22. Han, X., et al. Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity. Toxicology. 287, 99-104 (2011).
  23. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  24. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. Journal of Visualized Experiments. 12, (2008).
  25. Su, T., Paradiso, B., Long, Y. S., Liao, W. P., Simonato, M. Evaluation of cell damage in organotypic hippocampal slice culture from adult mouse: a potential model system to study neuroprotection. Brain Research. 1385, 68-76 (2011).
  26. Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies. PloS One. 7, 45017(2012).
  27. Ito, T., Ibe, K., Uchino, T., Ohshima, H., Otsuka, M. Preparation of DNA/Gold Nanoparticle Encapsulated in Calcium Phosphate. Journal of Drug Delivery. 2011, 647631(2011).
  28. Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Appl Phys Lett. 87, 014103(2005).
  29. Meijering, E. Neuron tracing in perspective. Cytometry. Part A : the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 693-704 (2010).
  30. Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Targeted axon-attached recording with fluorescent patch-clamp pipettes in brain slices. Nature Protocols. 7, 1228-1234 (2012).
  31. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  32. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  33. Gholizadeh, S., Tharmalingam, S., Macaldaz, M. E., Hampson, D. R. Transduction of the central nervous system after intracerebroventricular injection of adeno-associated viral vectors in neonatal and juvenile mice. Human Gene Therapy Methods. 24, 205-213 (2013).
  34. Arsenault, J., et al. Botulinum protease-cleaved SNARE fragments induce cytotoxicity in neuroblastoma cells. Journal of Neurochemistry. 129, 781-791 (2014).
  35. Arsenault, J., et al. Stapling of the botulinum type A protease to growth factors and neuropeptides allows selective targeting of neuroendocrine cells. Journal of Neurochemistry. 126, 223-233 (2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Biyolistik TransfeksiyonGen Tabancas ModifikasyonuDNA Kapl Alt n Partik llerRejiyoselektif HedeflemeKonfokal MikroskopiDoku DilimlemeH cre K lt r nsetleriFloresan Protein EtiketlemeHeterolog Gen Ekspresyonu

İlgili makaleler